片仔癀對局灶性腦梗死大鼠腫瘤壞死因子-α、細胞間黏附分子-1及血管細胞黏附分子-1含量的影響※

劉麗星 朱陵群 黃希艷 李 倩 鄒憶懷

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學教育部重點實驗室和北京市重點實驗室，北京 100700)

片仔癀對局灶性腦梗死大鼠腫瘤壞死因子-α、細胞間黏附分子-1及血管細胞黏附分子-1含量的影響※

劉麗星 朱陵群△黃希艷 李 倩 鄒憶懷1

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學教育部重點實驗室和北京市重點實驗室，北京 100700)

目的觀察片仔癀對局灶性腦梗死大鼠炎性損傷相關(guān)因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)及血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)含量的影響。方法將74只SD標準性大鼠隨機分成7組，即假手術(shù)組10只，按照改良的EZ Longa法制備大腦中動脈栓塞大鼠模型64只，將手術(shù)后符合評分標準的大鼠分為模型組10只，片仔癀大劑量組10只、中劑量組12只、小劑量組10只，腦得生組和尼莫地平組各10只。造模前給藥3d，造模后給藥4d，處死取材，參照酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測ICAM-1、VCAM-1及TNF-α的含量。結(jié)果模型組血清ICAM-1、VCAM-1及TNF-α含量較假手術(shù)組升高(P<0.01)；各給藥組較模型組均有不同程度的降低，其中片仔癀大劑量組、腦得生組及尼莫地平組血清ICAM-1、VCAM-1、TNF-α含量較模型組降低(P<0.01)。結(jié)論片仔癀膠囊可以降低局灶性腦梗死后大鼠ICAM-1、VCAM-1及TNF-α的含量，對于神經(jīng)功能具有保護作用。

疾病模型，動物；腦梗死；中藥療法；；腫瘤壞死因子α；胞間黏附分子1；血管細胞黏附分子1

急性缺血性腦梗死后炎癥反應(yīng)引發(fā)繼發(fā)性損傷，研究表明，缺血性腦梗死后數(shù)小時腫瘤壞死因子-α(TNF-α)分泌增加，持續(xù)維持在高水平，從而介導白細胞及大腦血管內(nèi)皮細胞的激活，炎癥相關(guān)黏附分子細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)的含量亦有明顯升高，炎癥反應(yīng)有可能會增加梗死區(qū)的面積[1-2]。因此，抑制缺血性腦梗死后引發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)具有重要意義。建立大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型，觀察缺血性腦梗死后大鼠炎性損傷相關(guān)因子TNF-α及黏附分子ICAM-1、VCAM-1含量變化以及中藥片仔癀對炎癥相關(guān)因子及黏附分子含量的影響，探討中藥片仔癀在腦梗死后抑制腦細胞損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與實驗藥品 SD雄性大鼠74只，體質(zhì)量(260±20)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2006-0009。片仔癀膠囊(主要成分為三七、麝香、牛黃、蛇膽，漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，國藥準字09HA05，批號：0711050)；尼莫地平片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國藥準字H20003010，批號BJ00604，30mg/片)；腦得生(廣東國醫(yī)堂制藥股份有限公司，國藥準字Z35020243，批號110101)；尼龍栓線：型號2636，購自北京沙東生物技術(shù)有限公司；Rat TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、Rat VCAM-1 ELISA、Rat ICAM-1 ELISA試劑盒均購自尚柏生物醫(yī)學技術(shù)(北京)有限公司，貨號RB 3R080、3R310s、3R110。

1.2 MCAO模型制備與分組 參照EZ Longa方法[3]，建立大鼠MCAO模型。術(shù)前12h禁食，腹腔注射麻醉(3.5%水合氯醛，10mL/kg)。從大鼠頸部正中切開皮膚，游離出頸總動脈、頸內(nèi)動脈和外頸動脈，用無菌的手術(shù)線分別結(jié)扎頸外動脈近分叉處和頸總動脈近心端，用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，頸總動脈剪小口，將尼龍線栓插入頸內(nèi)動脈中，遇阻力即停止，大約20mm，固定栓線，松開動脈夾和縫合皮膚。假手術(shù)組只進行頸部正中縱行剖開后縫合。大鼠清醒2h后，采用Longa EZ方法[1]進行評分：0分為神經(jīng)功能正常；1 分為大鼠栓塞對側(cè)前爪伸展不充分；2分為行走時向外側(cè)打轉(zhuǎn)；3分為行走時向?qū)?cè)傾倒；4分為無法行走、意識喪失。將得分為1～3分的大鼠入組。將符合納入標準的大鼠分為模型組、片仔癀小劑量組[0.0054g/(100g·d)]、片仔癀中劑量組[0.0162g/(100g·d)]、片仔癀大劑量組(0.048 6g/100g·d)、腦得生組[0.048 6g/(100g·d)]及尼莫地平組[0.001 08 g/(100g·d)]。造模前連續(xù)給藥3d，第4d行MCAO手術(shù)，術(shù)后給藥4d，于第7 d取材。給予模型組及假手術(shù)組等容積的0.9%氯化鈉注射液。

