瓜實蠅卵巢的發(fā)育階段及分級

歐陽倩， 莫如江， 吳偉堅

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)研究室，廣東 廣州 510642

瓜實蠅Bactroceracucurbitae(Coquillett)又名“瓜蛆”，屬于雙翅目Diptera實蠅科Tephritidae，是瓜果類蔬菜上較為重要的一種害蟲。瓜實蠅起源于印度，廣泛分布于東南亞各國、夏威夷和所羅門群島(Dhillonetal.,2005；Huetal.,2008)，我國主要發(fā)生在廣東、廣西、福建、湖南、云南、貴州、四川、香港、臺灣等地(梁廣勤等,1989；張全勝,2002)。瓜實蠅寄主范圍廣，多達(dá)100多種，主要危害葫蘆科植物,如南瓜Cucurbitapepo(Duch)、苦瓜Momordicacharantia(L.)、黃瓜Cucumissativus(L.)、絲瓜Luffacylindrica(Roemer)、甜瓜Cucumismelo(L.)等(陳海東等,1995；Nishida & Bess,1950)。危害率可達(dá)50%以上(陳群航等，2005；張全勝,2002)，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

瓜實蠅雌蟲以產(chǎn)卵管刺入幼瓜表皮內(nèi)產(chǎn)卵，幼蟲孵化后即鉆進(jìn)瓜內(nèi)蛀食，老熟后鉆出爛瓜，入土化蛹。這些為害習(xí)性造成了該蟲產(chǎn)卵動態(tài)研究的困難。研究瓜實蠅卵巢的發(fā)育,一方面可以查清該蟲的產(chǎn)卵歷期,為分析該蟲在田間世代重疊的原因和年發(fā)生世代提供依據(jù)；另一方面可以通過分析環(huán)境因子對該蟲生殖方面的影響,為綜合治理工作提供新的思路。另外，系統(tǒng)解剖卵巢并確定其發(fā)育程度是昆蟲種群動態(tài)預(yù)測預(yù)報的重要方法之一(張孝羲等，1979)。

目前，有關(guān)雙翅目實蠅科昆蟲卵巢發(fā)育已有一定報道，如油橄欖實蠅Dacusoleae(Gmelin) (Fletcheretal.,1978)、東澳番茄實蠅Bactroceracacuminata(Hering) (Raghuetal.，2003)、加勒比按實蠅Anastrephasuspensa(Loew)(Kendraetal.,2006)和橘小實蠅Bactroceradorsalis(Hendel)(Chouetal.,2012)等。但有關(guān)瓜實蠅卵巢發(fā)育方面的研究很少，Khanetal.(2007)研究了苦楝葉塵及苦楝復(fù)合物配方對瓜實蠅卵巢發(fā)育的影響，但該文并未研究瓜實蠅卵巢發(fā)育的整個動態(tài)過程，亦未對其卵巢發(fā)育程度進(jìn)行分級。本文通過解剖瓜實蠅卵巢，詳細(xì)觀察瓜實蠅雌性內(nèi)生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及卵巢的發(fā)育形態(tài)，提出瓜實蠅卵巢發(fā)育的分級標(biāo)準(zhǔn)，為瓜實蠅生殖生理學(xué)方面的研究提供理論基礎(chǔ)，并為該蟲的預(yù)測預(yù)報提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

瓜實蠅由廣西大學(xué)提供。在溫度27 ℃、相對濕度75%～80%、光周期14L∶10D的條件下飼養(yǎng)，幼蟲、成蟲分別喂以南瓜、人工飼料(酵母粉∶蔗糖=3∶1)。待幼蟲長為老熟幼蟲后，放入輔有60%～70%濕度的砂土杯中化蛹，待羽化后分雌、雄飼養(yǎng)。

1.2 卵巢解剖方法

將瓜實蠅雌成蟲置于70%酒精內(nèi)5～10 min，在體視鏡(ZESSIS)下于磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH=7 PBS)中解剖卵巢。先用解剖針將蟲固定于內(nèi)置黑色KT板的培養(yǎng)皿中，左手用鑷子夾緊產(chǎn)卵器，右手用解剖針在腹部前端橫向剖開成“T”形，拉開體壁，再用昆蟲針切斷連接卵巢的氣管等，將卵巢拉出腹外。

