負載絲裂霉素C的聚乳酸微球制備及對成纖維細胞生長抑制作用研究

朱繼翔， 彭 曄， 田秀梅， 陽范文， 陳曉明

(廣州醫(yī)科大學基礎學院生物醫(yī)學工程系，廣州 510182)

絲裂霉素C(MMC)是由頭狀鏈霉菌產生的抗生素混合物中分離提取的一種廣譜抗腫瘤抗生素. 其作用原理是破壞DNA的結構和功能，抑制增殖期細胞脫氧核糖核酸(DNA)的復制，并抑制核糖核酸(RNA)的合成，從而有效地抑制細胞增殖[1]. 在青光眼手術治療中，MMC主要應用于減少術后濾過泡的瘢痕化，提高手術的成功率[2]；在癌癥臨床治療中，MMC主要應用于減少術后腫瘤細胞的增生[3]. 然而，MMC的代謝周期很短，臨床上使用MMC抑制細胞增生時需要反復給藥，給患者帶來不便和痛苦. 對MMC控制釋放體系的研究，有利于延長MMC的給藥周期，減少患者痛苦，具有臨床應用的前景. MMC通常可以采用殼聚糖、脂質體等作為藥物載體[4-6]，主要的負載是薄膜、微球以及水凝膠[7-9]. 近年來，以合成類可降解高分子為載體的載藥微球研究備受關注[10-12]，為藥物的負載與緩釋提供了重要參考. 利用微球化技術進行藥物負載具有許多優(yōu)勢，它可以維持藥物穩(wěn)定性，延長藥物緩釋時間，有效對藥物進行靶向控制釋放，并且降低藥物毒副作用等. 而生物可吸收類聚酯，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己內酯(PCL)以及他們的共聚物(PLGA)等，具有一定的生物相容性，無免疫原性，已被美國FDA批準作為體內植入材料應用于臨床治療. 利用生物可吸收類聚酯作為載體，負載藥物進行控制釋放已有相關報道[13-14]，在此基礎上，本研究采用單乳化劑揮發(fā)法制備負載MMC的PLA微球，對其體外釋放和對成纖維細胞生長的抑制作用進行研究，其結果對PLA載藥微球體系的探索，對其它藥物的負載與控制釋放具有一定參考價值.

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)

小鼠NIH-3T3成纖維細胞購于中山大學實驗動物中心，采用含10%胎牛血清、0.1 mg/mL雙抗的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)，于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2 試劑和原料

聚乳酸(PDLLA)，相對分子量為5萬，惠州華陽醫(yī)療器械有限公司；絲裂霉素C(MMC)，阿拉丁試劑公司；聚乙烯醇(PVA)，聚合度300～500，sigma公司；二氯甲烷，丙酮，分析純，廣州化學試劑廠.

1.3 PLA/MMC微球的制備

采用單乳化溶劑揮發(fā)法制備PLA載藥微球，具體步驟如下：稱取200 mg的PLA和一定量的MMC溶于10 mL二氯甲烷與丙酮的混合溶劑中(二氯甲烷與丙酮的體積比為4∶1),300 r/min攪拌下，將所得聚合物溶液緩慢注入100 mL質量分數(shù)為2%的PVA水溶液中，800 r/min下乳化10 min；將乳濁液倒入1 L蒸餾水中，1 000 r/min、25℃下溶劑揮發(fā)12 h后，將所得微球離心分離，蒸餾水清洗3次，除去微球表面殘留的PVA；冷凍干燥(FD-1-50真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)3 d，室溫下干燥器中存儲備用.

用同樣的方法制備不含MMC的PLA空白微球干燥器中存儲備用.

1.4 PLA/MMC微球性能測試

稱取100 mg PLA/MMC微球溶于2 mL丙酮，加入10 mL乙醇，離心，取上清液于358 nm處測定紫外吸收，并結合MMC標準溶液的紫外吸收曲線計算載藥微球中MMC的實際含量. 分別依照式(1)～(3)計算微球載藥量、包封率及成球率.

載藥量(%)=

實測負載的MMC質量/微球總質量×100%，

(1)

包封率(%)=

實測負載的MMC質量/加入的MMC總質量×100%，

(2)

成球率(%)=

實際獲得的微球質量/投入的聚合物與藥物的總質量×100%.

