基因測序鑒定新等位基因A*33:03:14

肖燦軍,譚 茵,熊白玉,李小文, 區(qū)棟財,丁浩強,葉 欣, 黃穎烽

(1.廣州醫(yī)科大學研究生院，廣東 廣州 510182;2.廣州醫(yī)科大學基礎學院;3.廣州血液中心;4.廣州醫(yī)科大學附屬廣州第一人民醫(yī)院 普外科)

人類白細胞抗原(HLA)受控于人類主要組織相容性復合體(MHC)的基因簇，位于人類第6號染色體的短臂(6p21.31)，是迄今為止最具多態(tài)性的人類基因系統(tǒng)[1,2]。其化學本質為糖蛋白，由一條α重鏈(被糖基化的)和一條β輕鏈非共價結合而成,遺傳特點呈現(xiàn)單倍體遺傳，高度多態(tài)性，連鎖不平衡特性。HLA與器官移植的排斥反應密切相關，同時在機體免疫細胞的發(fā)育、免疫識別和特異性免疫應答中起著關鍵作用。隨著遺傳免疫學、分子生物學的迅速發(fā)展，人類對HLA系統(tǒng)結構及功能的認識及闡明亦逐漸在完善，同時新的等位基因也不斷地被發(fā)現(xiàn)。

本課題組在對結直腸癌患者人群進行常規(guī)HLA分型的過程中，發(fā)現(xiàn)一份標本的HLA-A位點出現(xiàn)基因突變，與世界通用HLA等位基因數(shù)據(jù)庫已有序列不相符，對其進行HLA核苷酸測序，結果如下：

1 材料與方法

1.1研究對象標本來自于廣東地區(qū)一例右半結腸癌伴卵巢轉移女性患者的全血標本 。

1.2儀器與試劑全血基因組DNA快速提取試劑盒(美國Qiagen公司)、PCR擴增儀(美國Life Technologies公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)、PCR-SBT-HLA-A、-B、-C、DRB1基因分型試劑盒(德國Abbot公司、美國TBG公司)，3130XL全自動測序儀(美國ABI公司)、數(shù)據(jù)分析軟件為Assign軟件(澳大利亞 Conexio Genomics公司，3.5版)。

1.3方法

1.3.1 基因組DNA提取 患者血液樣本于術前檢查時抽取，取5%EDTA抗凝外周血3 ml， 以5%EDTA抗凝，低速離心(速度：1 000 r/min，時間：5 min)后取白膜層，按試劑盒操作說明書提取DNA(詳細步驟按試劑盒操作說明書操作)，-20℃保存。

1.3.2 HLA基因分型檢測：采用德國Abbot公司AlleSEQR Combikits PCR-SBT試劑盒(具體操作步驟按說明書)。

擴增反應體系：總反應體積為25 μl，見表1。

表1 擴增反應體系

反應條件為：95℃ 3 min →95 ℃ 15 s ，65 ℃ 30 s ，68 ℃ 5 min ，共35個循環(huán)→68 ℃，10 min→4 ℃。

測序反應體系：總反應體積為10 μl，見表2。

表2 測序反應體系

反應條件為：96℃ 10 s→96 ℃ 10 s，50℃ 10 s，60 ℃ 2 min ，共25個循環(huán)→4℃。序列分析使用澳大利亞Conexio公司Assign軟件(3.5版)。

1.3.3 新基因確認試驗：按照美國TBG公司PCR-SBT分型試劑盒說明書，對HLA-A位點第2、3外顯子進行特異性擴增。對擴增后的產(chǎn)物測序，序列分析使用澳大利亞Conexio公司Assign軟件(3.5版) 。

1.4基因提交核苷酸序列經(jīng)GeneBank比對后，提交世界衛(wèi)生組織HLA因子命名委員會申請確認并命名。

2 結果

2.1HLA基因分型結果在對結直腸癌患者DNA采用德國Abbot公司AlleSEQR Combikits SBT試劑盒進行HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB常規(guī)分型中，使用Assign軟件分析，發(fā)現(xiàn)一HLA-A位點無完全匹配的結果，與其最接近的匹配結果A*33:03:01，其堿基位點491出現(xiàn)不完全匹配，提示有新基因序列出現(xiàn)。

2.2新基因確認試驗用美國TBG公司PCR-SBT分型試劑盒測序試劑再次對A位點進行單鏈測序，發(fā)現(xiàn)在外顯子3的堿基位置491出現(xiàn)T→A點突變，密碼子位置149由GCT→GCA，兩者編碼的氨基酸相同，仍為丙氨酸，為同義突變(圖1、圖2)。新基因序列提交Genbank并申報WHO HLA因子命名為委員會，被正式命名為HLA-A*33:03:14。

HLA-A*33:03:14與HLA-HLA-A*33:03:01序列比對圖，圖中淺黃色縱向條帶區(qū)域堿基位492由T→A。

圖2 HLA-A*33:03:14與HLA-A*33:03:01的堿基序列及氨基酸對照圖

3 討論

HLA系統(tǒng)的遺傳特點(復等位基因、共顯性表達、單元型遺傳、連鎖不平衡)決定了其具有高度的多態(tài)性，因此同一HLA座位上可出現(xiàn)不同等位基因。DNA鏈堿基突變、缺失、插入，染色體重排、轉換、倒位、重復及基因重組均可造成新等位基因的產(chǎn)生[3-4]。DNA序列分析(PCR-SBT)被認為是最理想的HLA分型及鑒定HLA新等位基因方法，廣泛地應用于科研工作中[5]。本課題組在HLA多態(tài)性與胃腸道腫瘤遺傳相關性的研究中,發(fā)現(xiàn)新的等位基因HLA-A*33:03:14與其高度同源的HLA-A*33:03:01主要區(qū)別在于外顯子3位置492核苷酸由T→A，密碼子位置149由GCG→GCA。相應編碼的氨基酸不變，為同義突變。HLA-A*33:03:14在廣東漢人中的發(fā)現(xiàn)豐富了HLA基因庫，擴大了HLA基因系統(tǒng)的遺傳多樣性。

