CLCN3/MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠雜交群體的建立及鑒定

鄧璐璐, 李琴, 吳慧, 毛建文，徐彬

(1.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣州 510006；

2.廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州 510006；

3.貴州省六盤水市人民醫(yī)院，貴州 六盤水 553001)

離子通道如K+、Cl-和 Na+通道的高表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)，進(jìn)一步促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,特別是氯離子通道在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中扮演了重要的角色[1]。ClC氯通道(ClC chloride channel)是一類電壓門控性氯通道，目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)九種家族成員，其中ClC-3是備受關(guān)注的一種。在乳腺癌組織中、人膠質(zhì)瘤中氯離子通道ClC-3的表達(dá)都明顯高于正常組織，并且不同惡性程度之間有明顯差異，提示了ClC-3可能在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起了重要作用[2, 3]。

近年的研究報(bào)道，細(xì)胞膜上的ClC-3介導(dǎo)了細(xì)胞的premitotic condensation(PMC)過(guò)程，參與細(xì)胞周期調(diào)控[4, 5]。Zuo[6]用氯離子通道阻斷劑NPPB抑制H2O2激活的氯電流，減少PC12細(xì)胞的凋亡，提示與容積調(diào)控相關(guān)的氯通道ClC-3可能參與腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程。我們的研究也發(fā)現(xiàn)ClC-3在鼻咽癌細(xì)胞中作為容積激活性氯離子通道，通過(guò)調(diào)節(jié)容積激活性氯離子電流促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，且發(fā)現(xiàn)阻斷容積激活性氯離子通道以及下調(diào)ClC-3的表達(dá)都成功抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移，進(jìn)一步表明了ClC-3與腫瘤細(xì)胞遷移密切相關(guān)[7-9]。這些結(jié)果從細(xì)胞水平上提示ClC-3可能參與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移的調(diào)控，但ClC-3在體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用尚未明確。因此，內(nèi)源性過(guò)表達(dá)ClC-3的轉(zhuǎn)基因小鼠為此方向的研究提供了不可替代的作用。本研究把CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠和MMTV-PyMT自發(fā)性乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，構(gòu)建了內(nèi)源性ClC-3過(guò)表達(dá)的自發(fā)乳腺腫瘤小鼠模型，為進(jìn)一步研究ClC-3在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移特別是乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面的研究提供合適的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ClC-3過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠委托Cyagen Biosciences公司構(gòu)建，編號(hào)為TGS120401AH01。質(zhì)粒名稱為pLV.EX3d.P/neo-EF1A> CLCN3 >IRES/eGFP，攜帶GFP綠色熒光蛋白。2只15～20周齡雄性MMTV-PyMT小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究院【SCXY(蘇)2010-0001】，品系為FVB/N-Tg,634 Mul/J。同時(shí)購(gòu)進(jìn)2只雌性野生型FVB鼠用于保種擴(kuò)群。SPF環(huán)境飼養(yǎng)【SYXK(粵)2012-0125】，每天紫外2 h，溫度22～28℃，濕度 40%～60%，晝夜交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

真空包裝飼料、墊料購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，鼠尾試劑盒(CW2094)購(gòu)于康為世紀(jì)有限公司, Taq 酶(DRR037S)、DNA marker DL1000 (D526A)、瓊脂糖購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。小鼠鑒定引物均由上海Invitrogen 公司合成(表 1)。免疫染色固定液(P0098)、免疫染色洗滌液(P0106)，免疫染色一抗稀釋液(P0103)、免疫染色二抗稀釋液(P0108)，免疫染色抗熒光淬滅封片液(P0126)、Alexa Fluor488標(biāo)記山羊抗兔IG(H+L)(A0423)、GAPDH鼠源一抗(AG019-1)均購(gòu)于碧云天，ClC-3兔源一抗(ab28736)購(gòu)于Abcam，羊抗鼠二抗(H2311)、羊抗兔二抗(CO211)購(gòu)于Biotechnology公司，蛋白裂解液(K0301)購(gòu)于Thermo公司。

1.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的整合檢測(cè)

PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型。剪取三周齡小鼠尾尖，采用鼠尾DNA提取試劑盒提取基因組DNA，利用MMTV-PyMT和ClC-3特異性引物(如表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系分別加入PCR Mix酶25 μL, PCR引物各1 μL，模板DNA 1μg，ddH2O加到50 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，退火64℃ 1min，延伸72℃ 1min，循環(huán)35次，72℃延伸2 min，4℃保存。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.4 組織免疫熒光檢測(cè)

