滇池水華束絲藻(Aphanizomenon flos-aquae)對低氮的生理響應*

吳艷龍，鄭凌凌，李 林，殷大聰，代龔圓，宋立榮

(1：中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室，武漢 430072) (2：中國科學院大學，北京 100049) (3：長江水利委員會長江科學院，武漢 430010)

藍藻水華是世界范圍內的熱點研究問題，已報道的有幾十個屬的上百種藍藻可以形成水華[1].出現最廣泛、最常見的水華藍藻為微囊藻屬(Microcystis)，因此微囊藻水華已經被廣泛關注和深入研究[2].水華束絲藻(Aphanizomenonflos-aquae)也是一種水體中較常見的水華藍藻種類，在世界各種類型的湖泊、水庫、池塘等水域均有發(fā)生[3-6].水華束絲藻屬于藍藻門念珠藻科束絲藻屬，是我國最早發(fā)現的束絲藻屬種類，束絲藻水華在我國各地均有報道，并逐漸引起人們的廣泛關注.

1982年12月至1983年1月以及4月，東湖浮游植物水華經鑒定為水華束絲藻水華[7].杭州西湖1981年發(fā)生水華束絲藻水華，生物量高達67.73×107cells/L，占浮游植物總量的98%，出現西湖歷史上罕見的“黑水”[8].貴陽地區(qū)最大的人工湖泊紅楓湖水庫1998年3月-4月上旬出現罕見的大面積水華束絲藻水華最為典型，其間南湖水域表層0.5m左右形成藻漿[9].2002年起，湖北省通山縣縣城附近的一座小型水庫——四斗朱水庫連續(xù)幾年在早春即開始發(fā)生嚴重束絲藻水華，富藻層厚度達4m，水華的唯一優(yōu)勢種為水華束絲藻[10].云南高原湖泊滇池2001-2009年調查研究發(fā)現，水華束絲藻與微囊藻屬隨季節(jié)演替，成為滇池藍藻水華的兩大優(yōu)勢種群[11-12].

影響水華束絲藻發(fā)生水華的因素很多，如外部營養(yǎng)物質的輸入、周邊的生態(tài)環(huán)境、浮游動物種群、具漂浮能力的氣囊、固氮異形胞、能夠形成孢子、廣泛的水溫適應性等[4，6，13-15].浮游植物異形胞固氮對固氮藍藻水華有重要影響，水體中磷營養(yǎng)充足、氮成為限制因子將導致固氮藍藻水華的發(fā)生[16-20].湖泊、水庫、池塘等生態(tài)系統(tǒng)中，可利用的氮濃度一般處于較低濃度水平，低氮甚至缺氮對水華束絲藻的生長及對氮的利用能力較少報道.了解水華束絲藻在低濃度氮以及無氮條件下的生長特征、異形胞發(fā)生格局以及固氮特征，對藍藻水華的發(fā)生機制以及控制可以提供理論和技術指導.本實驗以滇池水華束絲藻為研究對象，旨在通過研究滇池水華束絲藻在低濃度硝態(tài)氮條件下的生長特征，無氮條件下異形胞的形成過程及固氮能力，以期初步揭示在野外較低的氮濃度條件下，滇池水體中水華束絲藻生長過程中氮的生物學和生態(tài)學作用，了解氮在富營養(yǎng)化湖泊滇池水華束絲藻-微囊藻演替過程中的影響，為了解類似水體中固氮和非固氮藍藻的演替提供新的認識.

1 材料與方法

1.1 藻種分離

樣品采自滇池北部海埂灣，其中水華束絲藻Aph1于2010年4月分離，Aph9于2011年3月分離.采樣時，用1L有機玻璃采水器采集約30ml表層水，放于50ml樣品瓶中，立即帶回實驗室進行純種分離.藻種分離時，取少量新鮮湖水，置于滅菌載玻片上，在Olympus CX31型光學顯微鏡下用滅菌的巴斯德毛細管吸取單根藻絲，用無菌水清洗5次，再用無菌CT培養(yǎng)基[21]清洗3次后置于添加CT培養(yǎng)基的12孔真空包裝細胞培養(yǎng)板內.培養(yǎng)條件為：溫度20±1℃、光暗比12h∶12h、光強20μE/(m2·s).分離的培養(yǎng)物在1個月左右生長成簇后，取少量培養(yǎng)物鏡檢是否為水華束絲藻，水華束絲藻藻株轉接到含150ml CT培養(yǎng)基的三角瓶擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上.兩株藻種經中國科學院淡水藻種庫進一步鑒定為水華束絲藻.藻種采集地(24°56′43″N，102°38′55″E)周圍的理化參數為：水溫15.1±0.36℃、pH 8.92±0.42、溶解氧7.65±0.14mg/L、透明度28.5±2.0cm、葉綠素a濃度 121.2±39.6μg/L、溶解性反應磷濃度0.027±0.009mg/L、總溶解磷濃度0.037±0.010mg/L、總磷濃度0.332±0.056mg/L、總溶解氮濃度2.933±0.178mg/L、總氮濃度4.360±1.594mg/L.