(3)

紅外光譜分析：用Nicolet/Nexus670型傅里葉變換紅外光譜儀測量原料PLA、MMC及載藥微球的紅外譜圖.

SEM分析：取1滴微球懸浮液滴于銅臺表面，自然晾干后噴金，通過掃描電鏡(JSM-6380LA型，日本電子株式會社)觀察微球的表面形貌.

粒徑分析：采用激光粒度分析儀(MasterSizer 2000型)測量空白微球與載藥微球的粒徑，平行測量3次.

1.5 PLA/MMC微球的體外釋放

稱取20 mg載藥微球裝入透析袋，放入試管，加入10 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液(PBS)；將試管置于37℃恒溫振蕩器振蕩釋放；間隔一段時間取出2 mL溶液，同時補充2 mL新鮮PBS緩沖溶液；于358 nm處測定紫外吸收，并結合MMC標準曲線計算釋放溶液中MMC的含量. 時間間隔為：1/4、1/2、1、2、3、5、7、10、14、18、21、25、28、31 d.

1.6 小鼠NIH-3T3成纖維細胞生長活力

將成纖維細胞接種于培養(yǎng)皿中，細胞密度近似于1.0×104/sample；實驗組培養(yǎng)基中加入50 mg載藥微球；藥物對照組培養(yǎng)基中加入MMC，維持其質量濃度為0.5 mg/mL；空白對照組中加入未載藥的空白微球. 用噻唑藍(MTT)法檢測細胞在第1小時、1 d、3 d的生長情況，用倒置顯微鏡(LEICA，德國)觀察細胞的形態(tài).

2 結果與討論

2.1 微球制備參數(shù)的確定

載藥微球的性能受眾多制備參數(shù)的影響，其中，藥物與聚合物的比例尤為重要[13]，它直接影響微球的實際載藥量以及包封率. 當乳化劑質量分數(shù)為2%，藥物與聚合物比在1/99～15/85時，載藥微球的實際載藥量、包封率、成球率以及微球直徑的變化如表1所示. 微球的成球率皆達到90%左右，因為PLA具有較強的疏水性，在PVA溶液中乳化時較易成球. 當MMC投藥比例的增加時，微球粒徑變化不大，表明采用單乳化法制備疏水載藥微球時，相對于乳化劑質量分數(shù)、攪拌速度等微球制備參數(shù)，藥物濃度對微球粒徑的影響較小. 另外，隨著MMC投藥比例的增加，微球的實際載藥量有所增加，當投藥比為10/90時，實際載藥量最高達到5.43%，繼續(xù)增加投藥比，微球的載藥量并沒有明顯提高，表明此時微球載藥量達到飽和狀態(tài)；當投藥比為10/90時，微球的包封率達到最高，為49.1%. 結果表明，藥物與聚合物的最佳投料比例為10/90.

表1 藥物與聚合物的比例對微球載藥的影響Table 1 Effects of different MMC/PLA ratios on the properties of microspheres

圖1 MMC、PLA以及PLA/MMC載藥微球的紅外譜圖

2.2 微球形貌觀察

2組聚合物微球呈規(guī)整的球狀，表面光滑，分布較均勻(圖2)，有文獻報道在油相中引入低沸點的溶劑可改善微球的形貌[14]，本研究中，在油相溶劑二氯甲烷中加入適當?shù)谋?，一方面可以增加藥物MMC在油相溶劑中的溶解度，有利于提高包封率，另一方面也達到了改善微球形貌的目的. 另外，由SEM圖片觀察可知，藥物MMC的負載對微球的形貌、粒徑影響較小，2組微球形貌相似. 使用激光粒度儀測量空白微球與載藥微球的粒徑，分別為37.78±0.16 μm與44.81±0.24 μm.

2.3 微球體外釋放研究

當藥物與聚合物投料比為10/90，實際載藥量為5.43%，包封率為49.1%時，載藥微球的體外累計釋放曲線如圖3所示. 在釋放初期，無明顯暴釋現(xiàn)象，微球累計釋放藥物31 d，累計釋放量達到84.8%. 整個釋放過程大致可分為3個階段，在釋放的前5 d內，釋放速率相對較快，平均每天釋放6.4%；在第7至25天內，釋放速度均勻，達到平衡，平均每天約釋放2.5%左右；在最后1周內，釋放速率較緩慢，平均每天的釋藥量低于1%.