石蠟切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水浸泡2次，每次5 min，微波抗原修復(fù)，單蒸水洗3次，每次5min。滴加 3% H2O2，室溫孵育 15 min，PBS 洗滌 3 次，每次 5 min。滴加即用型5% BSA封閉液，室溫孵育40 min，棄去封閉液。滴加ClC-3抗體(1∶100稀釋)，濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。復(fù)溫40 min，PBS洗3次，每次5 min，滴加CY3-抗兔/鼠IgG二抗，室溫孵育1 h，PBS洗5次每次5 min，再加入DAPI復(fù)染核，PBS洗5次，每次5 min。滴加抗熒光猝滅劑封片液，封片，自然晾干。

表1 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定引物序列

1.5 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交群體的構(gòu)建

選取2-3月齡MMTV-PyMT雄性小鼠和CLCN3雌性轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行配對(duì)，喂食高壓滅菌過(guò)的生瓜子，記錄其分娩時(shí)間。其生育的為F1代雜交鼠，待3周后剪鼠尾提取DNA, PCR鑒定基因型，其中有MMTV-PyMT和CLCN3雙轉(zhuǎn)陽(yáng)性小鼠、MMTV-PyMT單轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠，也有CLCN3單轉(zhuǎn)陽(yáng)性小鼠。再選取同窩MMTV-PyMT陽(yáng)性雄性小鼠和CLCN3陽(yáng)性雌性轉(zhuǎn)基因小鼠同胞兄妹交配，擴(kuò)大種群。

1.6 蛋白印跡分析

分別通過(guò)組織勻漿提取同窩MMTV-PyMT單轉(zhuǎn)基因鼠和MMTV/CLCN3雙轉(zhuǎn)基因鼠、陰性對(duì)照小鼠的肺組織蛋白，然后進(jìn)行10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，積層膠70 V 30 min，分離膠120 V 90 min，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，350 mA 90 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束用5%脫脂奶粉封閉2h。沿Marker70 ×103處剪開(kāi)，大于70 ×103加入ClC-3抗體(1∶1000稀釋)，小于70 ×103的加入GAPDH單克隆抗體(1∶1000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，回收一抗，TBST洗5次每次5 min，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，回收二抗，TBST洗膜5次每次5 min，加入發(fā)光液，膠片顯影曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 MMTV與CLCN3轉(zhuǎn)基因鼠的培育與鑒定

首先用引種的MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因雄鼠和FVB雌鼠進(jìn)行1∶1比例配對(duì)(F0代)，其生育的小鼠為F1代幼鼠，3周后剪取鼠尾提取DNA，經(jīng)過(guò)加入特異性引物PCR擴(kuò)增目的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像，準(zhǔn)確檢測(cè)到子代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠，再選取同窩子代陽(yáng)性雄鼠和陰性雌鼠進(jìn)行同胞交配，擴(kuò)大種群。至今共育子代MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠共50多只。CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠用同樣的方法也進(jìn)行全同胞交配，至今共培育子代80多只。MMTV-PyMT陽(yáng)性小鼠在556 bp處有明顯條帶，CLCN3陽(yáng)性小鼠在440 bp處出現(xiàn)條帶，200 bp為內(nèi)參基因，部分結(jié)果如圖1。

注：1～7： MMTV-PyMT引物(556 bp)；8～11：檢測(cè)CLCN3引物(440 bp)。

2.2 CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠蛋白表達(dá)免疫熒光分析

CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建質(zhì)粒為pLV.EX3d.P/neo-EF1A> CLCN3 >IRES/eGFP，為了驗(yàn)證CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠是否表達(dá)ClC-3蛋白，選取同窩CLCN3單轉(zhuǎn)陽(yáng)性小鼠和雙陰性小鼠處死解剖，取肺，制作石蠟切片，進(jìn)行組織免疫熒光分析，由于其質(zhì)粒中攜帶GFP基因，所以在構(gòu)建成功的前提下組織中表達(dá)綠色熒光蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠在肺組織中(圖2A)明顯表達(dá)ClC-3蛋白和綠色熒光蛋白，而同窩陰性小鼠肺組織(圖2B)中僅見(jiàn)支氣管上皮細(xì)胞少量表達(dá)ClC-3。圖2見(jiàn)彩插10。

