甜玉米與糯玉米的染色體核型分析

劉繼琳， 劉彩霞， 郭佳靜， 楊國強， 黎杰強

(廣州市華南師范大學生命科學學院,廣州 510631)

玉米是一年生禾本科草本植物,是重要的糧食作物和飼料來源.玉米按其籽粒形狀、胚乳性質及稃殼有無,可分為9個亞種或類型[1],其中的甜玉米和糯玉米是新興的特種類型玉米.甜玉米(又稱水果玉米)因其籽粒在乳熟期含糖量較高而得名，其原產于美洲,是一類胚乳隱性突變體,由su1,su2,sh1,sh2,sh4,se,bt1,bt2等系列隱性突變基因控制[2].根據遺傳基礎的不同,甜玉米可分為普甜(susu)、超甜(sh2sh2/sh2sh2sh2)、脆甜(bt1bt1/bt1bt1bt1和bt2bt2/bt2bt2bt2)和加強甜(su1sesu1se/su1sesu1sesu1se)4種類型,其胚乳各種糖分含量因類型而異[2-3].糯玉米(又稱蠟質玉米)為原產于我國西南地區(qū)的特殊玉米變異類型,是由玉米第9對染色體短臂上的靠近著絲點處(9s-59)的純合隱性基因wxwx控制[4]，其籽粒淀粉全部為支鏈淀粉,粘性較強.

每一生物體內特定的染色體組成染色體組型.染色體組型分析(也稱核型分析)是對染色體數目、形態(tài)、著絲點位置、長度、臂比和隨體等進行定性或定量的分析，是研究物種演化、分類以及染色體結構、形態(tài)與功能之間的關系所不可缺少的重要手段[5-6].關于玉米染色體核型的研究，Kuwada[7]證實玉米的染色體數目為2n=20.Chen[8]和Filion[9]分別描述了其體細胞染色體的核型.Neuffer[10]提出了玉米體細胞染色體的核型模式圖.張贊平等[11]分析比較了玉米8個亞種、2個亞型和2個雜交品種染色體核型,發(fā)現玉米各亞種的核型進化,基本符合由對稱向不對稱發(fā)展趨勢.宗成志[12]對雜交玉米華甜1號與登海9號的染色體核型分析,認為兩者染色體的臂長、臂比和形態(tài)既有相似之處，也存在一定差異.染色體核型的變化是了解植物系統發(fā)育和進化的一個重要方面,可為植物的分類鑒定提供細胞學依據[13].甜玉米和糯玉米除了糖份含量、營養(yǎng)成分、籽粒形狀、口感等存在差異外,其起源、株形、葉形等均存在一定的差異,對它們細胞學水平的分析(包括核型分析)報道少.本研究采用常規(guī)壓片技術,對甜玉米和糯玉米進行核型分析,旨在為探討特種玉米的進化和系統發(fā)育提供細胞學依據.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

甜玉米采用L-11株系作為材料, 由美國引進的超甜玉米經過8代自交選育而成的二環(huán)系;糯玉米采用L-70株系作為材料, 由京科糯玉米經過6代自交選育而成的二環(huán)系.材料選育地點：華南師范大學生物園，材料田間農藝性狀表現穩(wěn)定.纖維素酶(美國)、果膠酶(丹麥);顯微鏡Nikon80i(尼康)及相關的照相系統.

1.2 染色體制片方法和核型分析

選擇均勻一致、干燥的甜玉米和糯玉米種子分別置于水中浸泡1 h和2 h,種子吸脹后轉到培養(yǎng)皿中,加少許水,30 ℃下培養(yǎng).根長1.0～1.5 cm時,將根尖切下置于w(秋水仙素)=0.1%溶液常溫處理3 h.用蒸餾水沖洗2～3次,移入新配制的固定液(V(甲醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)中,4～15 ℃下固定4 h.用φ(乙醇)=90%沖洗2次后轉入70%乙醇中,置4 ℃冰箱中保存待用.將根尖置于2.5%纖維素酶和果膠酶等量混合液中,25 ℃酶解3 h,吸掉酶液,蒸餾水沖洗2～3次,改良品紅染液,染色10 min，壓片法觀察.用Nikon 80i 顯微鏡在10×40倍鏡下拍照染色體形態(tài)好且分散的細胞.取分散良好、著絲點清晰的染色體中期分裂相圖片30張進行染色體計數,統計材料的染色體數目.

