內皮細胞微粒與糖尿病血管病變

胡利梅，任衛(wèi)東

（1.河北北方學院研究生部，河北 張家口075000；2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院內分泌科，河北 張家口075000）

據流行病學調查，我國20歲以上的成年人糖尿病患病率為9.7%，其中血管病變是糖尿病嚴重并發(fā)癥之一。血管內皮細胞具有維持血管的正常結構、功能及抗動脈硬化的作用，內皮損傷是血管病變的始動因素。內皮細胞在活化、損傷和 （或）凋亡時，會釋放內皮細胞微粒 （endothelial microparticle，EMP）。EMP具有不同的生物學效用，包括促進動脈壁炎癥反應、損傷內皮細胞、促血栓形成以及激活腎素－血管緊張素系統(tǒng) （renin－angiotensin system，RAS）等。有研究證實EMP在血管疾病中具有促炎癥反應作用，如動脈粥樣硬化和糖尿病視網膜病變 （DR）［1－2］。現綜述EMP與糖尿病血管病變研究狀況進展。

1 EMP的組成

在損傷、缺氧或炎癥刺激的過程中內皮細胞會釋放EMP［3］，1990年 Hamilton等用鈣離子載體A23187和補體蛋白C5b－9刺激臍靜脈的內皮細胞，產生一種微粒，直徑＜1μm，并第一次用流式細胞儀檢測出該物質，命名為EMP。它被定義為直徑為＜1μm的小囊泡，由磷脂、蛋白質和膜內容物 （核物質與部分細胞質）組成。

1.1 磷脂

所有真核細胞膜磷脂是不對稱分布的，這種不對稱分布的消失，往往會引起細胞膜的出芽與脫落，產生磷脂對稱分布的微粒。許多激活劑會引起膜磷脂的對稱分布，如膠原、凝血酶、鈣離子載體A23187和補體蛋白C5b－9等，形成微粒。

1.2 膜內容物

膜內容物包括部分細胞質和核物質，微粒膜內有DNA、RNA、microRNA多種核物質，它們作用還有待進一步探索。Deregibus等［4］證實了EMP中的mRNA在轉運至內皮細胞的過程中，通過增強內皮NO合酶的表達和激活蛋白激酶B（protien kinase B，PKB），促進血管生成，影響血管內穩(wěn)態(tài)。

1.3 蛋白質

EMP表達許多成熟內皮細胞表面的特異性蛋白，如血小板內皮細胞黏附分子 （CD31）、細胞間黏附分子 （CD54）、E選擇素 （CD62E）、p－選擇素 （CD62P）、內皮因子 （CD105）、VE－鈣黏蛋白 （CD144）以及內皮連接蛋白 （CD146），故通過標記這些特異性蛋白可檢測EMP水平。而單一用CD31標記EMP，通常無法將EMP與血小板微粒 （platelet microparticle，PMP）區(qū)分開，因為白細胞和血小板也可表達CD31，但是CD42b僅在血小板及白細胞表面表達，而在內皮細胞表面不表達，所以采用雙標記CD31表達陽性和CD42b表達陰性 （CD31＋／CD42b－）可將兩者區(qū)別開，增加EMP檢測的特異性及敏感性，故采用流式細胞術檢測CD31＋／CD42b－標記的內皮細胞微粒。

2 EMP的檢測

EMP是反應內皮細胞功能的一種新型標志物，根據EMP表型特征，可以測定血漿中EMP的含量，但目前尚未形成標準化檢測EMP，2種常用的檢測方法如下。

2.1 固相捕獲法的ELISA

此方法可對EMP進行定性和定量的分析，目前已不常用。具體方法：在已捕獲PSer＋微粒后的固定的錨定蛋白V中，通過加入內皮細胞抗原特異抗體 （如抗CD31、抗CD54、抗CD62E、抗CD62P、抗CD144等）對EMP進行分類，然后加入凝血因子 （如鈣、Ⅱ、Xa、Va）產生凝血酶，而加入的PSer＋微粒和凝血因子的量與凝血酶的活性強度直接相關，可反映EMP的量。

2.2 流式細胞術

在流式細胞術中EMP被定義為直徑為＜1.0μm的內皮特異性抗體陽性粒子。檢測步驟：①用含有檸檬酸鈉的真空采血管采集空腹靜脈血2mL；②150g離心10min獲血小板豐富血漿，1 000g離心2min獲得去血小板的血漿 （platelet poor plasma，PPP）；③EMP分析：取50μL PPP與4μL PE標記CD31單抗及4μL FITC標記CD42b單抗混合并室溫下避光放置20min，用0.5mL PBS緩沖液 （pH值7.2～7.4，NaCl 137mmol·L－1，KCl 2.7mmol·L－1，Na2HPO44.3mmol·L－1，KH2PO41.4mmol·L－1）稀釋后，流式細胞儀進行分析。樣本檢測前以直徑為1.0μm的標準微球于前向角定門，門內收集的微粒直徑均＜1.0μm，EMP被定義為CD31＋／CD42b－的直徑＜1.0μm的粒子。該檢測方法簡便而且相對精確，目前最為常用。

