祁門(mén)紅茶多酚提取物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷保護(hù)作用的研究

崔燕芒，李 鵬，陳錦文，趙 燕*(.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，西安 7002；2.解放軍第56醫(yī)院藥劑科，西寧 80007；.青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)急診科，青島 2660)

茶葉已有幾千年的栽培和飲用歷史，喝茶有助于身體健康，對(duì)一些疾病具有預(yù)防作用也被實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[1]。茶葉中的茶多酚是一種天然的抗氧化劑，也是一種理想的天然藥物，具有清除自由基和抗氧化等生物活性， 其抗氧化活性高于一般的非酚性或單酚羥基類(lèi)抗氧劑[2]。侯冬巖等研究顯示，茶多酚的抗氧化作用明顯優(yōu)于維生素E[3]， 茶多酚通過(guò)阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程， 從而提高人體內(nèi)各種酶的活性，起到抗突變、抗癌癥的功效。據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，茶葉中的茶多酚(主要是兒茶素類(lèi)化合物)，對(duì)腸癌、胃癌等多種癌癥的預(yù)防和輔助治療均有益處[4-5]。肝臟是人體的一個(gè)重要器官，在代謝和解毒各種內(nèi)源性和外源性有害物質(zhì)中扮演了一個(gè)關(guān)鍵的角色[6]。近年來(lái)飲食、飲酒所致的肝病人數(shù)在逐漸增加， 嚴(yán)重者可以發(fā)展為肝炎、肝硬化。肝臟損傷是由于脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)引起的肝細(xì)胞損傷[7]。文獻(xiàn)報(bào)道，從茶葉中提取的多酚對(duì)肝損傷和肝纖維化具有保護(hù)作用， 但關(guān)于祁門(mén)紅茶對(duì)急性肝損傷保護(hù)作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。祁門(mén)紅茶(Keemun black tea)產(chǎn)于中國(guó)安徽省祁門(mén)縣，以“香高、味醇、形美、色艷”四絕馳名于世。據(jù)史料記載，祁門(mén)紅茶始制于清代光緒年間，為工夫紅茶的珍品。祁門(mén)紅茶中特有的香味，被國(guó)外不少消費(fèi)者稱(chēng)之為“祁門(mén)香”，在國(guó)際市場(chǎng)上被稱(chēng)之為“高檔紅茶”，現(xiàn)在飲茶已被認(rèn)為是中國(guó)的一種傳統(tǒng)文化[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在從祁門(mén)紅茶中提取茶多酚，進(jìn)行體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)研究，探究祁門(mén)紅茶的肝保護(hù)機(jī)制、藥理作用機(jī)制，為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 XP205型電子分析天平(梅特勒-托列多國(guó)際股份有限公司)；KQ5200DE超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司)；H-1型渦旋混勻儀(上?？岛瘫彪妰x器有限公司)；TG20型高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司)；UV752型紫外分光光度計(jì)(京華儀器責(zé)任有限公司)；SHT-88型恒溫水浴鍋(浙江太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；Tensor 27紅外光譜儀(德國(guó)布魯克儀器有限公司)；MILLI-Q Academic A10超純水儀(美國(guó)密里博公司)；DMIL LED型倒置熒光顯微成像系統(tǒng)(徠卡微系統(tǒng)股份公司)；KD2508型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司)。

1.2試藥 祁門(mén)紅茶從茶葉市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，從茶葉的形狀、色澤、香氣、滋味、湯色等方面來(lái)鑒別為優(yōu)質(zhì)紅茶；沒(méi)食子酸、乙酸乙酯、甲醇、四氯化碳(Sigma-Aldrich有限公司，分析純)；聯(lián)苯雙酯(BP，浙江萬(wàn)邦藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：120506)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、 谷胱甘肽(GSH-Px)試劑盒、超氧化物岐化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的昆明小鼠，60只，雄性，4周齡(18～22 g)，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法

2.1祁門(mén)紅茶中茶多酚的提取 稱(chēng)取祁門(mén)紅茶200 g，55 ℃微波干燥3 h，粉碎機(jī)粉碎(過(guò)600 μm篩)，加入體積分?jǐn)?shù)75%甲醇作為提取溶劑(1∶10)，在80 ℃回流提取3 h，倒出上層液，殘?jiān)偬崛?次，合并提取液，轉(zhuǎn)入離心機(jī)在3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至量瓶，隨后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5%，再用乙酸乙酯1∶3萃取3次，在減壓條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，倒入鐵盤(pán)中，置于-20 ℃冰箱中冷凍，凍好后將鐵盤(pán)置于冷凍干燥機(jī)中使其干燥得到KBTP，經(jīng)計(jì)算產(chǎn)率為19.5%。