1.3 取材及樣品制備 于MCAO術(shù)后第4d取材，腹腔注射水合氯醛(3.5%)麻醉后，由腹主動脈采血，3000r/min低溫離心10min后采集血清，取上清液分裝于EP管中，-80℃冰箱凍存。采血后各組大鼠常規(guī)取腦組織，用4%多聚甲醛固定液固定24h，常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋后進行石蠟切片，厚度為5μm。

1.4 病理學觀察 常規(guī)伊紅-蘇木素(HE)染色：石蠟切片于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各15min，下行梯度酒精各5min，自來水洗20s，Harries蘇木精1 min，自來水洗20s，鹽酸酒精10s，自來水洗返藍10s，伊紅染色10min，自來水洗20s，85%酒精、95%酒精、100% 酒精各5s，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ透明各10min；用中性樹膠封片后并于顯微鏡下觀察。

1.5 ELISA法檢測 將試劑盒放至室溫，準備放映版，每孔中加入100μL標準品、100μL樣本。加入50μL Anti-rat TNF-α Biotin或Anti-rat VCAM-1或Anti-rat ICAM-1 Biotin 輕輕混勻30s，封住板孔，室溫溫育3h。反復洗板3次。每孔加入100μL 1×HRP。輕輕混勻30s，封住板孔于室溫放置30min。反復洗板3次。每孔各加入100μL TMB顯色液后混勻10s，于暗處室溫放置15min。每孔均加入100μL終止液混勻30s，在450nm處讀吸光度值。橫坐標為標準品濃度，縱坐標為吸光度值，繪制出標準曲線，以各孔的吸光度值計算出各樣品的含量。

1.6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用SPSS 18.0軟件，組間兩兩進行比較，獨立t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 病理學改變 模型組可見較大范圍的壞死區(qū)，明顯的軟化灶，大小不等的空泡可見于壞死區(qū)，殘存的神經(jīng)細胞散在分布，部分神經(jīng)細胞可見核固縮、深染、未見核仁，部分神經(jīng)細胞可見核溶解、胞漿疏松，細胞界限模糊，水腫明顯，嗜中性細胞見于壞死周邊區(qū)；假手術(shù)組組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；片仔癀大、中劑量組的壞死區(qū)較模型組明顯減小，其周圍的神經(jīng)細胞水腫較模型組明顯減輕，胞漿和胞核尚清楚，部分大鼠的神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)接近假手術(shù)組；尼莫地平組及腦得生組的壞死區(qū)明顯減小，一些小空泡不規(guī)則的仍可見于壞死區(qū)，其周圍的部分神經(jīng)細胞胞漿混濁，但胞核和核仁尚清楚，部分神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)接近正常。

2.2 各組TNF-α、ICAM-1及VCAM-1含量比較 見表1。

組 別n劑量[g/(100g·d)]TNF-α含量ICAM-1含量VCAM-1含量假手術(shù)組10-6．559±1．8870．3828±0．0758143．8718±26．3506模型組10-17．283±3．078△1．1390±0．0949△427．7274±88．9551?片仔癀小劑量組120．005411．796±3．621?0．5200±0．0918??235．0784±57．4947??△片仔癀中劑量組120．016210．134±3．301?0．5814±0．9935??240．7234±55．8639??△片仔癀大劑量組100．04869．957±1．157??0．5896±0．0814??244．7444±71．7801??△腦得生組100．04869．517±1．248??0．6928±0．1192??319．0040±96．4820??△尼莫地平組100．01088．272±1．733??0．7023±0．1371??322．8596±70．7252??△

與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組比較，△P<0.01

由表1可見，模型組TNF-α含量較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)，片仔癀各劑量組、腦得生組及尼莫地平組TNF-α含量較模型組顯著降低 (P<0.01)。各組MCAO大鼠血清中ICAM-1的含量，與假手術(shù)組比較，模型組顯著增加(P<0.01)。片仔癀各劑量組、腦得生組及尼莫地平組ICAM-1含量較模型組顯著降低(P<0.01)。片仔癀各組之間ICAM-1的含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組MCAO大鼠血清中VCAM-1的含量，與假手術(shù)組比較血清中VCAM-1含量均顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，片仔癀各劑量組、腦得生組及尼莫地平組VCAM-1的含量較模型組顯著降低(P<0.01)，片仔癀各組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

