嚴(yán)重少精子癥及無精子癥的遺傳學(xué)分析

楊會(huì)林，董 晶

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518036)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，全世界約有10%-15%的育齡夫婦患有不孕不育癥，其中由男性因素導(dǎo)致的不育癥約占30%-50%，同時(shí)30%以上的男性不育癥患者是由于遺傳學(xué)異常導(dǎo)致生精功能障礙引起[1]，在臨床上主要表現(xiàn)為嚴(yán)重少精子癥(精子密度<5×106/ml)和無精子癥(精液離心后鏡檢未發(fā)現(xiàn)精子)。染色體異常是造成男性不育的重要遺傳學(xué)因素，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在男性不育患者中，染色體異常的發(fā)生率為2%-5%，在少精子癥和無精子癥中更高達(dá)15%[2]。Y染色體為男性特有，與男性特異的遺傳學(xué)性狀密切相關(guān)，Y染色體與男性不育的關(guān)系一直是男科學(xué)的研究重點(diǎn)，尤其是對Y染色體長臂(Yq11)上的無精子因子(azoospermia factors,AZF)區(qū)域缺失的研究。AZF分為4個(gè)區(qū)域，即AZFa區(qū)、AZFb區(qū)、AZFc區(qū)、AZFd區(qū)，AZF任何一個(gè)座位的缺失都可能導(dǎo)致生精功能障礙[3]。本研究對142例嚴(yán)重少精子癥和178例無精子癥患者進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)和Y染色體AZF微缺失分析，以便為患者明確診斷，對患者進(jìn)行正確的生育指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和主要儀器 外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基購自德國Cytogen公司；全血DNA提取及AZF檢測試劑購自亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司；PCR儀購自美國ABI公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國BioRad公司。

1.1.2 研究對象 142例嚴(yán)重少精子癥和178例無精子癥患者來自我院生殖中心及遺傳咨詢門診。所有患者均按照WHO(2010)精液常規(guī)分析標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，連續(xù)3次精液分析，精子密度<5.0×106/ml的患者診斷為嚴(yán)重少精子癥；精液離心沉淀鏡檢未見精子的患者診斷為無精子癥，并選取100例精液參數(shù)正常男性作為AZF微缺失檢測正常對照。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 無菌操作采集研究對象的肝素抗凝靜脈血2-3 ml用于染色體檢查，EDTA抗凝靜脈血2-3 ml用于AZF微缺失檢測。

1.2.2 外周血細(xì)胞培養(yǎng)染色體分析 無菌操作抽取0.4 ml肝素抗凝全血置于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，混勻后置5%CO2培養(yǎng)箱恒溫37℃培養(yǎng)72 h，制備染色體標(biāo)本，G顯帶。油鏡下分析5個(gè)分裂相，計(jì)數(shù)30個(gè)分裂相。有嵌合核型時(shí)加計(jì)數(shù)至100個(gè)分裂相，必要時(shí)加做C顯帶、N顯帶進(jìn)一步分析。根據(jù)ISCN2009人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制命名。

1.2.3 Y染色體AZF微缺失檢測 使用深圳亞能生物技術(shù)有限公司Y染色體微缺失基因檢測試劑盒，采用多重PCR方法對DNA進(jìn)行AZF微缺失檢測，檢測位點(diǎn)包括AZFa區(qū)：SY82、SY84、SY86；AZFb區(qū)：SY124、SY127、SY128、SY133、SY134、SY143；AZFc區(qū)：SY239、SY242、SY254、SY255；AZFd區(qū)：SY145、SY152，共15個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)PCR反應(yīng)體系里均有Y染色體性別決定基因(SRY基因)做內(nèi)控，并設(shè)置陽性對照(正常男性DNA)和陰性對照(超純水)。擴(kuò)增條件：50℃ 10 min；95℃ 10 min；94℃ 30 s；58℃ 60 s；72℃ 60 s；共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳至溴酚藍(lán)遷移出2-3 cm，在紫外燈下觀察、拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 外周血染色體檢查結(jié)果

142例嚴(yán)重少精子癥患者檢出23例異常核型(16.20%)，178例無精子癥患者檢出35例異常核型(19.66%)。兩組患者染色體異常核型比率均高于正常人群核型異常比率(0.38%)[4]。所有異常核型中，Klinefelter綜合征14例，占異常核型總數(shù)的24.14%；其它性染色體異常28例，占異常核型總數(shù)的48.28%；常染色體異常16例，占異常核型總數(shù)的27.59%。在所有58例異常核型患者中，24例臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重少精子癥，34例表現(xiàn)為無精子癥；15例檢出AZF缺失，43例無缺失，見表1。

表1 嚴(yán)重少精子癥和無精子癥患者染色體檢查結(jié)果

2.2 Y染色體AZF微缺失檢測結(jié)果

在142例嚴(yán)重少精子癥患者中，檢出14例AZF微缺失，缺失率為9.86%；在178例無精子癥患者中，檢出20例AZF微缺失，缺失率為11.24%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重少精子癥患者組和無精子癥患者組的缺失率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，上述兩組分別與精液參數(shù)正常組相比較均有顯著差異(P<0.005，表2)。

表2 正常精液患者、嚴(yán)重少精子癥患者、無精子癥患者Y染色體微缺失檢測結(jié)果

注：與正常精液組比較，*χ2=10.48，P<0.005；#χ2=12.10，P<0.005；均有顯著差異。嚴(yán)重少精子癥組與無精子癥組比較，χ2=0.16，P>0.05，無顯著差異。