核型分析按照李懋學等[14]的標準,核型分類按 Stebbins[15]的分類標準,按 Arano[16]方法計算核型不對稱系數(As.k%),按 Kuo S R 等[17]的方法確定染色體相對長度系數(Index of relative length),采用Levan[18]著絲點命名系統.每種材料觀察 30個以上中期分裂相進行染色體計數,并選取5個分散良好的中期分裂相,用尼康顯微鏡(80i)在100倍油鏡下拍照.采用手工剪分,取其平均值供核型分析,用Excel繪制核型模式圖[19].

2 結果與分析

2.1 甜玉米的染色體核型分析

結果表明，甜玉米(L-11株系)的染色體數目為2n=20(圖1),與張贊平等[11，20]對玉米的8個亞種核型分析所得的染色體數目相符合(2n=20)，由甜玉米的染色體核型(圖2)、核型模式(圖3)和染色體參數(表1)得出的甜玉米(L-11株系)核型公式：2n=2x=20=2M+12m+6sm(2Sat),即其染色體組成是由1對正中著絲粒染色體、6對中著絲粒染色體和3對近中部著絲粒染色體組成,且在3對近中部著絲粒染色體中有1對具隨體.甜玉米最長與最短的染色體比值為2,臂比大于2的染色體比例為20%，核型不對稱系數為59.66%，核型屬2B型.染色體相對長度變化范圍為3.44%～6.86%；染色體相對長度系數組成為2n=20=2L+4M2+12M1+2S,由1對長染色體(No.1),2對中長染色體(No.2,3),6對中短染色體(No.4-9)和1對短染色體(No.10)組成.

圖1 甜玉米的有絲分裂中期染色體(×400)

圖2 甜玉米的染色體核型

圖3 甜玉米的染色體核型模式圖

序號相對長度/%(短臂+長臂=全長)相對長度系數臂比著絲點指數類型13.00+3.86=6.861.371.2943.75m22.58+3.00=5.581.121.1746.15m32.14+3.43=5.571.121.6038.46m42.58+2.58=5.161.031.0050.00M52.36+2.58=4.940.991.1047.83m61.50+3.43=4.930.992.2930.44sm71.72+2.79=4.510.901.6338.10m81.29+3.00=4.290.862.3330.00sm91.29+2.15=3.440.691.6737.50m101.72+3.00=4.720.941.7536.36sm*

*具隨體染色體，隨體長度未計算在內,下表同

2.2 糯玉米的染色體核型分析

糯玉米(L-70株系)的染色體數目為2n=20(圖4).這與張贊平等[11，20]對糯玉米材料根尖細胞染色體數目一致(2n=20).

圖4 糯玉米的有絲分裂中期染色體(×400)

由糯玉米的染色體核型(圖5)、核型模式(圖6)和染色體參數(表2)可以得出糯玉米的核型公式為：2n=2x=20=2M+8m(2Sat)+10sm，即其染色體組成是由1對正中著絲粒染色體、4對中著絲粒染色體和5對近中部著絲粒染色體組成,且在4對中著絲粒染色體中有1對是具隨體的.最長與最短的染色體比值為1.777 8,臂比大于2的染色體比例為10%,核型不對稱系數為60.41%,核型屬2A型.染色體相對長度變化范圍為3.67%～6.54%;染色體相對長度系數組成為2n=20=2L+8M2+6M1+4S,由1對長染色體(No.1),4對中長染色體(No.2-5),3對中短染色體(No.6-8)和2對短染色體(No.9,10)組成.

圖5 糯玉米的染色體核型

圖6 糯玉米的染色體核型模式圖

序號相對長度/%(短臂+長臂=全長)相對長度系數臂比著絲點指數類型13.27+3.27=6.541.311.0050.00M22.45+3.27=5.721.141.3342.86m32.04+3.67=5.711.141.8035.71sm41.63+4.08=5.711.142.5028.57sm51.84+3.27=5.111.021.7836.00sm62.24+2.45=4.690.941.0947.83m71.43+2.86=4.290.862.0033.33sm81.63+2.04=3.670.731.2544.44m91.22+2.45=3.670.732.0033.33sm102.04+2.86=4.900.981.4041.67m*

