光照對輔助生殖實驗室胚胎發(fā)育的負面影響

彭禮繁

PENG Li-fan

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院輔助生殖醫(yī)學中心，四川 成都610072)

光照有自然光照和人工光照兩種。在通常情況下，輔助生殖(in-vitro fertilization，IVF)實驗室的光照來自于人工光照，其光源是室內(nèi)的照明燈及各式顯微鏡的光源。光照可對生物細胞造成損傷。直接的光照可通過直接的和間接的途徑損傷生物細胞的DNA，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，導致細胞凋亡，基因突變，癌變或死亡［1］。光照對人類胚胎生長發(fā)育的影響，長久以來存有不同看法。光照一直是人類胚胎體外培養(yǎng)環(huán)境中最受爭議的因素。

1 光照種類及相關(guān)影響因素

1.1 紫外線(UV) UV 極具細胞毒性，尤其是高能量的UV 照射。胚胎對UV 照射的損傷也極為敏感，UV 照射可造成胚胎發(fā)育減緩，停滯，細胞凋亡，基因突變，染色體異常，失去著床能力等多方面的有害效應(yīng)。UV 對胚胎的損傷機理與其對生物細胞的損傷機理相同，既UV 可直接損傷DNA，也可通過多種途徑誘發(fā)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成。UV 射線對DNA 的攻擊性極強。除了因為UV 的波長正好在DNA 吸收峰附近外，DNA 還不具備避免UV 損傷的保護機制，因為DNA 不具有幾乎所有的生物組織都具有的UV 射線吸收因子(UVabsorbing agents)。因此DNA 成為生物細胞中最易受到UV 攻擊的靶子［2］。UV 造成的DNA 損傷有兩個特點:基因突變和具毒效性。前者來自于DNA 直接吸收UV 射線后產(chǎn)生的光產(chǎn)物;后者來自于UV激發(fā)的ROS 生成。

1.2 可見光 可見光能夠?qū)ε咛サ恼ＩL發(fā)育產(chǎn)生不利的負面影響，已在眾多的研究中得以證實［3～6］。具體表現(xiàn)是:暴露于可見光后，胚胎出現(xiàn)發(fā)育遲緩，甚至發(fā)育停滯，胚胎細胞出現(xiàn)凋亡、壞死?？梢姽庳撁嬗绊懙漠a(chǎn)生機理與可見光誘發(fā)的ROS含量升高有關(guān)，即可見光通過誘發(fā)細胞膜上的不飽和脂肪酸和類脂產(chǎn)生氧化反應(yīng)，從而導致ROS 生成增加。含量升高的ROS 進而可導致DNA 受損，以及細胞內(nèi)其他重要結(jié)構(gòu)被破壞。

在體外培養(yǎng)過程中，胚胎暴露于可見光是胚胎細胞內(nèi)ROS 含量明顯增高的原因之一。有的作者認為［6］，既使是短暫的暴露也足以使ROS 的累積量達到可造成傷害的病理水平。有實驗觀察到［7］:可見光照射5 分鐘之后，胚胎細胞內(nèi)ROS 的累積量即達到造成傷害的病理水平。Ashok 等報道［7］，將胚胎暴露于光強度為14000 lux 的顯微鏡可見光中，H2O2的生成量隨著光照時間的延長而增加，甚至每延長0．5 分鐘都可導致H2O2生成量顯著上升。

胚胎對不同波長的可見光的敏感度不同。不同波長的可見光對胚胎的損傷效應(yīng)也不同。在可見光的波長范圍內(nèi)，波長為400 ～500 nm 的藍光具有相對高的光照強度及組織穿透性，故對哺乳動物細胞傷害性較大。藍光的有害作用主要來自于其激發(fā)胚胎細胞產(chǎn)生H2O2，以及來自于藍光被呼吸鏈中的酶吸收后破壞細胞線粒體的能量代謝［8］。波長大于700 nm 的紅外線可導致人類精子產(chǎn)生過量的ROS，從而導致精子死亡［9］。