將取出的卵巢置于中性紅水溶液(Gryaznov,1995)染色10～20 s。用目鏡測微尺分別測量卵巢長、寬值，計算卵巢指數(shù)(卵巢指數(shù)=卵巢長度×卵巢寬度)(Kendraetal.,2005;Landolt & Davis-Hernandez,1993)。用體視鏡觀察卵巢形態(tài)并拍照，統(tǒng)計卵粒數(shù)，同時記載卵巢發(fā)育級數(shù)。每日定時解剖10頭雌蟲卵巢，連續(xù)觀察30 d，然后隔4 d觀察1次，接著每10 d解剖1次，共觀察80 d。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 10.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用獨立樣本t檢驗分析卵粒數(shù)之間的差異顯著性，卵巢長度、卵巢寬度和卵巢指數(shù)均經(jīng)過log(x+1)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncan′s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌性生殖器的形態(tài)特征

瓜實蠅的雌性生殖系統(tǒng)由1對卵巢(ovary)、2根側(cè)輸卵管(lateral oviduct)、1根中輸卵管(median oviduct)、2個受精囊(spermatheca)、附腺(accessory gland)組成。卵巢左右各1個，由多條卵巢小管(ovarioles)構(gòu)成。卵巢前端有懸韌帶附著于中胸背膈，用于固定卵巢的位置，后端連接側(cè)輸卵管。側(cè)輸卵管前端與卵巢管連接處，有一個膨大成囊狀的卵巢萼(calyx)，可以暫時儲存卵。中輸卵管是由2條側(cè)輸卵管延伸到消化道下方匯合成為一條較粗的管道，連接產(chǎn)卵器。中輸卵管頂端延伸出2個接受和貯藏精子的受精囊和2條管狀附腺。瓜實蠅產(chǎn)卵后，卵巢末端可以觀察到黃色的卵泡遺跡——黃體(corpus luteum)(圖1)。

圖1 瓜實蠅雌性生殖系統(tǒng) Fig.1 The reproductive system of a mature (stage 6) female B.cucurbitaea.卵巢; b.側(cè)輸卵管; c.中輸卵管; d.受精囊; e.附腺; f.黃體。a.Ovary; b.Lateral oviduct; c.Median oviduct; d.Spermatheca; e.Accessory gland; f.Corpus luteum.

2.2 卵巢發(fā)育分級

根據(jù)Fletcheretal.(1978)的分級方法將瓜實蠅卵巢發(fā)育程度分為6個級別。Ⅰ級：卵巢小管纖細(xì)，卵母細(xì)胞小，未凸出(圖2A);Ⅱ級：卵母細(xì)胞逐漸進(jìn)入生長區(qū)，形成一系列由小而大的卵室(圖2B);Ⅲ級:卵室中的卵母細(xì)胞開始沉積卵黃，體積不斷增大，呈橢圓形(圖2C);Ⅳ級:卵黃體積占到卵母細(xì)胞一半以上(圖2D);Ⅴ級:抱卵期，卵粒清晰可見，呈香蕉形(圖2E)，排列整齊，形成一個類似圓柱形的卵巢,隨著卵殼的形成，卵泡細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞退化(圖2F);Ⅵ級:經(jīng)產(chǎn)期，卵子產(chǎn)出后，卵泡細(xì)胞萎縮形成黃體,積累于卵巢萼與側(cè)輸卵管中(圖2G)。

圖2 瓜實蠅雌成蟲卵巢發(fā)育過程形態(tài)的變化Fig.2 Ovarian stages in females of the fruit fly B.cucurbitaeA、B.Ⅰ級、Ⅱ級(卵黃發(fā)生前期)；C、D.Ⅲ級、Ⅳ級(卵黃發(fā)生期)；E.Ⅳ級向Ⅴ級過渡；F.Ⅴ級(抱卵期)；G.Ⅵ級(經(jīng)產(chǎn)期)。