2.3 甜玉米與糯玉米的核型比較

表3顯示，甜玉米與糯玉米的核型和染色體參數有相同點：(1)它們的染色體都是20條,兩者的核型組成都含有正中著絲粒、中部著絲粒和近中部著絲粒染色體,且都有1對染色體帶有隨體,與對玉米的各亞種核型結果基本[20]相同.(2)2種材料的染色體相對長度變化幅度接近,甜玉米是3.44%～6.86%，糯玉米是3.67%～6.54%.(3)核不對稱系數也接近,甜玉米是59.66%,而糯玉米則是60.41%,均屬于較不對稱核型.根據Stebbins[13]的理論,不對稱程度越高的生物,其染色體變異越大,進化程度越高.因此,甜玉米(L-11株系)與糯玉米(L-70株系)的核型在系統演化上屬于較進化的類群.

表3 甜玉米與糯玉米的核型和染色體參數比較Table 3 Comparison of karyotypes and chromosome parameters of sweet corn and waxy corn

甜玉米與糯玉米的核型存在差異:(1)按照Stebbins[15]標準核型分類,甜玉米的核型是2B型,糯玉米的核型是2A型.(2)比較兩者核型公式,甜玉米由1對正中著絲粒染色體、6對中著絲粒染色體和3對近中部著絲粒染色體組成,且在3對近中部著絲粒染色體中有1對具隨體,臂比>2的比率為20%.糯玉米由1對正中著絲粒染色體、4對中著絲粒染色體和5對近中部著絲粒染色體組成,且在4對中著絲粒染色體中有1對是具隨體的,臂比>2的比率為10%.隨體分布位置的不同,可見這2個物種之間存在明顯的細胞學分化.(3)比較兩者染色體長度組成,L、M1、M2、S所占的比例有所不同,甜玉米為1∶2∶6∶1，而糯玉米則是1∶4∶3∶2.綜合比較兩者核型數值，根據Stebbins[15]的理論，在生物的進化過程中,染色體核型是由對稱性向非對稱性演化的.Stebbins通過對植物核型資料分析，將染色體核型按對稱性程度的高低分為12種類型(1A-4A，1B-4B，1C-4C).核型對稱性程度越高的生物,其染色體變異越小,進化程度也越低;而非對稱性程度越高的生物,其染色體變異越大,進化程度越高.按照這一觀點,甜玉米的核型為2B型,在進化上應屬于程度較高的類型;而糯玉米的核型為2A型,應屬于進化程度較低的種類.所以，甜玉米的進化程度較高.

通過以上比較,說明玉米的不同種類之間既有種屬間的相似性,同時也存在一定的變異性.可能與遺傳中的DNA序列在進化過程中歧化相關,從而導致類型品種之間產生一定差異并擴大,差異積累到一定程度,該變化就可能引起染色體某些部位結構的變化,從而反映到染色體形態(tài)的變化[12].

3 討論

甜玉米與糯玉米是屬于不同類型的2個玉米品種.兩者的起源不同,甜玉米主要起源于美洲,而糯玉米是我國西南的特殊變異類型,對環(huán)境的適應性更強.甜玉米引入后經過長時間的馴化種植、基因提純、選擇,對國內的環(huán)境(包括土壤、氣侯等)適應能力逐步加強,也能很好地適應國內的生產種植.但它們的起源演化過程的不同,可能導致它們核型的差異.另外，栽培居群的不同也可能導致核型的差異.由于不同的生長地點在氣候條件、土壤性質等生境方面的差異,同種植物很有可能因適應不同環(huán)境的結果而形成核型多態(tài)性[21],在其他物種的染色體研究中也有不同居群核型差異的報道[22-25].此外,在人工雜交育種栽培實踐中,引種方法、栽培技術等因素也可能會引起變異的發(fā)生,染色體數目和結構也會發(fā)生改變[26-27].

