當歸總黃酮提取方法比較及工藝條件優(yōu)化

劉芳， 楊躍寰， 楊王霖

(四川理工學院生物工程學院， 四川自貢643000)

當歸總黃酮提取方法比較及工藝條件優(yōu)化

劉芳， 楊躍寰， 楊王霖

(四川理工學院生物工程學院， 四川自貢643000)

對當歸總黃酮進行提取，比較其提取方法，優(yōu)化其最適提取方法的工藝條件。試驗分別采用水煎煮法、乙醇回流法、超聲波提取法對當歸總黃酮進行提取，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定總黃酮含量，采用正交試驗優(yōu)化提取工藝條件。試驗結(jié)果表明：乙醇回流法為當歸總黃酮的最適提取方法，當提取溫度85 ℃、提取時間2.0 h、料液比1∶30、乙醇濃度80%時，得當歸總黃酮含量為10.066 mg·g-1，比優(yōu)化前提高了59.52%。試驗較為完整地對當歸總黃酮的提取方法和提取條件進行了研究，可為開發(fā)和利用當歸總黃酮提供理論依據(jù)。

當歸；總黃酮；提取

引言

當歸(Angelicasinensis)的化學成分主要有多糖類、苯酞類、香豆素類、阿魏酸鈉、黃酮類、揮發(fā)油類化合物及其他成分[1-2]。研究表明，從當歸中分離到的黃酮類化合物具有抑制NO生成、抗氧化和抑菌殺菌等作用[3-5]。黃酮類化合物的提取方法眾多，主要有溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法、酶解法、超臨界流體萃取法、雙水相萃取分離法、半仿生提取法等[6-10]。日前已有研究者開始探索當歸總黃酮提取工藝，如王芙蓉[4]、李谷才[5]等，但均采用醇提法。本研究分別采用水煎煮法、乙醇回流法、超聲波提取法對當歸總黃酮進行提取，比較其提取方法，優(yōu)化其最適提取方法的工藝條件，旨為進一步開發(fā)和利用當歸總黃酮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 原料與試劑

當歸粉：市售；其他試劑：均為分析純。

1.1.2 主要設備及儀器

DK-98-1水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；RE52CS/B-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；UP400S手提式超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；WFJ7200紫外可見風光光度計：上海無尼柯儀器有限公司；回流裝置、圓底燒瓶、容量瓶、移液管、試管等：均為微生物實驗室常規(guī)儀器。

1.2方法

1.2.1 當歸總黃酮提取液的制備

水煎煮法：稱取1 g當歸粉于圓底燒瓶，加入25 mL蒸餾水于其中，浸泡20 min后，保持沸騰回流1 h，冷卻后抽濾得濾液，濾渣再次加入25 mL蒸餾水浸泡20 min后沸騰回流1 h，冷卻抽濾，合并濾液。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至僅剩5 mL，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋定容至刻度，得提取液。

乙醇回流法：采用75%的乙醇，提取溫度70 ℃，其他方法和條件同水煎煮法。

超聲波提取法：超聲波功率50 W，其他方法和條件同乙醇回流法[11]。

1.2.2 提取液中總黃酮含量的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測提取液中總黃酮含量，用蘆丁標準品繪制標準曲線[5]，按標準曲線制備步驟操作，測定提取液的吸光度，根據(jù)吸光度在蘆丁標準曲線上查找對應的蘆丁濃度，計算出提取液總黃酮濃度。1 g當歸中所含總黃酮量計算公式為：

式中：C—總黃酮濃度(mg·mL-1) 100—提取液的總體積(mL)m—提取所用原料質(zhì)量(g)

