4種方法測(cè)定低濃度HBsAg效果評(píng)價(jià)

趙艷爭

(天津市北辰醫(yī)院檢驗(yàn)科 天津北辰 300400)

乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是由Dane顆粒的外殼和直徑22nm的球型顆粒和管型顆粒所組成。HBsAg是人體感染乙型肝炎病毒(HBV)的標(biāo)志，是人體感染HBV后最先出現(xiàn)的指標(biāo)，具有免疫原性，可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。目前，中國大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法及膠體金法進(jìn)行檢測(cè)。但對(duì)于HBsAg低濃度的標(biāo)本，檢測(cè)時(shí)常因方法學(xué)的原因造成靈敏度較低，導(dǎo)致臨床出現(xiàn)漏檢，并且由于其檢測(cè)的影響因素較大，尤其是對(duì)灰區(qū)附近的標(biāo)本測(cè)定結(jié)果差異更大，導(dǎo)致重復(fù)性差。膠體金法雖然操作簡單，但靈敏度最低，臨床漏檢率最高。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法(LICA)始于20世紀(jì)90年代問世的單線態(tài)氧分子能量傳遞發(fā)光免疫分析技術(shù)LOCI經(jīng)過長時(shí)間的發(fā)展國內(nèi)已成功研制了基于LOCI檢測(cè)原理的LICA及檢測(cè)設(shè)備和相關(guān)試劑。本文使用LICA、ELISA及膠體金法同時(shí)測(cè)定經(jīng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析法ECLIA篩選的HBV定量檢測(cè)陽性膠體金法標(biāo)本吸光度與儀器所給臨界值 Cut－off的比值 COI為1－50的臨床標(biāo)本60例，HBsAgCOI＜1的臨床標(biāo)本30例作為陰性對(duì)照，以天津市臨床檢驗(yàn)中心提供的臨界值控制品作為質(zhì)控，結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 臨床標(biāo)本經(jīng)HBV DNA定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)陽性且經(jīng)ECLIA篩選如下模式:HBsAg COI在1～50的臨床標(biāo)本60例(觀察組)，30份正常人血清來自本院體檢中心(對(duì)照組)。以天津市臨床檢驗(yàn)中心提供的臨界值控制品作為質(zhì)控。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑。LICAHT高通量免疫分析儀METTLE全自動(dòng)移液器以及試劑盒;西化儀(北京)科技有限公司電化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑;上海藍(lán)基生物科技有限公司 ELISAHBSAg試劑盒;南京普朗 9602A酶標(biāo)儀;普朗 DNX－9620洗板機(jī);上海金標(biāo)生物膠體金法試劑。

1.2.2 測(cè)定方法。①LICA測(cè)定HBsAg的含量采用雙抗體夾心法?；A(chǔ)原理是一種均相免疫反應(yīng)，均相條件下將試劑1(R1內(nèi)部帶有染料的納米感光微粒，試劑2(R2內(nèi)部帶有發(fā)光化合物包被有活性分子的納米發(fā)光微粒與待測(cè)樣本進(jìn)行混合。此時(shí)R1中的感光微粒和R2中的發(fā)光微?？煽焖儆行У夭蹲酱郎y(cè)物質(zhì)形成免疫復(fù)合物。復(fù)合物經(jīng)過680nm激發(fā)光照射后感光微粒中的染料被誘導(dǎo)激活并釋放出高能態(tài)的單線態(tài)氧，而單線態(tài)氧能被近距離200nm的發(fā)光微粒所俘獲，發(fā)光微粒進(jìn)而釋放出高能級(jí)的紅光610nm通過單光子計(jì)數(shù)器和數(shù)學(xué)擬合將光子數(shù)換算為靶分子濃度。當(dāng)樣本不含待測(cè)物質(zhì)時(shí)，2種微粒間則無法形成免疫復(fù)合物單線態(tài)氧在液相中迅速衰減無法傳遞至發(fā)光微粒表面檢測(cè)時(shí)則無光子產(chǎn)生。②ECLIA測(cè)定HBsAg的含量采用雙抗體夾心法:生物素標(biāo)志的抗－HBs，三聯(lián)吡啶釘絡(luò)合物[Ru(bpy)3]2+標(biāo)志的抗－HBs與待測(cè)樣品共同孵育，形成[Ru(bpy)3]2+/2HBsAg/2抗－HBS/2HBsAg生物素的復(fù)合體，再和親和素標(biāo)記的磁微粒孵育，形成[Ru(hpy)3]2+/2HBsAg/2抗－HBS/2HBsAg生物素2親和素磁微粒復(fù)合體，接著蠕動(dòng)泵將反應(yīng)液吸入流動(dòng)室，磁微粒由磁鐵吸附到電極表面，加入三丙胺(TPA)，電極加電壓，啟動(dòng)EcL反應(yīng)，有光電倍增管測(cè)量光的強(qiáng)度，光的強(qiáng)度與[Ru(bpy)3]2+的濃度呈線性關(guān)系，從而可得出樣品中HBsAg的含量。③ELISA法。用ELISA法測(cè)HBsAg，嚴(yán)格按上海藍(lán)基生物科技有限公司提供的說明書進(jìn)行。④膠體金法。嚴(yán)格按上海金標(biāo)生物提供的說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 4種方法靈敏度實(shí)驗(yàn)比較 取天津市臨床檢驗(yàn)中心臨界值血清進(jìn)行不同濃度稀釋，采用LICA法、ECLIA法、ELISA法及膠體金法分別重復(fù)測(cè)定5次，結(jié)果如下:HBSAg濃度為0.10ng/mL時(shí)ECLIA為陽性 (COI＞1);HBSAg濃度為0.25ng/mL時(shí)LICA為陽性(LICA＞0.2ng/mL);HBSAg濃度為0.50ng/mL時(shí)ELISA為陽性(OD/CO＞2.1);HBSAg濃度為1.00ng/mL時(shí)膠體金法為陽性(試紙條出現(xiàn)2條紅色帶)。見表1。