1.2 藻細胞培養(yǎng)與計數

分離的水華束絲藻培養(yǎng)到一定生物量后轉接至CT培養(yǎng)基，以對數生長期的水華束絲藻作為實驗材料.水華束絲藻藻絲接種前用無氮培養(yǎng)基清洗3次，不進行氮饑餓處理直接作為材料接種于不同濃度的硝態(tài)氮培養(yǎng)基中，實驗培養(yǎng)條件為：BG-11培養(yǎng)基[22]、溫度20±1℃、光暗比為12h∶12h、光強30μE/(m2·s).每天手動搖動藻種兩次并更換藻種在培養(yǎng)箱的位置.接種后，每隔兩天取樣一次，取樣時間為9：00-11：00，在島津1800分光光度計上于680nm處測定吸光度.藻絲以及異形胞數目在Olympus CX31型光學顯微鏡下直接用浮游植物計數框計數.整個實驗過程中，分離和培養(yǎng)的水華束絲藻一直處于漂浮狀態(tài).

1.3 理化參數的測定

水體pH、溶解氧及水溫的數據均在取樣時使用YSI 550A(YSI， USA)現場測定，透明度通過塞氏盤測定，營養(yǎng)鹽的測定采用文獻[23]的方法.無氮培養(yǎng)基中水華束絲藻固定的氮以測定的總氮表示，其方法同上，所有玻璃器皿使用前于鹽酸(1+9)中浸泡48h，然后用無氨水洗凈.

1.4 統(tǒng)計學方法

數據繪圖在Origin 8.0軟件中完成，用SPSS 18.0進行One-way ANOVA 分析，P<0.05為顯著相關.

2 結果

2.1 不同硝態(tài)氮濃度下水華束絲藻的生長特征

兩株水華束絲藻Aph1和Aph9分別接種于添加不同濃度(0、0.5、2、5、10、20mg/L，對照組BG-11含硝態(tài)氮約274mg/L)硝態(tài)氮的BG-110(不含硝態(tài)氮)培養(yǎng)基中. 結果表明(圖1)：隨著培養(yǎng)時間的增加，水華束絲藻在各濃度硝態(tài)氮培養(yǎng)基中的生物量均逐漸增加. 兩株水華束絲藻對不同濃度硝態(tài)氮的響應比較一致，即隨著硝態(tài)氮濃度的升高，水華束絲藻的生長速率逐漸增加. 水華束絲藻在硝態(tài)氮濃度越高的培養(yǎng)基中，其達到穩(wěn)定期的時間也越短. 水華束絲藻Aph1在生長約40d后達到穩(wěn)定，680nm處的吸光度為1.354，但是其在硝態(tài)氮濃度為20、10、5和2mg/L培養(yǎng)基中的生物量在45 d已經接近BG-11培養(yǎng)基中的生物量水平(P>0.05)，0.5mg/L硝態(tài)氮中水華束絲藻生物量雖然與對照組差異比較顯著(P<0.05)，但其生物量也較高，并保持上升的趨勢.無氮培養(yǎng)基中，水華束絲藻生長受到一定的抑制，生長相對比較緩慢，但是實驗后期生物量也比較高，吸光度接近0.9.相比Aph1，Aph9生長潛力更大，即使培養(yǎng)45d其生物量仍然處于增長的趨勢，在不同濃度的硝態(tài)氮培養(yǎng)基中，生物量均很高，僅無氮培養(yǎng)基中處理組的生物量與對照組存在顯著差異(P<0.05).

