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    實(shí)蠅類害蟲分子鑒定研究進(jìn)展

    2014-08-15 01:03:10陳韶萍郭瓊霞劉長明
    生物安全學(xué)報 2014年3期
    關(guān)鍵詞:實(shí)蠅條形碼多態(tài)性

    陳韶萍, 黃 振, 郭瓊霞*, 劉長明

    1福建出入境檢驗(yàn)檢疫局,福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350001 2福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,福建 福州 350002

    實(shí)蠅類害蟲隸屬雙翅目Diptera實(shí)蠅科Tephritidae,約有500屬4500種,除了南極與北極這2個高緯度區(qū)域,實(shí)蠅在全世界的熱帶、亞熱帶以及溫帶地區(qū)均有分布(梁廣勤等,2008;王振華等,2009)。世界上具有重要經(jīng)濟(jì)意義的實(shí)蠅主要分為5個類群,即按實(shí)蠅屬Anastrepha、果實(shí)蠅屬Bactrocera、寡鬃實(shí)蠅屬Dacus、臘實(shí)蠅屬Ceratitis以及繞實(shí)蠅屬Rhagoletis(黃振和黃可輝,2012; 梁廣勤等,2008)。我國有實(shí)蠅400余種,絕大多數(shù)種類為水果、蔬菜和花卉作物的害蟲,約有15屬22亞屬150余種,其中70余種被認(rèn)為是具有危險性或潛在危險性的重要害蟲(黃振,2010);同時其危害的寄主范圍廣,在進(jìn)境口岸經(jīng)常被截獲(黃振等,2012、2014)。

    長期以來,實(shí)蠅類害蟲的口岸檢疫鑒定主要以完整的成蟲外部形態(tài)特征為依據(jù)。然而,在口岸中經(jīng)常截獲的大多是實(shí)蠅幼蟲,在這種情況下,通常是將幼蟲在室內(nèi)飼養(yǎng)為成蟲再進(jìn)行鑒定,因其需要花費(fèi)較長的時間,從而影響果蔬進(jìn)出口貿(mào)易的通關(guān)速度。近年來,隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)被用于昆蟲分類鑒定,如同工酶技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)、PCR技術(shù)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)、基因芯片技術(shù)等。這給實(shí)蠅分類鑒定帶來了契機(jī),即在傳統(tǒng)分類的基礎(chǔ)上借助分子手段,可以更好地解決實(shí)蠅物種鑒定問題。本文主要對目前已經(jīng)被用于實(shí)蠅鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及其國內(nèi)外研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為今后選用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定實(shí)蠅種屬提供參考。

    1 DNA條形碼技術(shù)

    1. 1 原理及特點(diǎn)

    2003年,加拿大動物學(xué)家Paul Hebert博士提出了DNA條形碼(DNA barcoding)的概念。DNA條形碼技術(shù)的原理類似于商品條形碼,關(guān)鍵是對物種的某一段標(biāo)準(zhǔn)目的基因片段進(jìn)行大范圍比對分析,進(jìn)而識別、鑒定未知的物種或者發(fā)現(xiàn)新種及隱存種等(Hebertetal.,2003)。近年來,由于DNA條形碼技術(shù)操作快速簡便、結(jié)果準(zhǔn)確性高以及可進(jìn)行非專家物種鑒定等特點(diǎn),為生物分類學(xué)提供了信息化的分類標(biāo)準(zhǔn)和有效的分類手段,成為目前發(fā)展速度最快的前沿學(xué)科之一。

    目前,被選作標(biāo)記的分子基因很多,但僅COⅠ (cytochrome oxidase Ⅰ或coxⅠ) 基因被選為DNA條形碼的靶標(biāo)基因。COⅠ基因是位于線粒體呼吸鏈上的編碼細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ的基因,該基因具有幾個特點(diǎn)(Lin & Danforth,2004):(1)大部分為母系遺傳,相對保守且沒有內(nèi)含子,不包含重復(fù)序列;(2)與其他基因相比,進(jìn)化速率較快;(3)AT含量較高,且在細(xì)胞內(nèi)為多拷貝,比較容易被擴(kuò)增。此外,COⅠ基因有足夠的變異能夠?qū)⒉煌锓N區(qū)分開。