張贊平[20]指出甜玉米的核型公式為2n=10m(2SAT) +10sm,由5對中著絲粒染色體和5對近中著絲粒染色體組成,其中第6染色體短臂具有隨體;最長染色體與最短染色體的比值為2.05,臂比大于2的染色體比例為20%,核型不對稱系數為59.78%,核型為2B型.除核型公式外,其它指標數值與本實驗的甜玉米染色體核型數值基本相符,說明來源較接近.糯玉米的核型公式為2n=14m+4sm(2Sat)+2st,由7對中著絲粒染色體、2對近中著絲粒染色體和1對近端著絲粒染色體組成,其中第6染色體短臂具有隨體;最長染色體與最短染色體的比值為2.17,臂比大于2的染色體比例為20%,核型不對稱系數為59.24%,核型為2B型.糯玉米核型為2A型,說明兩者的材料來源差異較大,根據Stebbins[15]的理論,本實驗的糯玉米是相對進化程度稍低的材料.說明目前甜玉米篩選的資源較窄,糯玉米資源較廣.其是長期自然突變與人工選擇的結果.核型分析等細胞學資料多應用于討論種和種以下類群的劃分,大多數情況對說明各屬是同質還是異質、是近親還是遠親有很大的價值[13].所以,本實驗對甜玉米和糯玉米的核型分析結果為甜、糯玉米這兩個類型間的親緣關系以及分類提供有效的細胞學依據.

對材料預處理、壓片技術等,可能導致核型參數產生差異,比如染色體長度在預處理過程中受藥劑種類、濃度及處理時間的影響，可能會明顯縮短[25,28].玉米染色體較小,給制片與核型分析帶來一定的影響.因此要獲得準確的結果,合適的預處理濃度和時間、制作清晰、高質量的染色體玻片標本是關鍵,運用染色體分帶技術作核型分析,更能準確反映核型上的差異.G-帶是染色體本身特征的本質反應,結合G-帶分析可有效地提高了核型分析的精確度[12].同樣,植物染色體的C-帶顯示的部位主要是組成型異染色質,它們主要是由分布在染色體末端和著絲粒附近的DNA重復序列組成,不同物種的染色體C-帶帶型具有明顯的差異,根據染色體的C-帶可以進行物種的鑒別[29].原位雜交技術、分子遺傳標記等技術的應用也為物種的起源、親緣關系的準確分析提供了更廣闊的前景.

參考文獻：

[1] 玉米遺傳育種學編寫組.玉米遺傳育種學[M].北京:科學出版社,1979:5-7.

[2] 劉紀麟.玉米育種學[M]. 北京: 農業(yè)出版社,1991:342-348.

[3] 羅高玲,吳子愷.甜玉米和糯玉米遺傳基因的研究進展[J].廣西農業(yè)科學,2003(3):24-26.

Luo G L,Wu Z K.Advances about the research of sweet and glutinous maize[J].Guangxi Agriculture Science,2003(3):24-26.

[4] Collins G N.A new type of Indian corn of China[J]. Bureau of Plant Industry,1909(161):1-31.

[5] 李懋學,張敩方.植物染色體研究技術[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學出版社,1991:1-20.

[6] Hu J Y,Su Z X,Yue B L,et al.Progress of karyotype analysis method in plants research[J].Journal of Sichuan Teachers Collage: Natural Science,2002,23(3): 239-244.

[7] Kuwada Y.Meiosis in the pollen mother cells ofZeamaysL[J]. Botanical Magazine (Tokyo),1911,25: 163-181.

[8] Chen C C.The somatic chromosomes of maize[J].Canadian Journal of Genetics and Cytology, 1969,11:752-754.

[9] Filion W G,Walden D B.Karyotype analysis:The detection of chromosomal alterations in the somatic karyotype ofZeamaysL[J].Chromosoma,1973,41:183-194.

[10] Neuffer M G.Handbook of geneties.(Ed.R.C.king)[M].New York：Plenum Press,1974.

[11] 張贊平,李懋學.玉米8個栽培亞種(類型)的核型和C-帶帶型的比較研究[J].遺傳學報,1990,17(2):86-93.

Zhang Z P,Li M X.A comparative study on the karyotypes and C-banding patterns of 8 subspecies (types) of corns [J]. Journal of Genetics,1990,17(2):86-93.

[12] 宗成志,李姝婧,吳士筠.雜交玉米華甜1號與登海9號染色體G-顯帶核型分析[J].現代農業(yè)科學,2008(10):1-3.

Zong C Z,Li S J,Wu S Y.Chromosome G- banding karyotype analysis of hybrid corns, Huatian No.1 and Denghai No.9 [J].Modern Agricultural Science,2008(10):1-3.

[13] 吳甘霖.核型分析在細胞分類學中的應用[J]. 生物學雜志,2006,23(1):39-42.

Wu G L. Application of karyotype analysis on cytotaxonomy [J]. Journal of Biology, 2006, 23(1):39-42.