由表1可知，卵黃發(fā)生前期(Ⅰ級和Ⅱ級),卵巢長度與寬度大致相等，但Ⅱ級卵巢長度和寬度顯著大于Ⅰ級。卵黃發(fā)生期(Ⅲ級和Ⅳ級)，卵巢長度和寬度迅速增長，且Ⅳ級卵巢長度和寬度顯著大于卵黃發(fā)生前期和Ⅲ級；卵巢長度增長快于卵巢寬度，Ⅳ級卵巢長度和寬度分別為(1.69±0.130)和(1.35±0.120) mm；卵巢體積顯著增大。抱卵期(Ⅴ級)卵巢長度和寬度均達(dá)到最大值，分別為(2.18±0.040)和(1.50±0.031) mm。經(jīng)產(chǎn)期(Ⅵ級)開始產(chǎn)卵，卵巢內(nèi)卵粒數(shù)迅速減少至(10.80±3.450)粒，顯著小于Ⅴ級卵粒數(shù)[(31.60±1.579)粒]；卵巢長度和寬度逐漸減小，分別為(1.85±0.080)和(1.20±0.066) mm；卵巢寬度和卵巢指數(shù)與Ⅳ級基本一致。

2.3 卵巢發(fā)育歷期

瓜實蠅個體之間的卵巢發(fā)育程度差別較大，各級別卵巢的持續(xù)時間重疊。如表1所示，Ⅰ級卵巢持續(xù)時間較長，羽化后1～8 d均為Ⅰ級卵巢，最長可以持續(xù)至羽化后35 d；Ⅱ級卵巢最早出現(xiàn)在羽化后第9天，最長可以持續(xù)至羽化后30 d；Ⅲ級卵巢最早出現(xiàn)在羽化后第12天，最長可持續(xù)至羽化后70 d；Ⅳ級卵巢最早出現(xiàn)在羽化后第16天；Ⅴ級卵巢最早出現(xiàn)在羽化后第19天，此時平均每雌含卵粒數(shù)增加為3.3粒,平均卵巢長度、卵巢寬度和卵巢指數(shù)均開始增大(圖3);Ⅵ級卵巢最早出現(xiàn)在羽化后第40天，平均每雌含卵粒數(shù)開始減少(圖3)。Ⅳ級、Ⅴ級、Ⅵ級卵巢最長均持續(xù)至羽化后80 d。其中,Ⅰ級卵巢數(shù)量最多，占解剖總量的59%，Ⅳ級卵巢數(shù)量最少，僅占解剖總量的1%。

表1 瓜實蠅卵巢發(fā)育各階段重要形態(tài)參數(shù)、實際日齡和含卵粒數(shù)Table 1 Ovarian characters, chronological age range and egg load at each developmental stage of B.cucurbitae

*數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列數(shù)據(jù)后附相同字母者表示無顯著差異(P>0.05, Duncan′s多重比較)。**數(shù)據(jù)經(jīng)過log(x+1)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計分析，表中顯示數(shù)據(jù)為未經(jīng)轉(zhuǎn)換的平均值。*Values are mean±SEof morphometric parameters between each oogenesis stage. Same letters within columns indicate no significant difference (P>0.05， Duncan′s mean separation test).**Data were log(x+1) transformed prior to analysis; non-transformed means are shown.

圖3 瓜實蠅羽化后80 d卵粒數(shù)和卵巢形態(tài)參數(shù)動態(tài)Fig.3 Egg load and ovary characteristics (means and standard errors) of laboratory-reared female B.cucurbitae from adult eclosion to 80 days of age橫坐標(biāo)為發(fā)育天數(shù)的對數(shù)值。Note that the horizontal axes have logarithmic scale.

3 討論

本文研究了瓜實蠅卵巢發(fā)育的分級標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)瓜實蠅不同發(fā)育時期卵巢小管的形態(tài)和卵黃沉積情況可將卵巢發(fā)育程度分為4期6個級別，分別為卵黃發(fā)生前期(Ⅰ級、Ⅱ級)、卵黃發(fā)生期(Ⅲ級、Ⅳ級)、抱卵期(Ⅴ級)、經(jīng)產(chǎn)期(Ⅵ級)。這與東澳番茄實蠅(Raghuetal.,2003)、加勒比按實蠅(Kendraetal.,2006)和橘小實蠅(Chouetal.,2012)卵巢發(fā)育程度的分級標(biāo)準(zhǔn)相一致。Fletcheretal.(1978)將油橄欖實蠅卵巢發(fā)育程度劃分為4期10個級別。筆者認(rèn)為，在生產(chǎn)實踐中，過于細(xì)致的分級會增加工作量，降低工作效率，采用4期6個級別的劃分方法即可。

