Let-7b慢病毒載體構(gòu)建及對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的影響

張 靜 徐小隔 龔 哲 趙紹云 何 霞 王天舒 焦淑潔 滕軍放 賈延劼

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

·論著·

Let-7b慢病毒載體構(gòu)建及對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的影響

張 靜 徐小隔 龔 哲 趙紹云 何 霞 王天舒 焦淑潔 滕軍放 賈延劼

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

目的 探討Let-7b過(guò)表達(dá)和Let-7b抑制慢病毒載體在體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用。方法 構(gòu)建Let-7b過(guò)表達(dá)和Let-7b抑制慢病毒載體并感染大鼠MSCs，篩選最適感染復(fù)數(shù)(MOI)；實(shí)驗(yàn)分未感染組、感染組1(感染LV-rno-Let-7b-up)、感染組2(感染LV-rno-Let-7b-inhibition)、陰性對(duì)照組(感染空病毒)；采用法舒地爾誘導(dǎo)感染后大鼠MSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞。倒置熒光顯微鏡下觀察MSCs感染后熒光表達(dá)情況；采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白(MAP-2)的表達(dá)變化；PT-PCR檢測(cè)MAP-2 mRNA的表達(dá)變化；MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察大鼠LV-rno-Let-7b-up和LV-rno-Let-7b-inhibition慢病毒載體感染成功，MOI值為10，感染3 d時(shí)大鼠LV-rno-Let-7b-up慢病毒感染率最高，細(xì)胞存活率較高，感染率可達(dá)(92.1±4.3)%；MOI為20，感染5 d時(shí)大鼠LV-rno-Let-7b-inhibition慢病毒感染率最高，細(xì)胞存活率較高，感染率可達(dá)(90.3±4.2)%。法舒地爾可以誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，感染組1誘導(dǎo)MSCs為神經(jīng)細(xì)胞顯著高于陰性對(duì)照組和感染組2，NSE、MAP-2表達(dá)率明顯高于陰性對(duì)照組和感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 結(jié)論 LV-rno-Let-7b-up可更高效感染大鼠 MSCs，感染LV-rno-Let-7b-up后大鼠MSCs經(jīng)法舒地爾誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞分化比率增加。

Let-7b；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)元

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cell，MSCs)是骨髓中除造血干細(xì)胞外的另一類具有高度可塑性的細(xì)胞群體，是一類可以從體內(nèi)器官組織中分離出的具備在體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)和擴(kuò)增等特性的細(xì)胞[1]，在基因治療、細(xì)胞治療、組織工程等領(lǐng)域具有廣泛的臨床應(yīng)用前景[2]。MicroRNAs(miRNAs)是真核生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，長(zhǎng)20～25個(gè)核苷酸，可通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、表觀遺傳學(xué)水平和異染色質(zhì)形成等方式調(diào)控基因組的表達(dá)，參與 MSCs重要的生物學(xué)進(jìn)程，包括增殖、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、死亡等[3-5]，miRNAs幾乎參與所有動(dòng)物的發(fā)展和病理過(guò)程，miRNA的生物合成是受?chē)?yán)格的時(shí)間和空間的控制，其失調(diào)與許多人類疾病有關(guān)[6]。誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞可能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供可行性方法[7]。lin28/let-7這對(duì)搭檔分子被認(rèn)為是經(jīng)典的發(fā)育調(diào)節(jié)子,主要調(diào)控干細(xì)胞增殖、分化、衰老及細(xì)胞重編程等多個(gè)環(huán)節(jié)[8-9]。Let-7b為let-7家族中的一員，其在MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程的作用機(jī)制尚不清楚。本研究根據(jù)確定的Let-7b序列分別構(gòu)建目的microRNA過(guò)表達(dá)和抑制慢病毒載體，法舒地爾誘導(dǎo)各組細(xì)胞，觀察Let-7b在大鼠MSCs橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞中的作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)別SD大鼠，雌雄不限，6～8周齡，體質(zhì)量100～120 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002。MSCs由大鼠股骨及脛骨中分離提取，連續(xù)傳10代以上。

1.2 主要試劑 Age I、EcoR I和T4 DNA ligase購(gòu)自NEB；病毒包裝三質(zhì)粒:GV重組載體系列(同時(shí)可表達(dá)綠色熒光蛋白)和pHelper 1.0和pHelper 2.0均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司。DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；神經(jīng)元烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE，bs-1027R)、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白( microtubulin-associated protein 2，MAP-2，bs-1368R)兔抗多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自上海碧云天公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自康為，RT-PCR試劑盒均為Oligo產(chǎn)品；凝聚胺多聚賴氨酸和噻唑藍(lán)( MTT) 購(gòu)自Sigma；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純化，所用引物由廣州銳博技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成。