腦缺血缺氧后，引起能量代謝的異常，從而使神經(jīng)細胞細胞膜電勢發(fā)生變化，引發(fā)離子交換異常，細胞內(nèi)Ca2+大量涌入，促進神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸和(或)TNF-α，從而引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，在引起腦損害的病理過程中以及繼發(fā)性損傷中發(fā)揮了極其重要的作用[4]。腦缺血—再灌注后，TNF-α在損傷區(qū)域大量表達，呂建衛(wèi)等[2]研究顯示，腦梗死組患者TNF-α含量顯著高于對照組，TNF-α的含量可能影響缺血灶的面積以及神經(jīng)功能缺損程度。亦有實驗研究表明，大鼠轉(zhuǎn)TNF-α基因，使腦組織TNF-α的過度表達，使缺血性腦損傷明顯加重[5]。

ICAM-1(CD54)在正常情況下很少表達，但在出現(xiàn)炎癥損傷時可出現(xiàn)成倍的高表達[6]。ICAM-1可以與其配體淋巴細胞功能相關(guān)抗原(LFA-1)和巨噬細胞分化抗原-1(Mac-1)相結(jié)合發(fā)揮生物學效應(yīng)[7]。ICAM-1可使白細胞流動變緩，使其與血管內(nèi)皮細胞的黏附力增強，炎癥細胞停留在浸潤部位的時間延長等介導并增強炎癥反應(yīng)。VCAM-1(CD106)與整合素家族的極遲抗原-4(very late antigen-4，CD49d/CD29，α4β1)相結(jié)合發(fā)揮作用。VCAM-1主要表達于血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等部位，介導白細胞和血管內(nèi)皮細胞的黏附、游走、滲出，并使該2種細胞停留于損傷區(qū)[8]。觀察結(jié)果顯示，模型組TNF-α、ICAM-1及VCAM-1的含量較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，提示TNF-α、ICAM-1及VCAM-1參與了腦梗死后神經(jīng)病理損傷，給予片仔癀后可不同程度的下調(diào)TNF-α、ICAM-1及VCAM-1的含量(P<0.05)，提示其能減輕腦梗死后的炎癥病理過程，從而對于神經(jīng)功能具有保護作用。

局灶性腦梗死屬中醫(yī)學中風范疇。王永炎院士將中風的主要病機概括為“毒損腦絡(luò)” 學說，即“臟腑功能虧虛，氣血逆亂，邪盛毒成，毒損腦絡(luò)”[9]。從而對中風發(fā)病機制有了更為全面的認識。片仔癀的中藥成分主要有牛黃、三七、蛇膽、天然麝香等，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛作用[10]，已廣泛應(yīng)用于急性、慢性肝炎，骨折和燒、燙等多種創(chuàng)傷，膿腫、無名腫毒及一切炎癥引起的疼痛、發(fā)熱等，均有較好的臨床療效，但在有關(guān)缺血性腦血管疾病方面的研究鮮有報道。本實驗研究顯示片仔癀使TNF-α、ICAM-1及VCAM-1的含量下降，提示片仔癀在抑制腦梗死后梗死區(qū)及周圍的炎癥反應(yīng)方面的有效性，但有關(guān)其具體的作用機制尚需進一步探索。

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(本文編輯：董軍杰)

EffectofPienTzeHuanontheamountofTNF-α,ICAM-1andVCAM-1offocalcerebralinfarctionrats

LIULixing,ZHULingqun,HUANGXiyan,etal.

KeyLaboratoryofChineseInternalMedicineofMinistryofEducationandBeijing，DongzhimengHospital，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100700

ObjectiveTo observe the effect of Pien Tze Huan on the serum amount of TNF-α, ICAM-1 and VCAM-1 after MCAO operation.MethodsMiddle cerebral artery occlusion (MCAO) rat model was established by improved EZ Longa method. 74healthy mature male SD rats were randomly divided into model group, sham operation group, small-dose, mid-dose, high-dose Pien Tze Huan group, positive control group 1 (nimodipine group) and positive control group 2( Naodesheng group). Rats were pretreated for 3days before modeling and administered for 4days after modeling, then were sacrificed. The amount changes of ICAM-1, VCAM-1and TNF-α were observed by methods of ELISA.ResultsThe amount of ICAM-1, VCAM-1 and TNF-αin the model group increased obviously after the MCAO operation compared with that in sham operation group (P<0. 01). The expression in each treatment group was lower than that in the model group (P<0. 05orP<0. 01).ConclusionPien Tze Huan can decrease the serum amount of ICAM-1, VCAM-1 and TNF-α so as to protect the nerve function.

Disease models; Animal; Cerebral infarction; Traditional Chinese medicine therapy; tumor necrosis factor α (TNF-α); Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1); Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)

※ 項目來源：國家科技重大專項項目(編號：2008ZX09202)

劉麗星(1986—)，女，博士研究生。研究方向：神經(jīng)內(nèi)科。

R-332；R743.31；R743.330.531；R743.330.25

A

1002-2619(2014)09-1382-03

2013-11-11)

△ 通訊作者：北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學教育部重點實驗室和北京市重點實驗室，北京 100700

1 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100700