HPLC法測(cè)定人血漿中異煙肼、吡嗪酰胺濃度

陸 磊，王 潔，丁紅梓，周秋云，錢(qián)智磊，張 亮

0 引言

我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，世界衛(wèi)生組織估計(jì)，目前我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病例數(shù)約為130萬(wàn)，位居全球第二位[1]。同時(shí)，我國(guó)也是全球27個(gè)耐多藥高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一[2]。雖然我國(guó)在遏制結(jié)核病蔓延和流行的實(shí)際工作中取得了初步成效，但是要順利實(shí)現(xiàn)我國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃目標(biāo)，仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)[3]。

異煙肼(Isoniazid，INH)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA)是用于結(jié)核病患者初始治療的重要用藥，大部分患者都可以獲得很好的治療效果[4]。PZA與INH化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，故可能通過(guò)與INH相似的機(jī)制破壞肝細(xì)胞。有報(bào)道，應(yīng)用INH產(chǎn)生肝毒性的患者聯(lián)合應(yīng)用利福平和PZA后將出現(xiàn)更嚴(yán)重的肝損害[5]。INH和PZA的極性相差較小，使用同一流動(dòng)相同時(shí)測(cè)定INH和PZA的方法相對(duì)簡(jiǎn)單，本實(shí)驗(yàn)室建立了同時(shí)測(cè)定這兩種藥物血藥濃度的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津LC-10A)，包括SCL-10AVP系統(tǒng)控制器、LC-10ADVP溶劑輸送泵、FCV-10ALVP混合器、DGU-14A脫氣機(jī)、SPD-10AVP紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、CTO-10ASVP柱溫箱、CLASS-VP6色譜工作站；渦旋儀(大龍興利)；分析天平(FB224，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；酸度計(jì)(PHS-3C，上海雷磁)；高速離心機(jī)(TG-1650，上海盧湘儀)；艾本德微量移液器(Eppendor，德國(guó))。

1.2 試劑 INH對(duì)照品(批號(hào)：100578-200401、中國(guó)藥品生物制品檢定所)；PZA對(duì)照品(批號(hào)：100178-200403，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲醇、乙腈(Merck公司，德國(guó))均為色譜純；磷酸二氫鉀、三乙胺(國(guó)藥集團(tuán)，中國(guó))均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：CLC-ODS(島津，日本，6 mm×150 mm)；柱溫：37 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：268 nm；流動(dòng)相：0.05 mmol/L磷酸二氫鉀(三乙胺調(diào)pH=5.6)∶乙腈=96∶4；流速：1 mL/min。

2.2 樣品前處理 精密吸取血清300 μL，置于離心管中，加入700 μL甲醇，放置于渦旋混合儀上混合5 min，以13 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣。

2.3 方法特異性 按“2.2”項(xiàng)下方法，處理人空白血漿、對(duì)照品溶液+人空白血漿及同時(shí)服用INH和PZA的患者血漿。結(jié)果INH和PZA的保留時(shí)間分別為8.283 min和11.025 min，兩者峰形良好，與雜質(zhì)峰分離完全。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取INH和PZA標(biāo)準(zhǔn)液加入空白血漿，使血漿中INH和PZA濃度為0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2 mg/L。按“2.2”項(xiàng)下操作，同法處理血漿。以峰高外標(biāo)法定量，以濃度對(duì)峰面積作直線回歸，最低檢測(cè)濃度為0.3 mg/L，見(jiàn)表1。

表1 INH和PZA標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系結(jié)果(n=6)

2.5 回收率 配制低、中、高濃度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血漿樣品，每一濃度做平行管3份，按“2.2”項(xiàng)下方法操作進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，按回歸方程計(jì)算濃度，與標(biāo)準(zhǔn)濃度比較得回收率，結(jié)果符合要求，見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.6 精密度 配制低、中、高濃度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血漿樣品各6份，每一濃度做平行管3份，按“2.2”項(xiàng)下方法操作進(jìn)樣，分別于同日和3 d內(nèi)測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)、日間RSD。精密度符合要求，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 日內(nèi)、日間精密度計(jì)算結(jié)果(n=6)

2.7 穩(wěn)定性 配制低、中、高濃度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血漿樣品，每一濃度做平行管3份，于室溫(20～30 ℃)放置0、4、8 h后，測(cè)定血漿樣品濃度，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次；再取高、中、低濃度的INH和PZA的血漿樣品，于-20 ℃放置7、14 d后，測(cè)定血漿樣品濃度，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果表明，樣本在室溫8 h、反復(fù)凍融3次和在-20 ℃放置14 d的條件下保持穩(wěn)定。

3 討論

3.1 樣品前處理 通過(guò)固相萃取、液-液萃取、吹干復(fù)溶等樣品前處理方法的比較，最后選擇甲醇沉淀后直接進(jìn)樣的方法，該方法較固相萃取法成本大大降低，同時(shí)具有較高的回收率，而采取吹干復(fù)溶法雖然可以提高檢測(cè)靈敏度，但其耗時(shí)且費(fèi)用較高，不利于臨床廣泛開(kāi)展。在比較甲醇和乙腈沉淀蛋白的效果后，發(fā)現(xiàn)乙腈雖在1∶1用量時(shí)具有很好的沉淀效果，但由于流動(dòng)相中使用乙腈，進(jìn)樣時(shí)會(huì)造成色譜圖形變化，產(chǎn)生拖尾、偏峰。

3.2 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)室在測(cè)定單組分異煙肼時(shí)使用0.05 mmol/L磷酸二氫鉀(三乙胺調(diào)pH=5.6)∶乙腈=98∶2[6-7]，該比例可以滿足同時(shí)測(cè)定INH和PZA，但測(cè)定時(shí)間超過(guò)15 min，通過(guò)多次嘗試后發(fā)現(xiàn)，將磷酸二氫鉀和乙腈比例調(diào)整至96∶4時(shí)，既可以避免血漿中雜質(zhì)峰干擾，又能將吡嗪酰胺的出峰時(shí)間前移約4 min，節(jié)約測(cè)定時(shí)間。

3.3 檢測(cè)方法評(píng)價(jià) 該方法相較于單次測(cè)定每種抗結(jié)核藥的血藥濃度，可以節(jié)約1/2的成本和時(shí)間，同時(shí)具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，通過(guò)與單獨(dú)測(cè)定相同樣本INH和PZA的血藥濃度比較，該方法結(jié)果可靠，可以用于臨床樣本檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

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