1.3 主要方法

1.3.1 microRNA Let-7b過(guò)表達(dá)和抑制慢病毒載體構(gòu)建： 根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)獲得Let-7b(MIMAT0000775)過(guò)表達(dá)和抑制的序列，設(shè)計(jì)合適的引物序列，PCR方法合成雙鏈DNA oligo，其兩端含酶切位點(diǎn)黏端。將GV159載體經(jīng)Age I和EcoR I雙酶切后，在T4 DNA連接酶的作用下與雙聯(lián)DNA oligo于22℃連接3 h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行陽(yáng)性克隆PCR鑒定。脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)感染的方法進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝。

轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.2×107細(xì)胞/20 mL，重新接種于15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h待細(xì)胞密度達(dá) 70%～80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGC-LV 載體20 μg，pHelper 1.0載體15 μg，pHelper 2.0 載體10 μg)，與相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻，調(diào)整總體積為2.5 mL，在室溫下溫育5 min。將Lipofectamine 2000 試劑輕柔搖勻，取100 μL Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4 mL Opti-MEM 混合，在室溫下溫育5 min。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000 進(jìn)行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5 min內(nèi)混合?；旌虾?，在室溫下溫育20 min，以便形成DNA與Lipofectamine 2000 稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將DNA與Lipofectamine 2000 混合液轉(zhuǎn)移至293T 細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20 mL的PBS液，輕輕左右晃動(dòng)一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，然后倒去。每瓶細(xì)胞中加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基25 mL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞上清液。于4℃、4000 g離心10 min，除去細(xì)胞碎片。以0.45 μm濾器過(guò)濾上清液于40 mL超速離心管中，再離心濃縮病毒液至所需濃度，收集病毒液，分裝后-80℃長(zhǎng)期保存，取其中1支用孔稀釋法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，同樣方法制備僅含EGFP報(bào)告基因的陰性對(duì)照慢病毒載體。

1.3.2 感染復(fù)數(shù)MOI(multiply of infection，MOI)值測(cè)定： 按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)染慢病毒，并取不同的MOI值，感染后每天在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的EGFP表達(dá)情況，并計(jì)數(shù)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

1.3.3 大鼠MSCs感染及實(shí)驗(yàn)分組： 取LV-rno-Let-7b-up和LV-rno-Let-7b-inhibition以最適合MOI值感染大鼠MSCs，同時(shí)取同一MOI值的空病毒感染陰性對(duì)照組置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，孵育24～72 h。根據(jù)感染情況將同時(shí)點(diǎn)的MSCs分為4組：未感染：不進(jìn)行感染，其他培養(yǎng)條件同各感染組；感染組1：感染LV-rno-Let-7b-up，即含Let-7b-up病毒和EGFP；感染組2：感染LV-rno-Let-7b-inhibition，即含Let-7b-inhibition病毒和EGFP；陰性對(duì)照組：感染空病毒，即只含有EGFP。在倒置顯微鏡下觀察感染24 h、48 h、72 h、96 h EGFP熒光表達(dá)情況，評(píng)價(jià)細(xì)胞感染效率。

1.3.4 體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞： 取各組細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，棄DMEM完全培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入預(yù)誘導(dǎo)液(DMEM+10%胎牛血清+200 μmol/L法舒地爾)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。

1.3.5 MTT比色法： 將感染LV-rno-Let-7b-up、LV-rno-Let-7b-inhibition和空病毒前后各時(shí)點(diǎn)的MSCs移入96孔培養(yǎng)板，加入MTT(5.0 g/L)50 μL/well、置于培養(yǎng)箱孵育4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜200μL，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度，評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。

1.3.6 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法： 分別將各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)PBS、4%多聚甲醛、0.2% Triton X-100、封閉液處理后加入NSE抗體(1.0 mg/L)、MAP-2抗體(1.0 mg/L)4℃孵育24 h，之后再用PBS清洗后加入二抗染色標(biāo)記。觀察細(xì)胞圖像通過(guò)顯微鏡用×10或×20攝取每組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)都會(huì)采集超過(guò)30個(gè)區(qū)域的細(xì)胞，而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同細(xì)胞數(shù)目，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件分析各實(shí)驗(yàn)組熒光圖片單個(gè)細(xì)胞的累積吸光度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.7 RT-PCR： 采用康為試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。參照oligo試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR，總反應(yīng)體積20 μL，然后取RT-PCR產(chǎn)物10.0 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，凝膠圖像分析系統(tǒng)(GelProAnalyzer 3.0) 分析各目的基因與β-actin 基因條帶吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 Let-7b過(guò)表達(dá)和抑制慢病毒載體的構(gòu)建 GV159載體經(jīng)Age I和EcoR I雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示載體中位于兩酶切位點(diǎn)間的原有片段被分離，載體被切割成線性，挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)序，陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果，證明大鼠Let-7b過(guò)表達(dá)和抑制慢病毒載體構(gòu)建成功，慢病毒載體系統(tǒng)的3個(gè)質(zhì)粒GV159、pHelper 1.0和pHelper 2.0按一定比例感染293T細(xì)胞，收集感染后48 h的293T細(xì)胞上清液，進(jìn)行離心濃縮，取濃縮的病毒液用孔稀釋法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，Let-7b過(guò)表達(dá)慢病毒載體T=3×103TU/L(TU，transduction unit)，Let-7b抑制慢病毒載體T=8×108TU/L。