    1. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展

    李志紅等(2011)利用DNA條形碼技術(shù)成功鑒定了采自泰國四色菊市番石榴爛果中的番石榴實(shí)蠅Bactroceracorrecta(Bezzi)幼蟲。Abd-El-Samie & El Fiky (2011)基于COⅠ序列,分析闡述了在埃及各地區(qū)建立種群的桃實(shí)蠅Bactrocerazonata(Saunders)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。姜帆等(2011)利用DNA條形碼技術(shù)和BOLD系統(tǒng),對廣西南寧地區(qū)苦瓜中的實(shí)蠅幼蟲樣品進(jìn)行了序列測定、比對和分析。Liangetal.(2011)利用試驗(yàn)獲得的25種實(shí)蠅的155條COⅠ序列,通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹與遺傳距離分析,證實(shí)了COⅠ條形碼序列能準(zhǔn)確鑒定、識別除橘小實(shí)蠅Bactroceradorsails(Hendel)復(fù)合種外的中國果實(shí)蠅種屬。Liuetal.(2011)基于形態(tài)學(xué)及COⅠ條形碼序列,成功鑒定了來自布隆迪的入侵果實(shí)蠅BactrocerainvadensDrew。劉慎思等(2012)利用DNA條形碼技術(shù)構(gòu)建實(shí)蠅類害蟲快速鑒定技術(shù)體系,并證實(shí)該物種識別技術(shù)可用于口岸截獲的實(shí)蠅類害蟲幼體及殘體的準(zhǔn)確鑒定。Jiangetal.(2013)利用DNA條形碼技術(shù),基于SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)了能夠準(zhǔn)確鑒定、識別番石榴實(shí)蠅的特異性引物。

    1. 3 實(shí)蠅DNA條形碼的應(yīng)用情況

    根據(jù)BOLD Systems現(xiàn)有的數(shù)據(jù),總結(jié)了截至2014年10月22日實(shí)蠅DNA條形碼的種類、已公布的記錄數(shù)及其涉及的實(shí)蠅種類(表1)。由表1可以看出,實(shí)蠅DNA條形碼的種類主要有COⅠ-5P、COⅠ-3P、COⅡ、COⅢ、CYTB、atp6、28S等7種。其中以COⅠ標(biāo)記為主,已公布的記錄數(shù)為4540,是其他5種DNA標(biāo)記的113. 5倍,其中又以COⅠ-5P標(biāo)記為主,研究的實(shí)蠅種類達(dá)315種,COⅠ-3P標(biāo)記的有116種;果實(shí)蠅屬被研究公布的記錄數(shù)最多,其次為臘實(shí)蠅屬和寡鬃實(shí)蠅屬;BOLD Systems數(shù)據(jù)庫目前以COⅠ-5P標(biāo)記的果實(shí)蠅屬種類達(dá)61種,寡鬃實(shí)蠅屬達(dá)70種,臘實(shí)蠅屬55種,按實(shí)蠅屬11種,繞實(shí)蠅屬12種。

    2 以PCR(polymerase chain reaction)為基礎(chǔ)特異性擴(kuò)增快速鑒定技術(shù)

    2. 1 常規(guī)PCR技術(shù)

    2. 1. 1 原理及特點(diǎn) PCR,即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年建立,是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的技術(shù),其反應(yīng)體系主要包括DNA靶序列、引物、4種dNTP、DNA聚合酶以及適合的緩沖液體系,由高溫變性、低溫退火、適溫延伸3步為一個周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA序列得以擴(kuò)增(王廷華等,2005)。該技術(shù)操作快速簡便、特異性強(qiáng)及靈敏度高,但是具有易被污染、易出現(xiàn)假陽性和假陰性等缺點(diǎn)。

    2. 1. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 余道堅(jiān)等(2004)利用mtDNA COⅠ部分序列,通過對大量的實(shí)蠅基因序列進(jìn)行分析比較,設(shè)計(jì)出2對特異性引物,應(yīng)用定性PCR技術(shù)成功檢測、鑒定了番石榴實(shí)蠅。崔俊霞等(2006)采用形態(tài)學(xué)觀察與PCR技術(shù)相結(jié)合的方法,成功鑒定了從臺灣水果中截獲的疑似橘小實(shí)蠅的幼蟲和蛹。王振華等(2008)采用PCR方法,利用ITS間斷序列分型引物,根據(jù)擴(kuò)增后片段的不同,區(qū)分橘大實(shí)蠅Bactroceraminax(Enderlein)與橘小實(shí)蠅??浊锷彽?2010)利用特異的嵌套式引物對橘小實(shí)蠅18S rDNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和序列比對分析,成功鑒定了柑橘果實(shí)中橘小實(shí)蠅的卵。