HLA-A屬于經(jīng)典的HLA-1類分子，其多態(tài)性主要表現(xiàn)在2、3外顯子，A*33：03在中國漢族人群中比較常見，出現(xiàn)的概率約為8.1%，地域分布無差異性[6]。研究表明HLA的多態(tài)性與多種免疫性疾病及腫瘤具有相關性。目前，大量文獻表明HLA-B27與強直性脊柱炎具有高度相關性，是其發(fā)病的易感基因，檢測其相應抗原的表達對診斷強直性脊柱炎具有重要的臨床意義[7-8]。HLA-C與甲狀腺乳頭狀癌(PTC)的發(fā)生發(fā)展也具有相關性[9]。同時，HLA基因多態(tài)性還表現(xiàn)在種族性和地域性，F(xiàn)ronik等研究發(fā)現(xiàn)黑人狼瘡性腎炎與等位基因DQB1*0602及DQB1*0502高度相關，亞洲人狼瘡性腎炎則與DQB1*0502相關最為明顯[10]。本文涉及HLA多態(tài)性與胃腸道腫瘤遺傳相關性研究，HLA-A*33：03：14是此研究中于一例右半結腸癌伴卵巢轉移患者全血中發(fā)現(xiàn)的新等位基因,遺憾的是我們未能夠采集到患者家屬的血液標本進行家族遺傳流行病學分析。目前關于HLA多態(tài)性與胃腸道腫瘤相關性的文獻報道甚少，HLA的多態(tài)性與胃腸道腫瘤是否有相關聯(lián)性值得進一步探索和研究。腫瘤的發(fā)生是多因素的結果，環(huán)境因素和遺傳因素是其主要的發(fā)病因素，但大量的流行病學研究表明暴露于相同環(huán)境的人群只有少數(shù)個體發(fā)病，體現(xiàn)遺傳易感因素的重要地位?？偠灾?，HLA抗原作為人體細胞表面的重要標志之一，在免疫應答及免疫調節(jié)中具有重要的臨床作用，并且與人體疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系。目前尚未提出一種學說能完全闡述HLA與疾病的關聯(lián)機制，但是目前的HLA與疾病相關性學說例如擬態(tài)學說、受體學說、免疫應答基因學說、連鎖不平衡學說、共同表位學說都能不同程度的解釋和說明一些問題，因此推斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展與HLA多態(tài)性密不可分。鑒于其相關性，通過探討腫瘤的發(fā)生發(fā)展與HLA某些等位基因之間的關系，有望在基因水平推測腫瘤的發(fā)病機制或發(fā)現(xiàn)與某些腫瘤相關性較強的HLA標志物應用于臨床。甚至有望做到早期發(fā)現(xiàn)某些在目前醫(yī)療水平下難以診斷的隱匿性腫瘤，提高治療的效果，改善患者生存率及生活質量從而更好地服務于醫(yī)學研究及臨床診療。

作者簡介：肖燦軍(1988- )，男，在讀研究生，普外專業(yè);黃穎烽(1966-)， 男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師， 主要從事胃腸道腫瘤及甲乳疾病的外科手術治療。

參考文獻：

[1]Shao MX,Nakanaga T,Nadel JA，et al.Cigarette smoke induces MUCA5AC mucin overproduction via tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme in human airway epithelial (NCI-H292) cells [J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2004，287(2):420.

[2]譚 茵，黃穎烽，徐秀章,等.MICA新等位基因MICA*002 ：04 的DNA 序列鑒定及分析[J].中國免疫學雜志,2011，27(5):434.

[3]劉孟黎，齊 珺，習杰英，等．DNA測序確認人類白細胞抗原新等位基因A*03；30及二例家系調查分析[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2009，32(1):66.

[4]張春來，梁 剛，張 毅,等.基因測序鑒定新等位基因 HLA-A*11：01：37[J].中華血液學雜志，2012,33(9):756.

[5]黃 飛，肖露露，閻文瑛,等.PCI卜SSP/PCR—SBT—I玎LA高分辨等位基因分型比較[J].中山大學學報(醫(yī)學科學版)，2006，27(38):21.

[6]李 楊，何 軍，鮑曉晶,等.中國漢族人群供-受者HLA-A、B、C、DRB1和DQB1高分辨等位基因頻率分布及錯配比例的研究[J].中華遺傳學雜志,2011，28(1):92.

[7]李夢遠,姚中強,劉湘源.HLA-B27與強直性脊柱炎免疫學機制的研究進展[J].生理科學進展，2011，42(1):16.

[8]倪吳花,胡曉霞,章圣輝,等.強直性脊柱炎867例HLA—B27的表達及意義[J].實用醫(yī)學雜志,2008,24(9):1511.

[9]Haghpanah V,Khalooghi K ,Adabi K.Associations between HLA-C alleles and papillary thyroid carcinoma[J].Cancer Biomark,2009，5:19.

[10]曹孟德，秦東春，孫含笑.HLA分子生物學及臨床應用[M].鄭州，河南醫(yī)科大學出版社，2000：178.