2.3 MMTV-PyMT與CLCN3轉(zhuǎn)基因鼠雜交群體的建立

選取2～3月齡MMTV-PyMT陽(yáng)性雄鼠和CLCN3陽(yáng)性雌鼠配對(duì)(雜交圖譜如圖3)，8周后產(chǎn)仔8～12只，剪取鼠尾提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，若同一只老鼠MMTV-PyMT和CLCN3分別都出現(xiàn)條帶，則為雙轉(zhuǎn)基因鼠陽(yáng)性鼠(圖1)。共育MMTV-PyMT和CLCN3雙轉(zhuǎn)基因雜交子代小鼠約100多只。

2.4 ClC-3蛋白的組織器官的表達(dá)分析

為了驗(yàn)證高度轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤和ClC-3蛋白表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)，選取同一胎的CLCN3單轉(zhuǎn)陽(yáng)性小鼠、MMTV-PyMT /CLCN3雙轉(zhuǎn)陽(yáng)性小鼠和雙陰性小鼠的肺組織，采用組織勻漿法提取蛋白，Western-blot方法檢測(cè)ClC-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示MMTV-PyMT /CLCN3雙轉(zhuǎn)陽(yáng)性小鼠的ClC-3蛋白含量明顯高于同窩的MMTV-PyMT單轉(zhuǎn)陽(yáng)性小鼠(圖4)。

圖3 MMTV-PyMT與CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠雜交群體建立示意圖

注：MMTV-PyMT相對(duì)于陰性小鼠*P<0.05，MMTV-PyMT /CLCN3雙轉(zhuǎn)陽(yáng)性小鼠相對(duì)于陰性小鼠**P<0.01。

3 討論

ClC-3屬于ClC家族中的一員，推薦名為H+/Cl-exchange transporter 3, 基因符號(hào)為CLCN3。ClC-3通道蛋白有13個(gè)跨膜區(qū)域，N和C末端均位于細(xì)胞內(nèi)，其有短型和長(zhǎng)型之分，短型ClC-3蛋白由760個(gè)氨基酸構(gòu)成，在短型ClC-3蛋白氨基末端(N端)加上58個(gè)氨基酸殘基即構(gòu)成長(zhǎng)型ClC-3通道蛋白。廣泛分布于腦、腎、肝、骨骼肌、心臟、腎上腺和胰腺等組織。Jentsch[10,]和Suzuki[11]表明ClC-3可能作為容積激活性氯離子通道參與調(diào)節(jié)性細(xì)胞容積回縮(RVD)的調(diào)節(jié)。RVD被認(rèn)為是與細(xì)胞的增殖、分化、遷移及細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)的生理功能之一。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，ClC-3可通過(guò)調(diào)節(jié)容積激活性氯離子電流和RVD調(diào)控細(xì)胞的增殖和遷移過(guò)程[12-15]。提示ClC-3在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中有重要的作用。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的發(fā)展有30余年的歷史。該技術(shù)是把目的基因轉(zhuǎn)入早期胚胎細(xì)胞,使之能夠整合到染色體上,并且傳遞給子代,這樣獲得的動(dòng)物叫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[16]。轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)藥基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域。本研究所應(yīng)用的ClC-3高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠采用Gateway技術(shù)把目的基因CLCN3克隆到入門載體，不再依賴限制性內(nèi)切酶而靠載體上存在的特定充足位點(diǎn)和重組酶，高效、快速地把CLCN3克隆到目的載體中。該技術(shù)是一種通用性的克隆方法，簡(jiǎn)單便捷，用于基因的蛋白質(zhì)表達(dá)和功能分析[17]。ClC-3高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠質(zhì)粒名稱為pLV.EX3d.P/neo-EF1A> CLCN3 >IRES/eGFP，穩(wěn)定克隆到目的載體上，通過(guò)胚胎顯微注射法得到穩(wěn)定遺傳且高度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)鼠尾提取基因組DNA、再PCR擴(kuò)增目的片段，準(zhǔn)確快速的檢測(cè)到CLCN3基因高表達(dá)，而且在繁殖的后代中也穩(wěn)定遺傳。因?yàn)樵谫|(zhì)粒中攜帶GFP基因，所以組織中表達(dá)綠色熒光蛋白，所以采用組織免疫熒光的方法對(duì)肺組織進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性所攜帶的綠色熒光蛋白和ClC-3蛋白表達(dá)完全一致，表明CLCN3過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建成功。

