白芍總苷對(duì)NAFLD大鼠肝臟的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

金國賢，張 文，孫偉娟，程 程，劉 瑩*

0 引言

白芍是芍藥的干燥根部，中醫(yī)理論認(rèn)為其具有益氣、活血的作用。在白芍的干燥根中可分離出芍藥苷、芍藥花苷、苯甲酰芍藥苷等具有生理學(xué)活性的糖苷類混合物，統(tǒng)稱為白芍總苷(TGP)[1]。目前的研究表明，白芍總苷在人體內(nèi)會(huì)抑制IL-1、TNF-α、細(xì)胞間粘附因子-1,阻止膠原蛋白合成或脂類物質(zhì)的氧化。上述的炎癥細(xì)胞因子、脂肪細(xì)胞因子、胞間粘附因子、膠原蛋白等均是造成非酒精性脂肪肝(NAFLD)的危險(xiǎn)因素[2-5]。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠，構(gòu)建大鼠NAFLD模型，以探討白芍總苷對(duì)NAFLD大鼠肝臟的保護(hù)作用及保護(hù)機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠50只，雌雄各半，體重130～160 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK(京)2012-0004。

1.2 藥品和試劑 白芍總苷膠囊(購于寧波立華制藥有限公司)；高脂飼料(80%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+6%膽固醇+4%白砂糖)以及普通喂養(yǎng)飼料(購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；非諾貝特(FEN，購于廣州威爾曼藥業(yè)有限公司)；戊巴比妥鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)氨酶(GSH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)試盒以及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，批號(hào)：20130415)；IL-1、TNF-α、TGF-β(購于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；-80 ℃冰箱；imarkTM酶標(biāo)儀(美國伯樂有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(日本SAKULA儀器有限公司)；BS124S分析天平(余姚紀(jì)銘承重效驗(yàn)設(shè)備有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(上海箐華科技儀器有限公司)。

2 方法

2.1 NAFLD大鼠模型的建立 將50只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只和模型組40只。正常組給予基礎(chǔ)飼料，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)。模型建立成功后，根據(jù)體重隨機(jī)分為：模型對(duì)照組、非諾貝特組(200 mg/kg)；TGP低劑量組(100 mg/kg)和TGP高劑量組(200 mg/kg)，持續(xù)灌胃給藥4周，正常對(duì)照組以及模型對(duì)照組則給予生理鹽水灌胃(10 mL/kg)。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 血清酶檢測(cè) 給藥干預(yù)4周后，各組大鼠禁食24 h，用5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開腹主動(dòng)脈取血，冷凍離心分離血清，按照ALT、AST、GST、SOD和GSH-PX試劑盒說明書方法測(cè)定各血清酶活性，按照試劑盒步驟測(cè)定MDA含量[6]。

2.2.2 ELISA方法檢查IL-1、TNF-α、TGF-β 采用ELISA試劑盒測(cè)定大鼠血清中IL-1、TNF-α和TGF-β的含量[7]。

2.2.3 組織病理學(xué)檢查 藥物干預(yù)4周后，分別從正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、非諾貝特組、TGP低劑量組、TGP高劑量組中隨機(jī)抽取1只大鼠，取肝左葉，用4%甲醛溶液固定，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織的病理學(xué)變化。

3 結(jié)果

3.1 白芍總苷對(duì)NAFLD大鼠肝功能的影響 與正常對(duì)照組比較，NAFLD模型對(duì)照組大鼠ALT、AST、GST活性顯著升高(P<0.05)；經(jīng)非諾貝特和白芍總苷干預(yù)后模型組大鼠的ALT、AST及GST活性均降低回正常水平，與干預(yù)前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 白芍總苷對(duì)NAFLD大鼠的血清ALT、AST、GST活性影響

3.2 白芍總苷對(duì)NAFLD大鼠體內(nèi)抗氧化能力的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的大鼠SOD、GSH-PX活性顯著降低，MDA含量明顯升高(P<0.05)；經(jīng)非諾貝特和白芍總苷干預(yù)治療后，模型組大鼠SOD、GSH-PX活性大大提高，MDA含量顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 白芍總苷對(duì)NAFLD大鼠SOD、GSH-PX活性及MDA含量的影響

3.3 白芍總苷對(duì)NAFLD大鼠血清中IL-1、TNF-α和TGF-β含量的影響 由統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果可知，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中IL-1、TNF-α和TGF-β的含量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NAFLD模型對(duì)照組比較，非諾貝特和白芍總苷高劑量組大鼠血清IL-1、TNF-α和TGF-β含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 白芍總苷對(duì)NAFLD大鼠血清中IL-1、TNF-α、TGF-β含量的影響

3.4 白芍總苷對(duì)NAFLD大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響 經(jīng)HE染色切片后光鏡下觀察，正常組大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)正常，肝排列有序，肝索清晰可見，無病理性變化；NAFLD模型對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的脂肪變，明顯腫脹呈圓形，細(xì)胞核被脂滴擠向一側(cè)，大量肝細(xì)胞出現(xiàn)顆粒，肝細(xì)胞索排列紊亂；非諾貝特組和白芍總苷高劑量組大鼠肝細(xì)胞索排列較整齊，脂滴基本消失，見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)檢查(20×)

4 討論

NAFLD是指雖無過量飲酒史卻類似于酒精性脂肪肝的肝臟組織學(xué)病變，目前NAFLD的確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明，可能原因?yàn)槿８视秃椭舅岢练e在肝組織首先造成肝臟單純的脂肪性病變，在此基礎(chǔ)上，隨時(shí)間的增加引起慢性的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成肝臟細(xì)胞和線粒體細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝細(xì)胞纖維化和壞死[8-13]。異常的細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激反應(yīng)及脂肪過氧化損傷在非酒精性脂肪肝的發(fā)展中也起到關(guān)鍵性的作用，其除了能對(duì)肝臟線粒體造成不可逆的損傷外，還可以促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的形成，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[14-16]。