圖1 不同硝態(tài)氮濃度對滇池水華束絲藻生長的影響Fig.1 The effects of different nitrate-nitrogen concentrations on the growth of A.flos-aquae isolated from Lake Dianchi

圖2 無氮誘導藻絲異形胞分化特征Fig.2 Heterocyst characteristics of A. flos-aquae induced in N-free status

2.2 無氮誘導異形胞的分化

圖3 Aph9不同時期異形胞以及異形胞熒光特征Fig.3 Lightmicroscope ofheterocyst formation at different stages and autofluorescence of A. flos-aquae strain Aph9

圖4 兩株水華束絲藻固氮特征Fig.4 Nitrogen fixation characteristics of the two strains of A. flos-aquae

固氮藍藻能夠在缺氮環(huán)境下形成異形胞，固定大氣中的氮氣以適應氮脅迫.對分離的兩株水華束絲藻進行無氮培養(yǎng)，誘導其異形胞的分化，發(fā)現水華束絲藻能夠迅速分化形成異形胞，Aph9經過誘導后，第3d含有異形胞的藻絲即達到50%以上，第7d高達72%，之后維持較高的比例持續(xù)波動.Aph1誘導形成異形胞的總體趨勢與Aph9非常相似，其形成異形胞的比例也很高，達50%以上.對照組BG-11培養(yǎng)基中初始時期含少量異形胞，可能是初期階段收集藻絲過程中經歷短暫的缺氮過程誘導所致，培養(yǎng)10d以后對照組完全沒有異形胞形成(圖2).

由圖3可見，水華束絲藻細胞能感受氮脅迫狀態(tài)，缺氮能快速誘導形成異形胞.Aph9接種初期即觀察到有部分藻絲形成異形胞，隨著培養(yǎng)時間延長，異形胞的比例開始增加，培養(yǎng)后期也有大量的藻絲含有異形胞(圖3A～D)，但是，對照組BG-11培養(yǎng)的水華束絲藻幾乎完全不含異形胞(圖3E).Aph9藻絲上形成的異形胞具有明顯不同的自發(fā)熒光特征，異形胞紅色熒光比營養(yǎng)細胞弱，并且在與營養(yǎng)細胞結合的部分無熒光(圖3F).

2.3 水華束絲藻的固氮作用

Aph1、Aph9接種于無氮培養(yǎng)基，測得不同培養(yǎng)時間培養(yǎng)基中的總氮，后期測得的總氮去除初始條件接種時期的氮即為水華束絲藻因固氮作用增加的氮.實驗結果顯示(圖4)：兩株水華束絲藻培養(yǎng)基中氮含量增加趨勢比較一致.在開始的1周內培養(yǎng)基中氮含量未見增加，從第7d開始穩(wěn)步增加.隨著培養(yǎng)時間的增加，培養(yǎng)基中因水華束絲藻固氮作用增強，總氮逐步增加.到實驗后期，培養(yǎng)基中增加的總氮含量超過25mg/L.

3 討論

氮是浮游植物生長所需的大量必需元素之一，它存在于所有組成蛋白質的氨基酸中，同時也是合成藻藍蛋白、葉綠素a以及DNA等核酸的基本元素.藻類在氮饑餓脅迫條件下，藻藍蛋白做為氮庫降解，葉綠素a含量下降，光合作用降低，細胞代謝速率減緩[24]，藻類最后可能死亡或者以類似休眠體或孢子的形式長期生存[25-26].藍藻中具有明顯固氮能力的種類，已作過研究或測定過固氮能力的約有160余種和變種，其中絕大多數屬于念珠藻目中的種類，如念珠藻、魚腥藻、束絲藻、單岐藻、眉藻等.固氮藍藻在有氮的情況下不形成異形胞，只有當培養(yǎng)環(huán)境中缺乏可利用的氮源時，才開始分化異形胞.當細胞中缺乏可用的NH3時，導致α-酮戊二酸的大量積累，細胞內自由Ca2+濃度的升高，它們是氮饑餓程度的重要信號，誘導異形胞的分化.異形胞利用N2合成NH3，NH3通過谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶循環(huán)形成谷氨酰胺和谷氨酸，被轉運到營養(yǎng)細胞中[27-29]，供細胞生長和分化的需要.

滇池分離的水華束絲藻不經氮饑餓處理直接接種于無氮BG-11培養(yǎng)基，能夠誘導藻絲體異形胞的分化，含有異形胞的藻絲比例在第3d即可達到50%以上，表明水華束絲藻能快速應對缺氮脅迫.水華束絲藻在無氮培養(yǎng)基中生長的初期會受到一定程度的抑制，生長速率相比BG-11對照組低，但在后期生長差異減小，當添加的氮濃度達到0.5mg/L以上時，其生物量與BG-11對照組無顯著差異.以上結果表明：在富營養(yǎng)化水體中可供利用的氮濃度高于0.5mg/L時，水華束絲藻等固氮藍藻的生長可能不受氮營養(yǎng)的限制.氮在春季通常被認為是浮游植物生長的限制因子[30]，滇池束絲藻水華在春季發(fā)生，除了水華束絲藻對低溫有較強的適應性外，固氮作用可能在滇池水華束絲藻水華的發(fā)生過程中起到很重要的作用.