1.3 太陽光 在各種光照中，對胚胎最具殺傷力的是太陽光的光照。將小鼠受精卵暴露于中午的陽光中僅1 ～60 秒鐘，日后形成的囊胚中凋亡現(xiàn)象便明顯增加。囊胚移植后，與對照組相比，實驗組活產(chǎn)率的減少超過了60%［9］。

1.4 光照損傷與光照波長、強度和時間 光照對哺乳動物胚胎的損傷作用并不直接與光照強度和光照時間相關(guān)，而是與光照波長直接相關(guān)。紫外線(200～400 nm)，尤其是高能量的紫外線輻射對哺乳動物胚胎有著極強的毒性作用;可見光中的藍光(400～500 nm)及接近藍光的短波長光照對胚胎也有明顯的損傷作用;而波長大于藍光的其他可見光則負面作用明顯減小［10］。在同等光照強度和同等光照時間情況下，冷光源照射與熱光源照射對小鼠受精卵的損傷程度不同［11］，而冷熱光源的差別僅在于冷光源中含有更多的短波長可見光(400 ～500 nm)。不同波長的光照所誘發(fā)的H2O2的產(chǎn)生量也不同，因而對胚胎發(fā)育的干擾程度也就不同［11］。僅就光照波長敏感度而言，生物細胞對于波長小于360 nm的UV 射線最為敏感，其次是藍光(450 ～490 nm)，不太敏感的是綠光(大于500 nm)。哺乳動物胚胎對光照波長的敏感度也與一般生物細胞相類似。

在特定的光照波長下，光照對哺乳動物胚胎的損傷與光照強度和光照時間呈正比。即增強光照強度和延長光照時間均可使光照損傷加重。如將2-細胞的倉鼠胚胎暴露于波長為390 ～750 nm 的可見光下，隨著光照強度增加(200、500、900 lux)，胚胎發(fā)育至桑椹胚，囊胚的比例依次減小。若將倉鼠胚胎暴露于光照強度為14000 lux 的顯微鏡可見光中，隨著光照時間的延長，胚胎細胞內(nèi)H2O2的生成量逐步增加，甚至每延長0．5 分鐘光照都可看到H2O2生成量明顯上升［11］。

1.5 光照損傷與胚胎培養(yǎng)環(huán)境 光照誘發(fā)胚胎細胞內(nèi)ROS 生成增加的作用，受到胚胎培養(yǎng)環(huán)境因子的影響。這些影響因子包括:培養(yǎng)環(huán)境中O2的濃度和培養(yǎng)液中與抗氧化的有關(guān)成份。在相同的光照情況下，降低培養(yǎng)環(huán)境中O2的濃度，有助于減少ROS 的產(chǎn)生量。分析O2濃度與ROS 生成量的相關(guān)性可以看到［11］，在5% O2濃度的培養(yǎng)環(huán)境中，ROS的生成量最低;其次是20% O2濃度的培養(yǎng)環(huán)境;若當培養(yǎng)環(huán)境中的O2濃度達到40%時，ROS 生成量達到最大。另外，光照誘發(fā)的ROS 生成量也受到培養(yǎng)液中某些成分的影響。在培養(yǎng)液中加入L-半胱氨酸(L-Cysteine)，或?qū)⑴囵B(yǎng)液中的酚紅(Phenolred)去除均可顯著地降低ROS 的生成，削弱光照對胚胎的損傷。

2 光照對胚胎生長發(fā)育的負面影響

在自然條件下，哺乳動物的卵子和胚胎生長發(fā)育在沒有自然光照，也沒有人工光照的母體環(huán)境內(nèi)。因而哺乳動物的卵子和胚胎不具備有對抗光照的天然防御機制。然而在體外培養(yǎng)過程中，尤其是在ART 體外培養(yǎng)流程中，卵子和胚胎處于一個完全不同于其自然生長發(fā)育的環(huán)境條件內(nèi)，他們被反復地暴露于各種波長，各種強度的光照之下，短者數(shù)十秒，長者數(shù)分鐘。這些非生理性的光照對胚胎的體外生長發(fā)育起著極為不良的負面影響。