本實(shí)驗(yàn)通過持續(xù)給予高脂飼料建造NAFLD大鼠模型，這一模型除使大鼠具有高血壓、肝部脂肪堆積的癥狀外，還可誘發(fā)高氧化應(yīng)激狀態(tài)和細(xì)胞因子的異常形成，而致肝損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)期給予高脂飼料后，模型對(duì)照組大鼠肝功能明顯受到損傷，并且抗氧化能力下降，肝臟組織切片可見明顯的病理變化，提示肝功能的受損可能與過強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。白芍總苷是自白芍中提取的有效活性成分，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)及抗心肌缺血的作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，白芍具有養(yǎng)血、通痹的作用，有助于肝功能的改善，近年來，已有研究報(bào)道，白芍總苷在糖尿病腎病和免疫性肝炎方面的治療效果，其可通過上調(diào)IL-1、NF-kB、TNF-α、nephrin等細(xì)胞因子阻止膠原蛋白合成、抗脂質(zhì)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改善糖尿病腎損傷和免疫性肝炎損傷[17-19]。在本實(shí)驗(yàn)中，白芍總苷組的NAFLD大鼠給藥4周后，其抗氧化酶的活性明顯提高，血清中異常細(xì)胞因子的水平顯著下降，通過抗氧化水平的提高以及降低體內(nèi)異常免疫細(xì)胞因子水平，從而使血清中ALT、AST和GST的活性降低到正常值，起到肝臟保護(hù)的作用。

由以上分析結(jié)果可知，白芍總苷對(duì)高脂引起的NAFLD模型大鼠有肝臟保護(hù)的作用，其作用機(jī)制可能與其提高抗氧化能力、降低異常免疫因子水平有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 韓雪,傅繼華.抗氧化劑用于非酒精性脂肪肝病治療的研究進(jìn)展[J].臨床合理用藥雜志,2012,5(11):169-170.

[2] 丁效蕙,趙景民.非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病機(jī)制及治療的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2005,13(3):371-375.

[3] 周婷婷,秦波.脂肪細(xì)胞因子與非酒精性脂肪肝和胰島素抵抗關(guān)系的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2009,17(29):3014-3018.

[4] 鄭琳穎,潘競(jìng)鏘,呂俊華.白芍總苷對(duì)脂肪肝大鼠增強(qiáng)胰島素敏感性及抗脂肪肝作用[J].中國中藥雜志,2008,33(20):2385-2390.

[5] 趙汝霞.白芍總苷對(duì)高脂飲食聯(lián)合果糖水誘致 NAFLD 大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用及其機(jī)理研究[D].廣州：暨南大學(xué),2013.

[6] 李宜川,劉國玲,張玉霞,等.白芍總苷對(duì) NAFLD 大鼠肝臟 NF-kB/p65 蛋白表達(dá)及羥脯氨酸含量的影響 [J].聊城大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,26(4):62-66.

[7] 劉月麗,呂俊華.白芍總苷的降血脂,抗氧化作用及其對(duì)脂肪肝的防治研究[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,2:158-161.

[8] 張亞輝,周伏喜,盧放根.大黃素對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠胰島素抵抗及瘦素作用的影響[J].中國醫(yī)師雜志,2013,15(8):1044-1047.

[9] Wong VWS,Vergniol J,Wong GLH,et al.Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease[J].Hepatology,2010,51(2):454-462.

[10]Cnop M,Havel PJ,Utzschneider KM,et al.Relationship of adiponectin to body fat distribution,insulin sensitivity and plasma lipoproteins:evidence for independent roles of age and sex[J].Diabetologia,2003,46(4):459-469.

[11]Abdelmalek MF,Suzuki A,Guy C,et al.Increased fructose consumption is associated with fibrosis severity in patients with nonalcoholic fatty liver disease [J].Hepatology,2010,51(6):1961-1971.

[12]Ahmed MH,Byrne CD.Modulation of sterol regulatory element binding proteins(SREBPs)as potential treatments for non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)[J].Drug discovery today,2007,12(17):740-747.

[13]Targher G,Day CP,Bonora E.Risk of cardiovascular disease in patients with nonalcoholic fatty liver disease[J].New England Journal of Medicine,2010,363(14):1341-1350.

[14]關(guān)麗嫦,徐麗姝,高慧亭,等.利拉魯肽對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠模型生化及炎癥指標(biāo)的影響[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(14):2270-2272.

[15]陳興梅.非酒精性脂肪肝患者肝損傷與代謝異常及C反應(yīng)蛋白的關(guān)系[J].中國醫(yī)藥,2012,7(4):504.

[16]張艷敏,蔣曉忠,常延河,等.高敏C反應(yīng)蛋白和血尿酸對(duì)2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝的預(yù)測(cè)價(jià)值[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(2):238-240.

[17]鄭琳穎,潘競(jìng)鏘,楊以琳,等.白芍總苷對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠 Apelin 和 Visfatin 表達(dá)的影響 [J].中藥新藥與臨床藥理,2013,24(1):51-54.

[18]周艷麗,張磊,劉維.白芍總苷對(duì)雷公藤多苷片所致小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J].天津中醫(yī)藥,2007,24(1):61-62.

[19]馮瑞兒,鄭琳穎,呂俊華,等.白芍總苷對(duì)代謝綜合征-高血壓大鼠改善胰島素敏感性,降壓和抗氧化作用 [J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2010,(2):154-159.