2.2 Let-7b過(guò)表達(dá)和抑制慢病毒感染 本研究采用含有綠色熒光報(bào)告基因(EGFP)標(biāo)記的病毒載體觀察、評(píng)估感染效率，倒置熒光顯微鏡觀察感染24 h，可以觀察到部分綠色熒光，Let-7b過(guò)表達(dá)慢病毒感染3 d時(shí)EGFP表達(dá)最理想(見(jiàn)圖1)，Let-7b抑制慢病毒感染5 d時(shí)EGFP表達(dá)最理想(見(jiàn)圖2)，感染組合陰性對(duì)照組EGFP感染率無(wú)顯著差異。

圖1 Let-7b過(guò)表達(dá)慢病毒載體熒光照片

圖2 Let-7b抑制慢病毒載體熒光照片

2.3 MTT結(jié)果 感染前各組MSCs的MTT結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.05)；感染24 h感染組MTT顯著下降，與各對(duì)照組MTT比較均有顯著差異(P<0.05)，各對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。感染48 h、72 h、96 h后MTT值雖較24 h有所上升(P<0.05)，但與其他組MTT比較仍有顯著差異(P<0.05)。

2.4 法舒地爾體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞 未感染組MSCs誘導(dǎo)2 h，部分細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞改變，胞體收縮成圓形，突起細(xì)長(zhǎng)，有多個(gè)分支，部分在局部形成網(wǎng)絡(luò)。感染LV-rno-Let-7b-up組誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)變化更為迅速和顯著，誘導(dǎo)2 h后多數(shù)細(xì)胞胞體收縮成圓形，細(xì)胞突起細(xì)長(zhǎng)，交織成網(wǎng)，形成較典型的神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖3)。感染LV-rno-Let-7b-inhibition組誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)變化更為緩慢，誘導(dǎo)2 h后少量細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞改變，胞體收縮呈圓形，未見(jiàn)網(wǎng)絡(luò)形成見(jiàn)圖4。

圖3 感染Let-7b上調(diào)慢病毒后誘導(dǎo)分化2 h

圖4 感染Let-7b下調(diào)慢病毒后誘導(dǎo)分化2 h

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 感染LV-rno-Let-7b-up組誘導(dǎo)2 h后，NSE、MAP-2表達(dá)率分別為(90.1±1.7)%、(88.7±2.1)%，顯著高于未感染組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖5。感染LV-rno-Let-7b-inhibition組誘導(dǎo)2 h后，NSE、MAP-2表達(dá)率分別為(78±1.5)%、(76±1.8)%，顯著低于未感染組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖5 感染Let-7b過(guò)表達(dá)慢病毒MSCs誘導(dǎo)分化后免疫組化MAP-2表達(dá)情況

圖6 感染Let-7b抑制慢病毒MSCs誘導(dǎo)分化后免疫組化MAP-2表達(dá)情況

2.6 RT-PCR結(jié)果 4組分別誘導(dǎo)分化2 h均表達(dá)MAP-2 mRNA，未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組比無(wú)明顯差異，感染LV-rno-Let-7b-up組表達(dá)MAP-2 mRNA較未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。感染LV-rno-Let-7b-inhibition組表達(dá)MAP-2 mRNA較未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