圖2 顯微觀察微球(A，B)與載藥微球(C，D)

Figure 2 The microexamination of blank microspheres (A, B) and MMC loaded microspheres (C, D)

圖3 載藥微球的累積釋放曲線

Figure 3 Cumulative release of MMC by MMC loaded microspheres

微球中藥物的釋放主要通過2種方式，一種是藥物經微球的孔隙擴散到介質中，而此時微球表面吸附的藥物可能會發(fā)生突釋現(xiàn)象；另一種是通過微球的降解，使得藥物緩釋. 微球的孔隙及微球的大小影響藥物的釋放[15]. 可以通過制備技術控制微球的孔隙尺寸，孔隙多的基質釋藥率要比孔隙少的高. 一般情況下，隨著微球粒徑的增加，釋藥率降低，因此，為了使微球的釋放速率相對較穩(wěn)定，微球的粒徑應基本一致. 載藥微球的降解受到多方面因素影響，包括制備微球聚合物的組成，親疏水官能團的比例，以及聚合物本身的降解機制等[16]. 在較難降解的聚合物中引入共聚物單元，可以提高聚合物降解速率，從而提高微球的釋放量與釋放速率；在聚合物中引入親水基團，增加聚合物的親水性能，也有利于微球釋放性能的提高.

選用具有良好生物相容性的聚乳酸制備載體微球，加入乳化劑PVA提高成球率，并采用丙酮與水的混合溶液溶解MMC，制備微球時，在油相中引入低沸點溶劑丙酮，有利于提高包封率. 在釋放初期的0～5 d內，微球負載的藥物量較高，少部分最外層藥物通過微球的孔隙擴散到介質中，表現(xiàn)出相對較高的釋放速率；在釋放中期，即7～25 d，最外層藥物的擴散達到平衡，藥物主要通過微球降解而釋放，此時，釋放速率適中，并且維持較長時間的平衡，達到了緩釋藥物的目的；在釋放后期的7 d里，由于載藥量的減少，釋放速率較為緩慢，使得累積釋放量趨于平衡. 以PLA為載體負載MMC的微球，釋藥時間持久，速率均勻，累計釋放量較高，無明顯暴釋現(xiàn)象，是較為理想的藥物載體.

2.4 微球對小鼠NIH-3T3成纖維細胞增殖的抑制

為了進一步驗證PLA/MMC微球的釋放效果，在小鼠NIH-3T3成纖維細胞的培養(yǎng)環(huán)境中加入載藥微球，并設置對照組，考察載藥微球對細胞生長的影響. 用MTT法檢測MMC處理的細胞在1 h、1 d、3 d的生長情況(圖4). 隨著培養(yǎng)時間的增加，載藥微球組與直接加藥組的OD值明顯降低，表明2組對細胞的增殖起到了抑制作用，載藥微球緩釋的MMC有效抑制了細胞的增殖，培養(yǎng)至第3天時，載藥微球組的細胞數(shù)量僅為培養(yǎng)板對照組的10%左右；而空白微球組與培養(yǎng)板對照組的OD值隨著培養(yǎng)時間的增加而增高. 圖5結果表明，0.5 mg/mL MMC培養(yǎng)環(huán)境下載藥微球組對細胞生長的抑制作用明顯.

圖4 MTT法測試成纖維細胞的生長

圖5 MMC對不同時間點成纖維細胞生長的影響

3 結論

采用單乳化溶劑揮發(fā)法成功制備了負載MMC的PLA微球. 當藥物MMC與載體PLA的比例為10∶90時，微球的實際載藥量與包封率最高，分別達到5.62%與49.1%；體外釋放實驗顯示，載藥微球可有效緩釋MMC達30 d以上，累計釋放量為84.8%；載藥微球可以有效抑制小鼠NIH-3T3成纖維細胞的增殖. 本研究證明了PLA載藥微球體系應用于控制釋放MMC的可行性，對PLA載藥微球體系的探索，也為其它藥物的負載與控制釋放提供了參考.

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