    表1 實(shí)蠅DNA條形碼的應(yīng)用情況Table 1 The application of DNA barcoding for fruit fly identification

    2. 2 Real-time PCR技術(shù)

    2. 2. 1 原理及特點(diǎn) Real-time PCR,即實(shí)時熒光定量PCR技術(shù),于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù),即指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法(歐陽松應(yīng)等,2004)。與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、能有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)。目前該技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用。

    2. 2. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 余道堅(jiān)等(2006)基于mtDNA COⅠ設(shè)計(jì)引物,建立了SYBR Green實(shí)時熒光PCR技術(shù)快速鑒定辣椒實(shí)蠅Bactroceralatifrons(Hendel)的方法。Fengetal.(2007)基于mtDNA COⅠ,應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)成功鑒定了三葉斑潛蠅Liriomyzatrifolii(Burgess)幼蟲。徐浪等(2010)基于mtDNA COⅠ設(shè)計(jì)6條特異性引物,應(yīng)用AllGlo實(shí)時熒光PCR方法成功鑒定了南美按實(shí)蠅Anastrephafraterculus(Wiedemann)、墨西哥按實(shí)蠅Anastrephaludens(Loew)、西印度按實(shí)蠅Anastrephaoblique(Macquart)、印加按實(shí)蠅AnastrephadistinctaGreene、中美按實(shí)蠅AnastrephastriataSchiner等6種重要的按實(shí)蠅。

    2. 3 RFLP(restriction fragment length polymorphism)技術(shù)

    2. 3. 1 原理及特點(diǎn) RFLP,即限制性片段長度多態(tài)性技術(shù),于1980年由Bostein建立并發(fā)展起來。它是指利用限制性內(nèi)切酶酶解樣品DNA從而產(chǎn)生不同長度的DNA片,進(jìn)而通過電泳將不同長度的DNA片段分離出來(周延清,2005)。該技術(shù)具有多態(tài)性豐富、對基因組的覆蓋范圍比較廣等優(yōu)點(diǎn),但存在成本昂貴、操作繁瑣、檢測周期長等缺點(diǎn)。

    2. 3. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 Muraji & Nakahara (2002)應(yīng)用RFLP技術(shù)研究了亞太地區(qū)18種實(shí)蠅的快速鑒定方法,結(jié)果表明,除了楊桃實(shí)蠅BactroceracarambolaeDrew & Hancock和木瓜實(shí)蠅BactrocerapapayaeDrew & Hancock,該方法可準(zhǔn)確鑒別其他16種實(shí)蠅害蟲。吳佳教等(2004)研究表明,RFLP技術(shù)適用于橘小實(shí)蠅、銹實(shí)蠅Bactrocerarubigina(Wang & Zhao)、瓜實(shí)蠅Bactroceracucurbitae(Coquillett)、南瓜實(shí)蠅Bactroceratau(Walker)、具條實(shí)蠅Bactrocerascutellata(Hendel)及木姜子實(shí)蠅BactrocerahyalineShiraki等6種實(shí)蠅的快速鑒定。吳佳教等(2005)應(yīng)用RFLP技術(shù),對我國口岸截獲頻率較高的9種檢疫性實(shí)蠅進(jìn)行了快速鑒定。林麗莉等(2007)應(yīng)用RFLP技術(shù),對我國部分地區(qū)發(fā)生分布的蜜柑大實(shí)蠅Bactroceratsuneonis(Miyake)和橘大實(shí)蠅開展了分子生物學(xué)鑒定方法的研究并取得成功。Chuaetal.(2010)采用RFLP技術(shù)成功區(qū)分了楊桃實(shí)蠅和木瓜實(shí)蠅,進(jìn)而使橘小實(shí)蠅復(fù)合種的有效識別得以實(shí)現(xiàn)。

    2. 4 RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)技術(shù)