MMTV-PyMT 自發(fā)乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)源于南京大學(xué)模式生物研究所，該小鼠9周自發(fā)乳腺腫瘤，12周后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。本研究成功構(gòu)建了ClC-3高表達(dá)的自發(fā)乳腺腫瘤小鼠模型，通過(guò)PCR技術(shù)和組織免疫熒光、Western blot方法準(zhǔn)確進(jìn)行鑒定，從基因表達(dá)水平和組織蛋白表達(dá)水平證實(shí)所得雜交小鼠成功整合CLCN3和MMTV-PyVT基因，并成功表達(dá)ClC-3蛋白，到目前為止培育雜交子代小鼠共100多只。該小鼠模型的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究ClC-3在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面的作用提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究ClC-3高表達(dá)對(duì)其他組織器官生理病理的影響提供實(shí)驗(yàn)材料基礎(chǔ)。

(本文圖2見(jiàn)彩插10。)

[1] Cuddapah VA, Sontheimer H.Ion channels and transporters in cancer.2.Ion channels and the control of cancer cell migration [J].Am J Physiol Cell Physiol.2011, 301(3): C541-549.

[2] 趙維, 王巖, 韓振國(guó), 等.氯離子通道ClC-3在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué).2009, 13(3):350-352.

[3] 徐冰, 羅祺, 王心蕊, 等.ClC-3在人膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及分布 [J].中國(guó)病理生理雜志.2005, 21(11): 2188-2191.

[4] Habela CW, Olsen ML, Sontheimer H.ClC-3 is a critical regulator of the cell cycle in normal and malignant glial cells [J].J Neurosci.2008, 28(37): 9205-9517.

[5] Habela CW, Sontheimer H.Cytoplasmic volume condensation is an integral part of mitosis [J].Cell Cycle.2007, 6(13):1613-1620.

[6] Zuo W, Zhu L, Bai Z, et al.Chloride channels involve in hydrogen peroxide-induced apoptosis of PC12 cells [J].Biochem Biophys Res Commun.2009, 387(4):666-670.

[7] Mao J, Chen L, Xu B, et al.Volume-activated chloride channels contribute to cell-cycle-dependent regulation of HeLa cell migration [J].Biochem Pharmacol.2009, 77(2): 159-168.

[8] Mao J, Chen L, Xu B, et al.Suppression of ClC-3 channel expression reduces migration of nasopharyngeal carcinoma cells [J].Biochem Pharmacol.2008, 75(9): 1706-1716.

[9] Mao J, Wang L.Fan A.et al.Blockage of volume-activated chloride channels inhibits migration of nasopharyngeal carcinoma cells [J].Cell Physiol Biochem.2007, 19(5-6): 249-258.

[10] Jentsch TJ, Stein V, Weinreich F, et al.Molecular structure and physiological function of chloride channels [J].Physiol Rev.2002, 82(2): 503-568.

[11] Suzuki M, Morita T, Iwamoto T.Diversity of Cl(-) channels [J].Cell Mol Life Sci.2006, 63(1): 12-24.

[12] Xu B, Mao J, Wang L, et al.ClC-3 chloride channels are essential for cell proliferation and cell cycle progression in nasopharyngeal carcinoma cells [J].Acta Biochim Biophys Sinica.2010, 42(6): 370-380.

[13] 陳麗新, 王立偉, 朱林燕, 等.Cl-在鼻咽癌細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積回縮中的作用 [J].中國(guó)病理生理雜志.2002, 18(5): 480-493.

[14] 王立偉, 陳麗新, 朱林燕, 等.抑制氯通道阻抑鼻咽癌細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖 [J].中國(guó)病理生理雜志.2004, 20(5): 715-718.

[15] Cuddapah VA, Habela CW, Watkins S, et al.Kinase activation of ClC-3 accelerates cytoplasmic condensation during mitotic cell rounding [J].Am J Physiol Cell Physiol.2012, 302(3): C527-538.

[16] Rossant J.Manipulating the mouse genome: implications for neurobiology [J].Neuron.1990.4(3):323-334.

[17] Hartley JL,Temple GF, Brasch MA.DNA cloning using in vitro site-specific recombination [J].Genome Res.2000, 10(11):1788-1795.