1.2.3 當歸總黃酮最適提取方法的確定

比較水煎煮法、乙醇回流法、超聲波提取法提取液中總黃酮含量，確定出當歸總黃酮的最適提取方法。

1.2.4 最適提取方法工藝條件的優(yōu)化

通過單因素試驗和正交試驗，對最適提取方法的工藝條件進行優(yōu)化，確定出最佳工藝參數(shù)。

1.2.5 驗證試驗

考察最佳工藝的穩(wěn)定性和合理性，在優(yōu)化組合條件下進行3次平行試驗，分別測定當歸中總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1測定波長的選擇和標準曲線的繪制

在紫外分光光度計的波長范圍內(nèi)掃描，得在509 nm處吸光度最大，因此試驗所用吸光度測定波長為509 nm。蘆丁標準曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2最適提取方法的確定

分別測定三種提取方法提取液中當歸總黃酮含量，每種方法平行三次，取平均值，測定結(jié)果見表1。

表1 三種提取方法當歸總黃酮含量

由表1可知，提取方法不同，提取效果也不一樣，采用乙醇回流提取當歸中總黃酮，其總黃酮含量最高，故確定乙醇回流法為當歸總黃酮的最適提取方法，并優(yōu)化其提取條件。

2.3單因素試驗

乙醇回流提取過程中，對提取效果影響較大的因素主要有乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間等。以乙醇濃度75%、料液比1∶25、提取溫度70 ℃、提取時間1 h為初始提取條件。

2.3.1 乙醇濃度對提取液中總黃酮含量的影響

分別測定乙醇濃度為70%、75%、80%、85%、90%、95%時當歸總黃酮含量，其他因素為初始水平。測定結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對總黃酮含量的影響

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，當歸總黃酮含量增加，乙醇濃度為85%時總黃酮含量達到峰值，但隨著乙醇濃度的進一步增加，總黃酮含量反而降低，可能是由于不同濃度的乙醇所提取的黃酮種類和含量不同，也可能是高濃度的乙醇更利于當歸中其他成分的提取，從而影響了吸光度的測定值。因此初步確定乙醇濃度為85%。

2.3.2 料液比對提取液中總黃酮含量的的影響

分別測定料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45時當歸總黃酮含量，乙醇濃度85%，提取溫度和提取時間不變。測定結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對總黃酮含量的影響

由圖3可知，隨著料液比的增加，當歸總黃酮含量增加，料液比為1∶30時總黃酮含量達到峰值，但隨著料液比的進一步增加，總黃酮含量反而降低，這可能是料液比增加到1∶30時，當歸中總黃酮與溶劑乙醇之間已達到平衡，當料液比進一步增加反而使溶質(zhì)中的其他物質(zhì)溶解增加，而使相應的吸光度降低。因此初步確定料液比為1∶30。

2.3.3 提取溫度對提取液中總黃酮含量的影響

分別測定提取溫度為65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃時當歸總黃酮含量，乙醇濃度85%，料液比1∶30，提取時間不變，測定結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對總黃酮含量的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的增加，當歸總黃酮含量增加，提取溫度為80 ℃時總黃酮含量達到峰值，但隨著提取溫度的進一步升高，總黃酮含量反而降低，可能是由于溫度過高導致總黃酮結(jié)構遭到破壞，也可能是高溫更有利于當歸中其他成分溶出，而影響了吸光度的測定結(jié)果。因此初步確定提取溫度為80 ℃。

2.3.4 提取時間對提取液中總黃酮含量的影響

分別測定提取時間為0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h時當歸總黃酮含量，乙醇濃度85%，料液比1∶30，提取溫度80 ℃。測定結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取時間對總黃酮含量的影響

由圖5可知，隨著提取時間的增加，當歸總黃酮含量增加，提取時間為1.5 h時總黃酮含量達到峰值，但隨著提取時間的進一步增加，總黃酮含量反而降低，可能是由于提取時間過長導致當歸總黃酮被氧化，也可能是當歸中其他成分被溶出，干擾了吸光度的測定。因此初步確定提取時間為1.5 h。