3 討論

引起男性不育的因素很多，其中由遺傳因素導(dǎo)致生精功能障礙是引起男性不育的重要原因之一。目前研究的主要遺傳因素包括染色體核型異常及Y染色體AZF微缺失。

染色體異?？梢圆煌潭鹊赜绊懙骄拥陌l(fā)生，進(jìn)而影響男性的生育能力。在正常人群中染色體異常的發(fā)生率約為0.38%[4]。本研究320例無精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者中，共檢出染色體異常核型58例，檢出率為18.13%，明顯高于正常人群水平，說明男性不育與染色體異常有密切關(guān)系。本研究所有染色體異常核型中，Y染色體異常出現(xiàn)頻率最高(29例)，占異常核型總數(shù)的50.00%。Y染色體是男性特有染色體，其長臂上有精子分化和發(fā)育相關(guān)基因，Y染色體的缺失、倒位、易位、異染色質(zhì)區(qū)的異常都可能導(dǎo)致這些基因的缺失或異常表達(dá)，導(dǎo)致精子生成障礙或影響精子的受精能力；本研究檢出Klinefelter綜合征14例，占異常核型總數(shù)的24.14%，所有患者臨床表現(xiàn)均為無精子癥。該病的發(fā)病機(jī)制是生殖細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)X染色體不分裂，形成了染色體異常卵子與Y精子受精，該型患者成年后睪丸曲精管發(fā)生萎縮和玻璃樣變性，不能產(chǎn)生精子；本研究還檢出常染色體異常16例，提示常染色體異常也跟精子發(fā)生有關(guān)[5]。精子生成受到諸多有序表達(dá)的基因的控制[6]，據(jù)估計(jì)有2000個(gè)基因調(diào)節(jié)精子生成，這些基因絕大部分位于常染色體上，常染色體的異常可能影響這些基因的功能，進(jìn)而影響精子的發(fā)生。

AZF為多基因家族，編碼RNA結(jié)合蛋白并調(diào)節(jié)RNA的代謝、修飾、運(yùn)輸、剪切以及基因表達(dá)。有研究表明，大約6.7%的無精癥及3.6%的少精癥患者存在AZF微缺失[7]。本研究320例男性不育患者AZF微缺失檢出率與上述報(bào)道基本符合。既往研究認(rèn)為，AZFa區(qū)缺失患者臨床主要表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征，AZFb區(qū)缺失的患者主要表現(xiàn)為生精阻滯，主要停留在精母細(xì)胞和精子細(xì)胞階段，AZFc區(qū)缺失的患者臨床主要表現(xiàn)為不同程度的少精子癥，AZFd區(qū)則被認(rèn)為是AZFb區(qū)和AZFc區(qū)之間的一個(gè)重疊區(qū)域。還有研究認(rèn)為唯支持細(xì)胞綜合征的患者也存在AZFb區(qū)、AZFc區(qū)缺失，而AZFa區(qū)或AZFb區(qū)完全缺失以及更大片段缺失的患者，通過睪丸精子穿刺或經(jīng)皮穿刺附睪抽吸取精術(shù)也很難獲得精子[8,9]。本研究142例嚴(yán)重少精子癥患者中，AZF基因存在b區(qū)、c區(qū)及d區(qū)缺失，其中以c+d區(qū)缺失為主，未發(fā)現(xiàn)有a區(qū)缺失，還發(fā)現(xiàn)1例3區(qū)(b+c+d)大片段缺失；178例無精子癥患者中，a區(qū)、b區(qū)、c區(qū)及d區(qū)四個(gè)區(qū)域均檢出缺失，其中檢出b+c+d區(qū)缺失8例，a+b+c+d缺失2例，3區(qū)以上大片段聯(lián)合缺失占總?cè)笔У?0.00%。比較兩組檢測結(jié)果，雖然嚴(yán)重少精子癥患者組和無精子癥患者組的缺失率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但無精子癥患者AZF基因3區(qū)以上大片段缺失比例明顯高于嚴(yán)重少精子癥患者組，表明基因缺失越多對精子發(fā)生的影響越大。本研究一共檢出20例AZFc+d區(qū)聯(lián)合缺失，其中12例臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重少精子癥，8例表現(xiàn)為無精子癥，表明相同AZF位點(diǎn)缺失患者的遺傳學(xué)效應(yīng)存在個(gè)體差異，需進(jìn)一步研究。

本研究28例Y染色體核型異?；颊咧?，15例檢出AZF微缺失，13例未檢出缺失；而34例AZF微缺失患者中，15例患者檢出Y染色體核型異常，19例正常。上述數(shù)據(jù)表明，Y染色體核型正?；颊呖赡艽嬖贏ZF缺失，而Y染色體核型異常患者AZF基因不一定缺失。故對于男性不育患者，同時(shí)檢測染色體核型和AZF基因微缺失，可以提高診斷效率。

通過對男性不育癥患者染色體和Y染色體長臂AZF微缺失的檢測，可以從細(xì)胞水平和分子水平探索精子發(fā)生機(jī)制，以及因生精障礙導(dǎo)致男性不育的真正原因，從而制定相應(yīng)治療措施，減少無謂的檢查，避免不必要的藥物和手術(shù)治療；另一方面，也可以對希望接受輔助生育技術(shù)，特別是為行ICSI患者提供遺傳信息參考，使其做出選擇，避免子代遺傳負(fù)荷增加，為優(yōu)生優(yōu)育提供可靠的遺傳依據(jù)，具有重要的臨床意義。

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