表1 4種方法測(cè)定HBsAg的靈敏度比較(ng/mL)

2.2 4種方法測(cè)定HBsAg結(jié)果比較 4種方法檢測(cè)兩組樣本，以ECLIA法作比較，其中LICA檢出率為98.33%，ELISA法檢出率為93.33%，膠體金法檢出率僅為26.67%，見表2。

表2 4種方法HBsAg測(cè)定結(jié)果比較

3 討論

HBsAg是檢測(cè)HBV首選的免疫學(xué)標(biāo)志物，膠體金法和ELISA兩步法檢測(cè)HBsAg在國內(nèi)已被廣泛采用。ELISA靈敏度較低＜0.5ng/mL而出現(xiàn)漏檢，而且ELISA方法需要反復(fù)加樣和洗板，引入的誤差加大。加上酶標(biāo)板的孔間存在差異等問題一直導(dǎo)致該法精密度較差。膠體金法雖然操作簡單方便，但由于其方法學(xué)的原因靈敏度更低，同樣對(duì)低濃度HBsAg檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果[1]。

而ECLIA是近年來繼熒光免疫法FIA，放射免疫法RIA和酶聯(lián)免疫法EIA之后發(fā)展起來的新興免疫標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)使用的標(biāo)記物穩(wěn)定，無放射性污染，已發(fā)展成為國外檢測(cè)病毒性肝炎血清學(xué)指標(biāo)的重要方法。ECLIA試劑的優(yōu)勢(shì)在于其不僅具有較高的靈敏度，而且還具有更寬的線性范圍。但是該方法所需儀器和試劑成本較高[2]，不適宜在基層地方推廣。

LICA技術(shù)使用了納米級(jí)顆粒，增加了生物分子的包被面積，同時(shí)借助鏈霉親和素－生物素放大系統(tǒng)極大地提高了檢測(cè)靈敏度，減少樣本和試劑的用量。它避免了傳統(tǒng)檢測(cè)方法中繁瑣的分離和洗滌步驟有效降低了檢測(cè)背景值減少了反應(yīng)時(shí)間并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作[3]。目前國內(nèi)已經(jīng)研制了與該方法配套的檢測(cè)病毒性肝炎標(biāo)志物和相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)。本文使用LICA對(duì)HBsAg的檢測(cè)結(jié)果顯示LICA對(duì)HBsAg的分析靈敏度可達(dá)到0.25ng/mL，60例陽性樣本中僅1例未檢出與ECLIA測(cè)定結(jié)果最為相近。而ELISA與膠體金法的漏檢率為6.67%和73.33%，對(duì)低濃度樣品易漏檢且無法得知被測(cè)物真正的濃度.給臨床診斷和治療帶來許多不便，而LICA和ECLIA均可對(duì)HBsAg進(jìn)行定量。本實(shí)驗(yàn)中LICA和ECLIA檢出相符性均很高(98.89%)而且LICA已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了儀器和試劑的國產(chǎn)化，成本較低，可以有效降低醫(yī)療費(fèi)用。與ECLIA相比LICA具備相近的檢測(cè)性能，但可控制成本。與ELISA及膠體金法比較LICA具有更高的敏感度并可簡化操作步驟，使實(shí)驗(yàn)更快捷且該法可進(jìn)行自動(dòng)化定量檢測(cè)，可動(dòng)態(tài)觀察療效和監(jiān)測(cè)病情，適于臨床使用[4]。

[1] 呂學(xué)琴，馬雅靜.電化學(xué)發(fā)光免疫分析法與酶聯(lián)免疫吸附、膠體金測(cè)定低濃度HBsAg的效果評(píng)價(jià)[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34(9):1133

[2] 周迎春，陳 輝，關(guān) 平，等.3種方法測(cè)定低濃度乙型肝炎病毒表面抗原效果評(píng)價(jià)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，4(11):1070

[3] SzekeresPG，LeongK，DayTA，et al.Developmentof homogeneous384 －wellhigh－throughputscreeningassays forAbeta1－40andAbeta1－42usingalphascreentechnology J[J].JBiomolScreen，2008，13(2):101

[4] 陳桂蘭，陸 燕.光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定低濃度HBsAg效果評(píng)價(jià)[J].重慶醫(yī)學(xué)，2012，41(25):2652