3 EMP在糖尿病血管病變中的作用

3.1 促炎癥反應

糖尿病患者血管病變的發(fā)生、發(fā)展，伴隨著慢性炎癥反應，有多種促炎因子參與，如TNF、IL－18、IL－6，IL－1β等。EMP能夠促進炎癥反應的發(fā)生，而炎癥反應通過炎癥因子參與EMP的產生。高糖條件下，EMP通過增加NADPH氧化酶的活性，促進內皮炎癥反應和損傷血管［5］。

3.2 內皮損傷

糖尿病患者微血管病變與毛細血管床和小動脈長期處于高血糖狀態(tài)有關。Jung等［6］證實EMP與糖尿病并發(fā)癥緊密相關，并且EMP的水平與性質體現了內皮細胞的功能狀態(tài)。田剛等［7］發(fā)現EMP在持續(xù)血糖升高狀態(tài)下，通過促進氧自由基與內皮素的產生，降低NF－κB的活性及一氧化氮的利用率，導致血管內皮功能受損，誘發(fā)糖尿病患者血管并發(fā)癥的發(fā)生。

3.3 促血栓形成作用

糖尿病大血管病變過程中，持續(xù)高血糖加重了內皮功能的損害，導致EMP水平逐漸升高，增加EMP表面組織因子和磷酯酰絲氨酸的表達，促進凝血，導致缺血性血管病的發(fā)生。EMP表面巨大的vWF加速了血小板的聚集，并能夠穩(wěn)固已形成的血栓。同時EMP表面還表達許多其他的黏附分子，如ICAM－1、VCAM－1、PECAM－1、E－選擇素、F選擇素等，它們通過穩(wěn)固EMP與血小板的連接，促進血栓形成。在高血糖、高血脂、氧化應激及慢性炎癥等多因素作用下，逐漸加重糖尿病患者血管的病理改變，增加糖尿病患者血管狹窄、閉塞，甚至截肢的風險，同時增加了心血管事件發(fā)生的風險。

3.4 EMP與ROS的相互作用

慢性高血糖可激活RAS，升高血管緊張素I（angiotensin－I，Ang－I）和血管緊張素II（angiotensinⅡ，AngⅡ）的水平。Burger等［8］發(fā)現AngⅡ可刺激EMP產生，EMP通過刺激活性氧簇 （reactive oxygen species，ROS）促進炎癥反應發(fā)生，導致糖尿病動脈血管硬化。AngⅡ介導產生的血管內O2－主要來源于NADPH的氧化，它影響RhoA／Rho激酶活性，Rho激酶能夠調節(jié)細胞骨架的形成，Rho激酶抑制劑可阻斷AngⅡ刺激EMP的形成。故糖尿病患者早期應用AT1R受體阻滯劑，可以減緩動脈血管硬化的發(fā)生、發(fā)展。

4 糖尿病血管病變危險因素與EMP

4.1 高血壓與EMP

在長期高血壓的高剪切應力作用下，可加速內皮細胞損傷及EMP的產生，導致靶器官的損害。研究發(fā)現在2型糖尿病患者中，合并高血壓的EMP水平高于無高血壓組，并且與動脈硬化有關［9］。

4.2 吸煙與EMP

嗜煙與內皮祖細胞 （EPC）的改變和內皮功能不全密切相關，有致糖尿病動脈血管粥樣硬化的作用。Heiss等［10］發(fā)現接觸吸煙環(huán)境的志愿者體內EMP含量較暴露前明顯升高，并且肱動脈血流介導的血管舒張反應 （FMD）較暴露前差；并且從體內提取并培養(yǎng)的EPC，能夠減弱血管內皮生長因子 （VEGF）激發(fā)NO釋放的反應。故吸煙引起的EPC與內皮功能不全可能與體內EMP水平升高有關。

5 展 望

綜上所述，EMP與糖尿病血管病變有著密切聯系，EMP不僅可以作為內皮細胞受損的標志，而且在炎性反應、內皮損傷、血栓形成等方面發(fā)揮一定作用，并且與高血壓、吸煙等高危因素密切相關。因此它不僅是內皮受損或激活的標志，還在血管損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。由于EMP能夠更加直接而特異地反映內皮細胞的功能狀態(tài)，深入研究有可能為揭示內皮損傷性疾病的發(fā)病機制或提示病情發(fā)展提供據。EMP為血栓性疾病的發(fā)病機制及診斷方法提供新信息，可能有利于減少糖尿病患者致殘、致死的發(fā)生。如何將EMP檢測運用于臨床等有待進一步研究。

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