MSCs是一種來(lái)源于中胚層具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞[10]，且可打破胚層障礙分化成各種細(xì)胞類型，如可以在體內(nèi)或體外，甚至是細(xì)胞移植到大腦或脊髓后表達(dá)神經(jīng)外胚層的屬性[11]。

let-7家族主要在成人的腦組織及胚胎內(nèi)高表達(dá)，在神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)也是上調(diào)的[7，12]。Let-7b作為let-7家族的成員，可以通過(guò)Toll樣受體7(Toll-like receptors 7，TLR7)信號(hào)通路激活小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，TLR7參與了各種類型的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥損傷，包括神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，內(nèi)源性的Let-7b可以通過(guò) TLR7信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13]；Let-7b以干細(xì)胞的調(diào)控因子TLX和細(xì)胞周期調(diào)控因子細(xì)胞周期蛋白Dl為靶點(diǎn)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)干細(xì)胞分化[14]。TLX通過(guò)激活經(jīng)典的Wnt信號(hào)在成體神經(jīng)干細(xì)胞的自我修復(fù)和更新能力上起著至關(guān)重要的作用。Let-7b與TLX的3"UTR結(jié)合，降低TLX在神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)水平[13]；此外，Let-7b還可通過(guò)Hmga2(high mobility group-AT-hook 2)進(jìn)行調(diào)控，以促進(jìn)胎兒和青年小鼠的中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新[12]。

但Let-7b作為let-7家族的成員之一，在MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞中的作用尚不清楚。本研究采用Let-7b過(guò)表達(dá)和抑制慢病毒載體感染MSCs，觀察其在MSCs誘導(dǎo)分化中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)Let-7b過(guò)表達(dá)慢病毒載體可以高效感染大鼠MSCs，感染后基因表達(dá)EGFP可穩(wěn)定表達(dá)，MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染Let-7b過(guò)表達(dá)慢病毒載體后MSCs存活率下降，但感染僅含有報(bào)告基因的慢病毒載體后MSCs存活率變化不大，免疫組化結(jié)果表明MSCs感染Let-7b過(guò)表達(dá)慢病毒載體后神經(jīng)細(xì)胞分化效率顯著提高，神經(jīng)細(xì)胞早、中期標(biāo)志物NSE和成熟神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物MAP-2表達(dá)均明顯增高。這提示le-7b可能在MSCs橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞中起作用，提高Let-7b的表達(dá)可促進(jìn)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。但單獨(dú)感染Let-7b慢病毒載體并不能使MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，還必須在誘導(dǎo)劑法舒地爾的作用下才能分化。說(shuō)明Let-7b在橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞中的作用不是唯一的，可能是對(duì)一些信號(hào)途徑控制，如TLR通路、Wnt信號(hào)通路、Hmga2通路等，從而提高誘導(dǎo)效率。

綜上所述，本研究采用慢病毒感染技術(shù)，建立Let-7b過(guò)表達(dá)和抑制模型，Let-7b過(guò)表達(dá)具有促進(jìn)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的作用，本研究為以后MSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供廣泛前景。

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(收稿2014-05-20)

Effect of lentiviral vector of Let-7b on differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into neurons

ZhangJing,XuXiaoge,GongZhe,ZhaoShaoyun,HeXia,WangTianshu,JiaoShujie,TengJunfang,JiaYanjie

DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Objective To investigate the role of Let-7b in inducing bone marrow mesenchymal stem cell(MSCs) differentiation into neurons.Methods The lentiviral vector of Let-7b up (LV-rno-Let-7b-up) and inhibition (LV-rno-Let-7b-inhibition) was constructed and transfected into rat MSCs.The cells were divided into non-transfected group, transfected group 1(transfected with LV-rno-Let-7b-up), transfected group 2 (transfected with LV-rno-Let-7b-inhibition) and negative control group (transfected with empty virus).MSCs were treated with Fashudier as an inducer for triggering the cells to differentiate into neurons.The fluorescence expressed by transfected MSCs were observed under inverted fluorescence microscope.The mRNA expression of microtublin-associated protein 2 (MAP-2) was detected by RT-PCR.The expression of neuron-specific markers, neuron-specific enolase(NSE) and MAP-2 were measured by immunocytochemical method.The viability of MSCs was determined by MTT method.Results In LV-rno-Let-7b-up the best transfection efficiency(up to 92.1%±4.3%) and survival rate appeared when multiply of infection (MOI) was 10 and on 3rd day.In LV-rno-Let-7b-inhibition the best transfection efficiency (up to 90.3%±4.2%) and survival rate appeared when MOI was 20 and on 5th day.Fashudier induced MSCs to differentiate into neurons and the best efficiency of the induction was observed in transfected group 1.The expression levels of NSE and MAP-2 in transfected cells were higher than those in the cells of other group(P<0.05).Conclusion LV-rno-Let-7b-up has high transfection efficiency in rat MSCs.Higher differentiation rate from rat MSCs to neurons is induced by Fashudier after the cells are transfected with LV-rno-Let-7b-up.

Let-7b; Marrow mesenchymal stem cells; Neurons

R-332

A

1673-5110(2014)23-0001-04