2.2測(cè)定總茶多酚含量

2.2.1Folin-Ciocalteu 比色法原理 在堿性條件下，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸可以將多酚化合物定量氧化，而自身被還原生成藍(lán)色化合物，顏色的深淺和多酚的含量成正相關(guān)。

2.2.2供試品溶液的制備 取祁門(mén)紅茶多酚粗粉約600 mg，精密稱(chēng)定，平行操作3份，置于100 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容至刻度，即得。

2.2.3對(duì)照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.300 g(精確至0.000 1 g)沒(méi)食子酸(GAE，相對(duì)分子質(zhì)量188.14)用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容于100 mL量瓶中，配制成沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(3 mg·mL-1)。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL對(duì)照品溶液,置于6個(gè)50 mL量瓶中，各加20 mL蒸餾水， 分別加入5 mL 0.2 mol·L-1FC試劑，然后加入6 mL 100 g·L-1碳酸鈉溶液，加水至50 mL， 振搖，避光反應(yīng)2 h后，以蒸餾水為空白，于760 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算試樣中的總多酚含量[9]。

2.2.5Folin-Ciocalteu 比色法方法學(xué)評(píng)價(jià) (1)重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取祁門(mén)紅茶多酚600 mg，精密稱(chēng)定(平行 6 份)，按照以上供試品溶液制備和顯色后測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)得祁門(mén)紅茶中茶多酚含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

(2)加樣回收實(shí)驗(yàn) 向已知總多酚含量的祁門(mén)紅茶多酚提取物待測(cè)樣品中分別加入一定量的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定并計(jì)算總多酚的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

2.2.6樣品中總酚含量的測(cè)定 分別精密吸取3份上述樣品溶液0.4 mL，按2.2.4項(xiàng)下操作方法測(cè)定吸光度，并根據(jù)回歸方程計(jì)算總多酚的含量。

2.3CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷保護(hù)實(shí)驗(yàn)

2.3.1實(shí)驗(yàn)分組及處理 在室溫(22± 2 ℃)、日照08:00至20:00、相對(duì)濕度55%±5%的環(huán)境中，喂養(yǎng)15 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)對(duì)動(dòng)物的飼喂以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作要求。小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，依次為空白對(duì)照組(Normal)、模型組(Model)、陽(yáng)性組(BP)、祁門(mén)紅茶多酚低劑量組(KBTP低)、祁門(mén)紅茶多酚中劑量組(KBTP中)、祁門(mén)紅茶多酚高劑量組(KBTP高)。

實(shí)驗(yàn)持續(xù)21 d，給藥時(shí)間為每天 9：00灌胃1次。所有小鼠均可自由飲水，并飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料。末次給藥后，小鼠禁食6 h， 將配制好0.083 mol·L-1的CCl4(CCl4/花生油)按照0.01 mL·g-1的劑量進(jìn)行腹腔注射，建立小鼠急性肝損傷模型。腹腔注射后12 h內(nèi)禁食，但可自由飲水。

2.3.2準(zhǔn)備小鼠血清及肝組織樣本 到規(guī)定時(shí)間，小鼠稱(chēng)質(zhì)量后從小鼠眼靜脈叢取血，之后將其斷頸處死。將血液在3 000 r·min-1的條件下離心10 min，置于4 ℃冰箱中保存，用以檢測(cè)血清中ALT、AST及ALP的含量(U·L-1)。同時(shí)立即剖取肝臟并稱(chēng)量肝質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)= 肝臟濕質(zhì)量(g )/ 體質(zhì)量(10 g-1)。用預(yù)冷的生理鹽水沖洗肝臟表面數(shù)次，剪取肝臟右葉部分(5 mm × 5 mm × 3 mm)固定于體積分?jǐn)?shù)10% (甲醛/水)福爾馬林溶液中，石蠟包埋，用于制備病理切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色分析(用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)改變)。 剩余肝臟剪取0.5 g放入冷的生理鹽水中，使用勻漿機(jī)2 000 r·min-1勻漿10 min，制備10%(肝組織/生理鹽水)的肝組織勻漿，置于4 ℃ 冰箱中保存，用于檢測(cè)肝組織中MDA (nmol·mg-1)，GSH-Px (mg·g-1)以及SOD (U·mg-1)的含量，所有生化指標(biāo)的檢測(cè)均按試劑盒的要求進(jìn)行測(cè)試。

3 結(jié)果與分析

3.1祁門(mén)紅茶多酚中總酚含量

3.1.2Foling-Ciocalteu法方法學(xué)評(píng)價(jià) 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 祁門(mén)紅茶多酚提取物按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液和2.2.4項(xiàng)下方法顯色后測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算祁門(mén)紅茶中茶多酚含量，RSD為2.5%，說(shuō)明本方法重復(fù)性較好。