    2. 4. 1 原理及特點(diǎn) RAPD,即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù),由美國杜邦公司和加利福尼亞生物研究所在1900年提出(Welsh & McClelland,1990;Williamsetal.,1990)。它以一種或多種隨機(jī)引物對模板DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增,是建立在PCR基礎(chǔ)上研究模板DNA多態(tài)性的遺傳標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是利用人工合成的短核苷酸(大約10個堿基)對DNA靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離及溴化乙錠染色就可檢測出DNA靶序列的多態(tài)性(溫孚江,2002)。該技術(shù)具有操作簡便易行、分析快捷方便、不用專門設(shè)計(jì)引物及引物數(shù)量不限等優(yōu)點(diǎn),但是存在穩(wěn)定性差、重復(fù)性差、易出現(xiàn)假帶等缺點(diǎn)。

    2. 4. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 Haymer & McInnis (1994)應(yīng)用RAPD技術(shù)鑒定了地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata(Wiedemann),認(rèn)為RAPD技術(shù)可用于證明害蟲同一種群和不同種群間的遺傳變異。張紅梅等(2004)利用RAPD技術(shù)對陜西省常見4種實(shí)蠅基因組DNA的多態(tài)性進(jìn)行了初步研究。張亮和張智英(2007)采用RAPD技術(shù)鑒定了南瓜實(shí)蠅、黑漆實(shí)蠅Bactrocerascutellaris(Bezzi)、具條實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、橘小實(shí)蠅和番石榴實(shí)蠅等6種實(shí)蠅。

    2. 5 AFLP(amplified fragment length polymorphism)技術(shù)

    2. 5. 1 原理及特點(diǎn) AFLP,即擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù),是一種基于PCR技術(shù)的選擇性擴(kuò)增限制性片段的方法,基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割,然后在限制性片段兩端連接人工接頭作為擴(kuò)增的模板,接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)(鞠秀芝等,2005)。該技術(shù)具有快速高效、多態(tài)性豐富、可靠性好等優(yōu)點(diǎn),但同時存在分析成本高、對樣本DNA質(zhì)量要求較高等缺點(diǎn)。

    2. 5. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 Kakouli-Duarteetal.(2001)采用AFLP技術(shù)準(zhǔn)確區(qū)分了地中海實(shí)蠅和納塔爾小條實(shí)蠅CeratitisrosaKarsch。我國暫無相關(guān)報道。

    2. 6 基因芯片技術(shù)

    2. 6. 1 原理及特點(diǎn) 基因芯片是生物芯片的一種,又被稱作DNA芯片。其工作原理:經(jīng)過標(biāo)記的待測樣本DNA與位于芯片上特定位置的探針雜交,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則確定靶DNA序列,最后經(jīng)激光共聚集顯微鏡掃描,利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對熒光信號進(jìn)行比較和檢測進(jìn)而迅速得出所需信息(馮永強(qiáng)和閻小君,2000)。該技術(shù)具有快速高效、高通量、微型化以及自動化等優(yōu)點(diǎn),但同時存在技術(shù)復(fù)雜、成本昂貴、檢測靈敏度低、重復(fù)性差及分析范圍較窄等缺點(diǎn)。

    2. 6. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 李文芬等(2008)選擇mtDNA COⅠ作為分子標(biāo)記基因,建立了地中海實(shí)蠅、芒果小條實(shí)蠅Ceratitiscosyra(Walker)以及納塔爾小條實(shí)蠅等實(shí)蠅科重要害蟲的生物芯片檢測方法。國外暫未發(fā)現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)。

    3 問題與展望

    近年來,分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展,其在昆蟲分類中的應(yīng)用也越來越廣,這些技術(shù)不僅驗(yàn)證了傳統(tǒng)分類所得出的結(jié)論,而且解決了傳統(tǒng)分類所無法解決的疑難問題,均顯示出分子生物學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢及廣闊的發(fā)展前景。

    雖然分子生物學(xué)技術(shù)具有準(zhǔn)確、客觀等特點(diǎn),即分子序列的信息代表遺傳的本質(zhì),它不受物種個體發(fā)育階段及環(huán)境條件等的影響,但同時存在許多問題。首先,從龐大的DNA文庫中選擇最佳、最能反映物種間進(jìn)化關(guān)系的基因片段仍存在較大難度;其次,選擇不同的目的基因研究同一物種,可能會得到不同的結(jié)果;再次,使用不同的分子生物學(xué)分析軟件有可能得出不同的結(jié)果。這些問題是今后昆蟲分類研究的重要課題。

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