本研究所采用的4個形態(tài)參數(shù)中，卵巢長度、寬度與卵巢指數(shù)均能較好地判定瓜實蠅卵巢處于發(fā)生前期或是發(fā)生期，而Chouetal.(2012)對橘小實蠅卵巢發(fā)育的研究認(rèn)為卵巢長度為最有效依據(jù)。卵黃發(fā)生期由滋養(yǎng)細(xì)胞的出現(xiàn)至卵粒開始形成，此時大量卵黃沉積于卵母細(xì)胞，以至卵巢形態(tài)發(fā)生巨大變化。卵母細(xì)胞的變化與卵巢指數(shù)的結(jié)合使用可以準(zhǔn)確判定未產(chǎn)卵的瓜實蠅卵巢發(fā)育級別，這與Kendraetal.(2006)的報道一致。瓜實蠅Ⅰ～Ⅴ級卵巢長度、寬度和卵巢指數(shù)均顯著增長。Ⅵ級卵巢長度大于Ⅳ級，但卵巢寬度、卵巢指數(shù)與Ⅳ級基本一致，因此在實際工作中針對個體僅采用卵巢長度來確定瓜實蠅卵巢發(fā)育級別的準(zhǔn)確度不高。很多雙翅目昆蟲產(chǎn)卵后，卵巢中可見黃體，如加勒比按實蠅(Kendraetal.,2006)、橘小實蠅(Chouetal.，2012)，但油橄欖實蠅(Fletcheretal.,1978)中未見。本研究中，Ⅵ級卵巢亦可見黃體，黃體在瓜實蠅卵巢萼中呈塊狀(圖2G)。因此，可以結(jié)合黃體判定卵巢所處級別，卵巢長度和黃體是鑒定瓜實蠅卵巢處于經(jīng)產(chǎn)期(Ⅵ級)的2個關(guān)鍵依據(jù)。

瓜實蠅卵巢屬于卵母細(xì)胞發(fā)育不同步、分批產(chǎn)卵的類型。卵巢小管內(nèi)卵粒成熟后，卵母細(xì)胞即開始發(fā)育，盡管相鄰的卵巢小管中的卵母細(xì)胞處于其他級別。油橄欖實蠅、加勒比按實蠅、東澳番茄實蠅、橘小實蠅性成熟后，均有相似的生殖現(xiàn)象(Fletcheretal.,1978;Kendraetal.,2006；Raghuetal.,2003;Vargas & Carey,1990;Vargasetal.,1984)。卵母細(xì)胞的迅速發(fā)育導(dǎo)致各個卵巢管卵巢發(fā)育不同步。

卵巢中成熟卵母細(xì)胞的出現(xiàn)被認(rèn)為是雌蟲性成熟的決定因素(Alujaetal.，2001；Nation,1972)。本研究中，瓜實蠅成熟卵母細(xì)胞最早出現(xiàn)于羽化后第19天，雌蟲全部性成熟則需80 d。而前人研究結(jié)果表明，室內(nèi)飼養(yǎng)的瓜實蠅成蟲羽化后6～11 d(肖樞等，2001)、9～11 d(袁盛勇等，2005)、17～10 d(馬錁等，2010)即達(dá)到性成熟；室外瓜實蠅成蟲羽化后4～6 d(王穿才，2009)、12～25 d(張全勝，2009)達(dá)到性成熟。瓜實蠅性成熟時間的不同可能與其卵巢發(fā)育受飛行行為、營養(yǎng)條件、溫度等因素的影響(劉向東等，2003；劉永華等，2006a、2006b)有關(guān)。

瓜實蠅的卵常產(chǎn)于幼瓜表皮內(nèi)，這給田間查卵帶來了較大的困難。在田間預(yù)測預(yù)報中，可以通過解剖顏色粘板誘獲的雌蟲(薛皇娃和吳偉堅,2013),判定卵巢管發(fā)育級別。在生產(chǎn)實踐中可參照瓜實蠅卵巢發(fā)育狀況,結(jié)合當(dāng)?shù)?、?dāng)時的溫度、濕度和光照等因素對瓜實蠅產(chǎn)卵期進(jìn)行預(yù)測預(yù)報。

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