2.4正交試驗

以提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度為4個因素，以單因素試驗的最適值和左右值設置3個水平進行L9(34)的正交試驗，通過正交試驗最終確定乙醇回流提取當歸總黃酮的最佳工藝條件。L9(34)因素水平見表2，試驗結(jié)果見表3。

表2 正交試驗因素和水平

表3 正交試驗結(jié)果

由表3的極差R可知，四因素對當歸總黃酮含量的影響大小是B>C>A>D，即提取時間影響最大，其次是料液比，再次是提取溫度，而乙醇濃度對當歸總黃酮含量的影響最小。從k值可以看出，乙醇回流提取當歸總黃酮的最佳工藝條件為：A3B3C2D1，即提取溫度85 ℃、提取時間2.0 h、料液比1∶30、乙醇濃度80%。

2.5驗證試驗

在最佳工藝條件下采用乙醇回流法提取當歸總黃酮，平行操作三次，求平均值，測定結(jié)果見表4。

表4 最佳提取工藝條件下當歸總黃酮的含量(mg·g-1)

由表4可知，在最佳工藝條件下對當歸總黃酮進行提取，得當歸總黃酮平均含量為10.066 mg·g-1，與正交試驗結(jié)果一致，比優(yōu)化前提高59.52%。三次驗證試驗說明此最佳工藝條件具有合理性和穩(wěn)定性。

3 結(jié)束語

試驗采用水煎煮法、乙醇回流法、超聲波提取法對當歸總黃酮進行提取，得乙醇回流法為當歸總黃酮的最適提取方法，其最佳工藝條件為：提取溫度85 ℃、提取時間2.0 h、料液比1∶30、乙醇濃度80%。在最佳工藝條件下提取當歸總黃酮，得當歸總黃酮含量為10.066 mg·g-1，比優(yōu)化前提高59.52%，比文獻[4]提高6.39%。驗證試驗表明此最佳工藝條件具有合理性和穩(wěn)定性。試驗較為完整的對當歸總黃酮的提取方法和提取條件進行了研究，可為開發(fā)和利用當歸總黃酮提供理論依據(jù)。

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[11] 植物材料中總黃酮分離提取.百度文庫[EB/OL].(2010-12-23)http://wenku.baidu.com/view/ 3e04f980e5 3a580216fcfe1e.html.

A Comparison of the Extraction Methods of Total Flavonoids FromAngelicaSinensisand the Optimization of Processing Conditions

LIUFang,YANGYuehuan,YANGWanglin

(School of Bioengineering, Sichuan University of Science & Engineering, Zigong 643000, China)

The total flavonoids is extracted fromAngelicasinensis, the extraction methods are compared, and the processing conditions of the optimum extraction method are optimized. Tests are carried out by using boiling water extraction method, ethanol refluxing method and ultrasonic extraction method to extract total flavonoids fromAngelicasinensis, and the concentration of total flavonids is determined by sodium nitrite-aluminum nitrate and sodium hydroxide method, then the processing conditions of extraction are optimized by orthogonal test. The test results show that the ethanol refluxing method can get the highest total flavonoids content fromAngelicasinensiswhen extraction temperature is 85 ℃, extraction time is 2.0 h, ratio of solid to liquid is 1∶30, alcohol concentration is 80% and the content of total flavonoids extracted fromAngelicasinensisat this time is 10.066 mg.mL-1，which is 59.52% higher than that before optimization. The tests are studied relatively well on extraction method and extraction conditions of total flavonoids ofAngelicasinensis, which can provide a theoretical basis for the development and utilization of the total flavonoids ofAngelicasinensis.

Angelicasinensis; total flavonoids; extraction

2014-09-26

四川省教育廳自然科學重點項目(11ZA260)；四川省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201410622024)

劉 芳(1966-)，女，四川自貢人，教授，主要從事食品微生物方面的的研究，(E-mail)sy5162524@sina.com

1673-1549(2014)06-0005-04

10.11863/j.suse.2014.06.02

R284.2

A