[14] 李懋學,陳瑞陽.關于核型分析的標準化問題[J].武漢植物學研究,1985,3(4):297-302.

Li M X, Chen R Y. The standard problems about karyotype analysis [J].Wuhan Botanical Research,1985,3(4):297-302.

[15] Stebbins G L.Chromosome evolution in hingher plants[M].London: Edward Arnoldy Ltd, 1971:88-93.

[16] Arano H L.Cytological studies in subfamily Carduoideae (Compositae) of Japan IX[J]. Botanical Magazine (Tokyo),1963,76:32-39.

[17] Kuo S R，Wang T T,Huang T C.Karyotype analysis of some Formosan gymnosperms[J]. Taiwania,1972,17(1):66-80.

[18] Levan A,Fredga K,Sandberg A A.Nomenclacture for centromeric position on chromosomes [J].Hereditas,1964,52(2):197-201.

[19] 喬永剛,宋蕓.利用EXCLE制作核型模式圖[J].農業(yè)網絡信息,2006(10):97-98.

Qiao Y G, Song Y. Making karyotype model charts by EXCLE [J].The Agricultural Network Information,2006(10):97-98.

[20] 張贊平.玉米各亞種的核型研究[J].華北農學報,1995,10(3):60-67.

Zhang Z P.Karyotype studis on each subspecies of maize[J].North China Agricultural Journal,1995,10(3):60-67.

[21] 李倩,張桂彬,孫崇蘋.兩種觀賞吊蘭的核型分析[J].北方園藝,2009(3):202-204.

Li Q,Zhang G B, Sun C P. Karyotype analysis of two kinds of ornamental bracketplants [J]. Northern Horticulture,2009(3):202-204.

[22] 戴小紅,張延龍,牛立新.百合屬4種植物的核型研究[J].西北植物學報,2006,26(1): 50-56.

Dai X H, Zhang Y L, Niu L X. A karyotype study on 4 species of genus Lilium [J].Northwest Botany Journal,2006,26(1):50-56.

[23] 劉華敏,智麗,趙麗華,等.四種野生百合核型分析[J].植物遺傳資源學報,2010,11(4): 469-473.

Liu H M,Zhi L, Zhao L H, et al. Karyotype analysis of four Wild Lilium species [J]. Journal of Plant Genetic Resources,2010,11(4):469-473.

[24] 魏玉杰,何慶祥,張金文,等.中國不同地區(qū)罌粟的核型比較[J].草業(yè)學報,2012,21(2): 171-179.

Wei Y J,He Q X,Zhang J W, et al.Karyotype comparisons of poppies of different regions in China[J].Grassland Journal,2012,21(2):171-179.

[25] 張芹,李保會,張凡.3種補血草屬植物的核型分析[J].河北農業(yè)大學學報,2013,36(2):65-68.

Zhang Q,Li B H,Zhang F.Karyotype analysis of 3 species of Limonium plant[J].Journal of Hebei Agricultural University,2013,36(2):65-68.

[26] 詹園鳳,黨選民,曹振木,等.兩個茄子品種的核型分析[J].植物遺傳資源學報,2009, 10(2): 283-285.

Zhan Y F,Dang X M,Cao Z M, et al. Karyotype analysis of two eggplant varieties[J].Journal of Plant Genetic Resources,2009,10(2):283-285.

[27] 祝海燕,羅雙霞,陳雪平,等.幾種茄科蔬菜的核型分析和比較[J].河北農業(yè)大學學報,2013, 36(1):21-24.

Zhu H Y,Luo S X,Chen X P, et al.The karyotype analysis and comparison of several solanaceous vegetable[J].Journal of Hebei Agricultural University,2013,36(1):21-24.

[28] 王桃銀,郭巧生,汪濤.21個藥用菊花栽培類型的核型分析[J].南京農業(yè)大學學報,2012,35(6): 13-18.

Wang T Y,Guo Q S,Wang T. Karyotype analysis of 21 cultivars of medicinal chrysanthemum[J]. Journal of Nanjing Agricultural University,2012,35(6):13-18.

[29] 陳全站,楊平.4種栽培大麥染色體組型和C-帶帶型的比較分析[J].南京曉莊學院學報,2007(3): 57-61.

Chen Q Z,Yang P.The comparative analysis of chromosome karyotypes and C-banding patterns of 4 kinds of cultivated barley [J].Journal of Nanjing Xiaozhuang University,2007(3):57-61.