加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取不同質(zhì)量的祁門(mén)紅茶多酚提取物，置于100 mL錐形瓶中，分別加入一定量的沒(méi)食子酸對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，再按2.2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理、測(cè)定、計(jì)算結(jié)果。見(jiàn)表1。茶多酚平均回收率為99.32%，RSD為1.82%，說(shuō)明本方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表1 總茶多酚的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2祁門(mén)紅茶多酚對(duì)小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量影響及肝指數(shù)(HI)的影響 結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，模型組相比較正常組，體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝指數(shù)均有明顯的增加(P<0.05)。當(dāng)給藥量增加至800 mg·kg-1時(shí)，小鼠的肝質(zhì)量及肝指數(shù)與陽(yáng)性組小鼠指標(biāo)存在顯著性差異(P<0.05)。

表2 祁門(mén)紅茶多酚對(duì)小鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝指數(shù)的影響

3.3祁門(mén)紅茶多酚對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠的影響 詳見(jiàn)表3。由表3 可知，各組小鼠預(yù)先經(jīng)過(guò)KBTP灌胃給藥400和800 mg·kg-1，然后腹腔注射CCl4，小鼠血清中ALT，AST及ALP含量明顯下降，肝組織中MDA含量降低，GSH-Px及SOD含量明顯升高，與CCl4模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明：祁門(mén)紅茶多酚具有肝保護(hù)作用，且具有一定的劑量依賴關(guān)系。

表3 祁門(mén)紅茶多酚對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清中ALT，AST及ALP活性和肝組織中MDA，GSH-Px及SOD含量的影響

3.4祁門(mén)紅茶多酚對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響 如圖1，病理學(xué)觀察顯示：正常組(A)小鼠肝臟呈現(xiàn)暗紅色，質(zhì)地柔軟且富有彈性，光澤度良好，肝小葉結(jié)構(gòu)完整。病理切片顯示：肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、完整，細(xì)胞核圓潤(rùn)；與之形成鮮明對(duì)比的是模型組(B)小鼠肝臟顏色灰白，質(zhì)地、彈性較差，且有多個(gè)乳白色斑點(diǎn)，肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，病理切片顯示肝細(xì)胞排列分散、無(wú)序，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細(xì)胞質(zhì)較少，細(xì)胞核固縮。通過(guò)觀察表明，提前給予不同劑量的祁門(mén)紅茶多酚，使肝臟均受到一定程度的保護(hù)，異常肝細(xì)胞的數(shù)量明顯減少；E與F病理切片顯示，預(yù)先經(jīng)過(guò)高劑量祁門(mén)紅茶多酚和聯(lián)苯雙酯滴丸陽(yáng)性藥物的分別保護(hù)，小鼠肝細(xì)胞排列規(guī)則，形態(tài)基本正常，病變細(xì)胞數(shù)目很少，結(jié)構(gòu)與正常組無(wú)明顯區(qū)別，表明祁門(mén)紅茶多酚對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷具有較好的保護(hù)作用。

圖1 肝臟的病理組織學(xué)切片(HE染色，×400)

4 討論

茶多酚具有清除自由基的生物活性功能，是基于其酚羥基作為H供體，能與自由基結(jié)合成共軛穩(wěn)定的中間體產(chǎn)生清除及阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[10]。作為一個(gè)引發(fā)肝損傷的試劑， CCl4早已被認(rèn)同。在肝藥酶P450的作用下，CCl4可轉(zhuǎn)化為·CCl3，而·CCl3本身就是一種自由基，能夠直接殺傷肝細(xì)胞。且它還能引發(fā)細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。ALT和AST含量的升高是衡量肝臟損傷最為直接、準(zhǔn)確的指標(biāo)，在本實(shí)驗(yàn)中，注射四氯化碳后，模型組小鼠ALT及AST的含量迅速升高(P<0.05)，表明肝臟受到損傷，通過(guò)預(yù)先給予祁門(mén)紅茶多酚保護(hù)，小鼠血清中ALT及AST的含量有明顯的下降，血清中ALP水平亦是如此，這表明祁門(mén)紅茶多酚能夠有效抑制肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。肝組織中MDA、GSH-Px及SOD相應(yīng)含量的變化表明，祁門(mén)紅茶多酚不僅能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，還能保護(hù)線粒體膜。肝臟病理組織切片觀察發(fā)現(xiàn)：預(yù)先給予祁門(mén)紅茶多酚的小鼠肝細(xì)胞形態(tài)良好，無(wú)明顯畸變，這表明祁門(mén)紅茶多酚對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝臟損傷具有明顯的保護(hù)作用。這一系列的結(jié)果表明，對(duì)祁門(mén)紅茶作為藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用具有廣闊的應(yīng)用前景。

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