Schindler等基于實驗湖沼學研究提出了富營養(yǎng)化治理控磷是關鍵的觀點[31-34]，但是單一的控磷措施在很多湖泊中很可能失敗，這些水體中磷在底泥和水體之間循環(huán)的速度很快，氮元素對藍藻水華起著重要作用，如：阿波普卡湖、奧基喬比湖、太湖、東湖以及霞浦湖[30].營養(yǎng)鹽添加實驗表明，太湖冬、春季出現磷限制，夏、秋季出現氮限制，微囊藻水華維持需要的氮來源于新增加的氮以及先前的氮源[35].水華束絲藻即便在無氮培養(yǎng)基中生長，通過固氮作用增加的氮可達30mg/L，在水華束絲藻水華消退的過程中，釋放的大量的氮可能成為其它非固氮藍藻水華的誘發(fā)因子.

滇池存在水華束絲藻-微囊藻的演替，結合野外條件下氮濃度的數據分析和水華束絲藻異形胞的形成特征，將可望揭示氮在滇池水華束絲藻-微囊藻演替過程中的作用，這將有助于闡明兩種藍藻演替中營養(yǎng)鹽的驅動機制.國內諸多水體經常出現固氮藍藻與非固氮藍藻演替或者共同存在的現象，如洱海存在微囊藻、束絲藻和魚腥藻；巢湖存在微囊藻與魚腥藻之間的演替；太湖以微囊藻為主，但是同時也有束絲藻、魚腥藻等固氮藍藻存在.水體中的氮處于頻繁動態(tài)變化中，進一步認識固氮藍藻對氮的利用方式和機制將有助于揭示其水華的發(fā)生機制，并對固氮藍藻與非固氮藍藻的競爭及演替提供新認識.

[1] 余博識，吳忠興，朱夢靈等.水果湖灣藍藻水華的形成及其對東湖影響的評價.水生生物學報，2008，32(2)：286-289.

[2] 吳忠興，虞功亮，施軍瓊等.我國淡水水華藍藻——束絲藻屬新記錄種.水生生物學報，2009，33(6)：1140-1144.

[3] Carmichael WW， Drapeau C， Anderson DM. Harvesting ofAphanizomenonflos-aquaeRalfs ex Born.& Flah.var.flos-aquae(Cyanobacteria) from Klamath Lake forhuman dietary use.JournalofAppliedPhycology， 2000，12： 585-595.

[4] Tsujimura S， Ishikawa K， Tsukada H. Effect of temperature on growth of the cyanobacteriumAphanizomenonflos-aquaein Lake Biwa and Lake Yogo.PhycologicalResearch， 2001，49(4)： 275-280.

[5] Rücker J， Stükenb A， Nixdorfa Betal. Concentrations of particulate and dissolved cylindrospermopsin in 21Aphanizomenon-dominated temperate lakes.Toxicon， 2007，50：800-809.

[6] üveges V， Tapolczai K， Krienitz Letal. Photosynthetic characteristics and physiological plasticity of anAphanizomenonflos-aquae(Cyanobacteria，Nostocaceae) winter bloom in a deep oligo-mesotrophic lake (Lake Stechlin， Germany).Hydrobiologia， 2012，698(1)： 263-272.

[7] 林婉蓮，劉鑫洲.武漢東湖浮游植物各種成份分析與沉淀物中浮游植物活體碳、氮、磷的測定.水生生物學報，1985，9(4)：359-364.

[8] 吳 潔，虞左明.西湖浮游植物的演替及富營養(yǎng)化治理措施的生態(tài)效應.中國環(huán)境科學，2001，21(6)：540-544.

[9] 陳作州，陳 椽，晏 妮等.紅楓湖水庫浮游植物演變(1980-2006年)和富營養(yǎng)化趨勢研究.貴州師范大學學報，2007，25(3)：5-10.

[10] 李敦海，劉景元，邢 偉等.四斗朱水庫藍藻水華爆發(fā)成因分析及治理對策研究.環(huán)境科學與管理，2010，35(2)：43-46.

[11] Liu YM， Chen W， Li DHetal. First report of aphantoxins in China-water blooms of toxigenicAphanizomenonflos-aquaein Lake Dianchi.EcotoxicologyandEnvironmentalSafety， 2006，65：84-92.

[12] 張 梅，李 原，王若南.滇池浮游植物的生物多樣性調查研究.云南大學學報，2005，27(2)：172-176.

[13] Yamamoto Y， Nakahara H. The formation and degradation of cyanobacteriumAphanizomenonflos-aquaeblooms： the importance of pH， water temperature， and day length.Limnology，2005，6：1-6.

