黃精有效成分的提取及其氧化活性的檢測

劉小陽

宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州，234000

黃精有效成分的提取及其氧化活性的檢測

劉小陽

宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州，234000

依次利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，再用大孔樹脂進行分離，獲得黃精的有效成分。然后利用體外無細胞體系，對黃精的不同萃取物進行無細胞體系抗氧化活性檢測。不同有機相提取物中的自由基(DPPH)和超氧陰離子(O2-)的清除能力以及黃嘌呤氧化酶活性抑制作用的檢測結(jié)果表明，三種有機相提取物與抗氧化活性之間存在良好的構(gòu)效關(guān)系。

黃精；有效成分；抗氧化

1 問題的提出

黃精為百合科黃精屬植物黃精(Polygonatumsibiricum)、滇黃精(P.kingianum)、多花黃精(P.cyrtonema)和長梗黃精(P.filipes)的根莖，是一種藥食同源的傳統(tǒng)中草藥[1]。黃精味甘、性平，具有補中益氣、潤心肺、補腎益精、強筋骨、安五臟、止寒熱、填精髓等功效。黃精主要含有成分為多糖和皂苷等活性成分[2-3]。其中，主要活性成分為黃精多糖(PSP)。藥理研究表明，黃精多糖能夠增強免疫功能、降低血糖、降低血脂、抗動脈粥樣硬化、延緩衰老、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等多種生物學活性，目前已有大量有關(guān)黃精多糖降血糖功能的報道[4]。為了進一步開發(fā)利用黃精的藥用價值，本研究采用有機溶劑萃取并結(jié)合大孔樹脂吸附，提取黃精中的主要活性成分多糖和皂苷，并測定其含量，同時檢測其藥理活性，為黃精的藥理學研究奠定前期基礎(chǔ)。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

RV-605型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；Multiskan GO型酶標儀(美國Thermo公司)；Diaion HP-20型大孔樹脂(日本三菱合成化學工業(yè)公司)；752型紫外可見分光光度計(上?，F(xiàn)科儀器有限公司)；BCD-206SVES型海爾冰箱(青島海爾集團)。

薯蕷皂苷標準品由中國藥品生物制品檢驗所生產(chǎn)，質(zhì)量分數(shù)均≥99.6%；葡萄糖標準品由上?；瘜W試劑公司生產(chǎn)；試劑乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯均為分析純，購自中國上?；瘜W試劑公司；實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品制備

選用從市場購得的優(yōu)質(zhì)黃精塊根(購自宿州市中藥材有限責任公司)，切成長0.5 cm左右的小塊，放置于鼓風干燥箱中在45℃恒溫條件下烘干12 h，然后將溫度升至60℃繼續(xù)烘干8 h后取出。利用粉碎機將其粉碎，粉碎后呈灰黃色粉末狀，在干燥箱中60℃下干燥2 h至恒重，備用。稱取約1 kg黃精粉，用80%乙醇溶解，室溫下提取72 h。將上一步得到的浸提液經(jīng)真空抽濾，得到濾液和濾渣，收集濾液A；將濾渣再用80%乙醇溶解，同樣條件下重復浸提，再次真空抽濾，得到濾液B。

2.2.2 有機溶劑萃取

將總濾液(A+B)經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，在適當轉(zhuǎn)速下，溫度從室溫慢慢上升至78℃，得到濃縮液C。將濃縮液C置于分液漏斗中，用等體積的石油醚萃取，得到水相和石油醚相，收集石油醚相。將水相再次倒入分液漏斗，用等體積的乙酸乙酯萃取，得到水相和乙酸乙酯相，收集乙酸乙酯相。將水相再次倒入分液漏斗，用等體積的正丁醇萃取，得到水相和正丁醇相，收集正丁醇相。這樣，分別得到水相、正丁醇相、乙酸乙酯相、石油醚相。將上述四相液體分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮得4種相的濃縮液。

2.2.3 分離純化

將大孔樹脂進行預處理、裝柱，然后將上述方法得到的水相和3個有機相進行過柱吸附，用70%乙醇洗滌樹脂，控制流速為每分鐘床層體積的1/25左右，用量為床層體積的5倍，得洗脫液。此步驟分別得到4種過柱液與4種洗脫液。將得到的4種洗脫液與過柱液分別合并，濃縮，冷凍干燥，得到各有機相成分粉劑。

2.2.4 多糖含量分析

2.2.4.1 標準曲線的建立

稱取葡萄糖50 mg，溶解并定容至50 mL容量瓶中，得葡萄糖標準溶液(1 mg/mL)。精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mL的葡萄糖標準溶液，搖振，靜置30 min，于490 nm處測定吸光度。重復測定3次，取平均值。以葡萄糖標準品質(zhì)量x(mg)為橫坐標，吸光度y為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程。

2.2.4.2 多糖含量的測定

精密稱取各有機相黃精提取物約3 mg，置50 mL量瓶中，加雙蒸水溶解定容，離心，取其上清液檢測，與標準曲線對照得多糖含量。

2.2.5 薯蕷皂苷標準曲線制作

2.2.5.1 薯蕷皂苷標準溶液的配制

稱取干燥至恒重的薯蕷皂苷標準品100 μg，置100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容，搖勻，配制成濃度為1 mg·L-1的標準溶液[5]，備用。

2.2.5.2 標準曲線的制作

將薯蕷皂苷標準液分別配成0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1，分別在326 nm處測定吸光值，得線性回歸方程。