[14] Suikkanen S， Kaartokallio H， H?llfors Setal. Life cycle strategies of bloom-forming filamentous cyanobacteria in the Baltic Sea.DeepSeaResearchPartⅡ：TopicalStudiesinOceanography， 2010，57(3/4)：199-209.

[15] Yamamoto Y， Nakahara H. Life cycle of cyanobacteriumAphanizomenonflos-aquae.Taiwania， 2009，54(2)： 113-117.

[16] Vahtera E， Conley DJ， Gustafsson BGetal. Internal ecosystem feedbacks enhance nitrogen-fixing cyanobacteria blooms and complicatemanagement in the Baltic Sea.AMBIO， 2007，36(2)： 186-194.

[17] Conley DJ， Paerl HW， Howarth RWetal. Controlling eutrophication： nitrogen and phosphorus.Science， 2009，323：1014-1015.

[18] Oliver RL， Ganf GG. Freshwater blooms-The ecology of cyanobacteria. Netherlands： Kluwer Academic Publishers， 2000：149-194.

[19] Wood SA， Prentice MJ， Smith Ketal. Low dissolved inorganic nitrogen and increasedheterocyte frequency： precursors toAnabaenaplanktonica blooms in a temperate， eutrophic reservoir.JournalofPlanktonResearch， 2010，32： 1315-1325.

[20] Carey CC， Ibelings BW， Hoffmann EPetal. Eco-physiological adaptations that favour freshwater cyanobacteria in a changing climate.WaterResearch， 2012，36(5)：1394-1407.

[21] Watanabe MM， Ichimura T. Fresh-and salt-water forms ofSpirulinaplatensisin axenic cultures.BullJpnSocPhycol， 1977，25： 371-377.

[22] Stanier RY， Kunisawa R， Mandel Metal. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales).BacteriologicalReviews， 1971，35(2)： 171.

[23] 國家環(huán)境保護局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法：第4版.北京：中國環(huán)境科學出版社，2002.

[24] Sauer J， Schreiber U， Schmid Retal. Nitrogen starvation-induced chlorosis inSynechococcusPCC 7942. Low-level photosynthesis as amechanism of long-term survival.PlantPhysiol， 2001，126(1)： 233-243.

[25] Brussaard CPD， Noordeloos AAM， Riegman R. Autolysis kinetics of themarine diatomDitylumbrightwellii(Bacillariophyceae) under nitrogen and phosphorus limitation and starvation.JournalofPhycology， 1997，33(6)： 980-987.

[26] Peters E， Thomas DN. Prolonged nitrate exhaustion and diatommortality： a comparison of polar and temperateThalassiosiraspecies.JournalofPlanktonResearch， 1996，18(6)： 953-968.

[27] Li RH， Watanabe M， Watanabe MM. Akinete formation in planktonicAnabaenaspp.(Cyanobacteria) by treatment with low temperature.JournalofPhycology， 1997，33(4)： 576-584.

[28] Muro-Pastor MI， Reyes JC， Florencio FJ. Ammonium assimilation in cyanobacteria.PhotosynthesisResearch， 2005，83： 135-150.

[29] Adams DG. Heterocyst formation in cyanobacteria.CurrentOpinioninMicrobiology， 2000，3： 618-624.

[30] Conley DJ， Paerl HW， Howarth RWetal. Controlling eutrophication： nitrogen and phosphorus.Science， 2009，323(5917)： 1014-1015.

[31] Wang HJ， Wang HZ. Mitigation of lake eutrophication： Loosen nitrogen control and focus on phosphorus abatement.ProgressinNaturalScience， 2009，19： 1445-1451.

[32] Carpenter SR. Phosphorus control is critical tomitigating eutrophication.PNAS， 2008，105(32)： 11039-11040.

[33] Schindler DW， Hecky RE， Findlay DLetal. Eutrophication of lakes cannot be controlled by reducing nitrogen input： results of a 37-year whole-ecosystem experiment.PNAS， 2008，105(32)： 11254-11258.

[34] Havens KE， Fukushima T， Xie Petal. Nutrient dynamics and the eutrophication of shallow lakes Kasumigaura (Japan)， Donghu (PR China)， and Okeechobee (USA).EnvironmentalPollution， 2001，111(2)： 263-272.

[35] Paerl HW， Xu H， McCarthy MJetal. Controllingharmful cyanobacterial blooms in ahyper-eutrophic lake (Lake Taihu， China)： The need for a dual nutrient (N & P)management strategy.WaterResearch， 2011，45(5)： 1973-1983.