2.2.6 各有機相提取物抗氧化活性檢測

2.2.6.1 清除DPPH自由基的活性檢測

首先向96孔酶標板中加入160 μL 50 μmol/L DPPH自由基的甲醇液，進而加入40 μL各有機溶劑提取物，空白對照用等量的溶劑所代替，總體積為200 μL。每個處理3個重復，搖勻后于室溫下放置30 min，517 nm處測定吸光值(A0為空白對照值，AS為試樣測定值)，用160 μL甲醇與40 μL試樣混合液調(diào)儀器零點，以扣除樣品本身顏色的影響。清除率(C)按下式計算[6]：

C=[(A0-AS)/A0]×100%

2.2.6.2 超氧陰離子自由基的清除或產(chǎn)生能力的檢測

采用黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)檢測超氧陰離子產(chǎn)生/清除能力。加入電子傳遞物質(zhì)Gress氏顯色劑，利用酶標儀測定吸光度。操作按照檢測試劑盒說明書進行，每個處理樣品做3個重復。

2.2.6.3 黃嘌呤氧化酶抑制活性檢測

稱取黃嘌呤(XA)15.21 mg樣品溶于10 mL的PBS中，調(diào)pH值至7.8作為儲備液，濃度為10 mM，將50 μM的黃嘌呤和0.1 U的黃嘌呤氧化酶加上不同質(zhì)量濃度的提取液，反應液的總體積為500 μL，在25℃的水浴中反應10 min，空白對照用PBS代替。在295 nm波長處檢測吸光值。抑制率(I)按下式計算[7]：

I=(1-AS/A0)×100%

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3 結(jié)果與討論

3.1 黃精提取物中多糖和總皂苷含量的測定

3.1.1 多糖含量

根據(jù)葡萄糖標準曲線得到回歸方程y=0.160 2x-0.02，R2=0.999 5，見圖1。表明葡萄糖在0.02～0.1 mg范圍內(nèi)與吸光度成良好的線性關(guān)系。根據(jù)葡萄糖標準曲線所得的回歸方程計算各提取物中多糖含量，見表1。

圖1 葡萄糖的標準曲線

表1 各萃取相過柱液葡萄糖的檢測結(jié)果

3.1.2 皂苷含量

根據(jù)薯蕷皂苷標準曲線得到回歸方程為y=0.084 1x+0.021 1，R2=0.999 2，表明薯蕷皂苷在0.04～0.2 mg·mL-1范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(圖2)。根據(jù)薯蕷皂苷標準曲線所得的回歸方程計算得到各提取物中皂苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 各有機相總皂苷含量的測定

圖2 薯蕷皂苷標注曲線

3.2 三種提取物不同濃度對DPPH自由基的清除率

乙酸乙酯相和正丁醇相提取物對DPPH產(chǎn)生的自由基有清除作用，活性呈劑量依賴性增強。正丁醇相提取物的活性高于乙酸乙酯相提取物的活性。石油醚相提取物未表現(xiàn)出自由基清除能力(表3)。

表3 三種有機相提取物對DPPH自由基的清除率/%

注：ND表示無DPPH自由基清除。

3.3 對超氧陰離子自由基的清除的檢測

實驗結(jié)果表明，石油醚提取物和乙酸乙酯提取物對黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系所產(chǎn)生的自由基均沒有清除效果。正丁醇相提取物對自由基具有一定的清除作用，而且呈劑量依賴性增加(圖3)。

圖3 三種有機相提取物在XA/XO體系中超氧陰離子的清除率

3.4 三種有機相提取物對黃嘌呤氧化酶酶活影響的檢測

在三種有機相提取物中，正丁醇相提取物在黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶反應體系中能夠抑制尿酸的生成，說明總皂苷對黃嘌呤氧化酶具有一定的抑制作用。且在150 μg·mL-1和200 μg·mL-1時的抑制率分別為42.3%和46.2%。而石油醚相和乙酸乙酯相提取物在檢測濃度范圍內(nèi)沒有檢測到對黃嘌呤氧化酶的抑制作用(圖4)。

圖4 三種有機相提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

4 結(jié) 論

采用大孔樹脂吸附法提取了黃精的有效化學成分，并對多糖和皂苷的含量進行了測定，結(jié)果表明，多糖大部分被除去，而總皂苷的量隨著有機溶劑極性的增加，含量增加，并且獲得了良好的收率。

有研究表明，黃精可以調(diào)控和增強免疫系統(tǒng)，具有延緩衰老、減少自由基損傷的作用。因此，本研究進一步對三種有機相提取物進行了體外無細胞體系抗氧化活性研究，結(jié)果表明乙酸乙酯相和正丁醇相提取物具有明顯的抗氧化活性，這為黃精中單一活性組分的研究提供了一定的理論依據(jù)。

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[3]張亮．不同產(chǎn)地黃精中微量元素的主成分分析[J]．微量元素與健康研究，2009，26(6):19-21

[4]王海敏，虞海霞，董蕊，等．苕子蜜總酚酸和總黃酮含量測定及抗氧化活性的研究[J]．食品科學，2010(1): 54-58

[5]王光忠，劉偉偉，葛如斌，等．分光光度法測定盾葉薯蕷薯蕷皂苷的含量[J]．湖北中醫(yī)學院學報，2008(2):44-45

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(責任編輯：汪材印)

2014-07-28

宿州學院教授(博士)科研啟動基金項目(szxyjb201206)。

劉小陽(1964-)，安徽懷寧人，教授，碩士生導師，主要研究方向：細胞與分子生物學。

10.3969/j.issn.1673-2006.2014.12.024

R284.2

A

1673-2006(2014)12-0082-03