Girotti 等［12］關(guān)于光照能夠破壞胚胎發(fā)育潛能的研究，大概是最早的有關(guān)光照對胚胎具有不良負面影響的報道之一。他們發(fā)現(xiàn)，來自普通照明光源中的可見光對倉鼠(hamster)卵子具有很大的傷害作用，而帶有紫外射線的熒光燈比白熾光危害性更大。繼Girotti 的報道之后，光照對胚胎的毒性作用在多種動物模型中得以證實。

早期胚胎對光照傷害極為敏感，尤其是高能量的照射。在有的物種中，光照對胚胎的損傷甚至大于溫度下降所造成的胚胎損傷。Mauthe 等發(fā)現(xiàn)［13］，小鼠受精卵在受到波長為400 ～700 nm 的冷光源燈(實驗室內(nèi)一種常見的照明光源)照射15 分鐘之后，雖然可以發(fā)育至囊胚，但形成的囊胚中調(diào)亡的細胞數(shù)量明顯增加。將這些囊胚移植后，活產(chǎn)率僅為44%，與對照組的73%差別顯著。而倉鼠受精卵在受到同樣條件的光照之后，雖然97%的倉鼠受精卵仍可以完成第一次有絲分裂，但均不能繼續(xù)向前發(fā)育，更沒有囊胚形成。無論是小鼠受精卵，還是倉鼠受精卵，短暫1 ～60 秒的中午自然日光照射(光照強度大于20000 lux)就足以對它們造成災(zāi)難性的傷害。

雖然不同物種的胚胎對光照的敏感度不一樣，甚至同一物種的胚胎在不同的發(fā)育階段。對光照的敏感度也不完全一樣，來源于動物模型的光照對胚胎損傷的數(shù)據(jù)未必能完全代表光照與人類胚胎的關(guān)系，但是光照對生物細胞普遍具有毒性作用的結(jié)論是確定的。Noda 等［14］對IVF 實驗室內(nèi)的各種光源進行了仔細的分析。他們測量和計算了常規(guī)IVF 流程中各項主要操作所用的平均暴光時間和平均光照強度。如在進行取卵、ICSI、移植等操作時，卵子和胚胎暴露于顯微鏡光照下的平均光照時間為多少，操作人員所用的平均光照強度為多少，并且使用濾光片后各項數(shù)值的變化為多少。根據(jù)這些測量數(shù)據(jù)和所用光源的波長，他們計算出胚胎在各種光照情況下受到的損傷程度。根據(jù)所得數(shù)據(jù)得出結(jié)論:在常規(guī)的IVF 操作過程中，若不使用濾光片，胚胎所受到的光照已足以對胚胎造成傷害。目前這種由可見光造成的胚胎損傷并沒有引起各IVF 實驗室的普遍注意。

3 光照對胚胎造成損傷的機理

光照對細胞具有毒性作用己在多種動物胚胎以及多種細胞株中得以證實［15］，包括人體乳腺癌細胞。雖然光照毒性作用的詳細機理尚不完全清楚，但光照毒性的兩個顯著特點已在眾多種類的細胞中被觀察到［15］:一是光照后細胞內(nèi)的DNA 被破壞，二是光照后細胞內(nèi)的ROS 含量顯著升高。因此有人推測［16］，除了因DNA 可吸收某種波長的射線而遭電磁波直接的破壞外，光照損傷機理可能與光照可通過多種途徑誘發(fā)細胞內(nèi)ROS 生成，導致ROS 濃度異常升高，細胞內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)有關(guān)。ROS 是一類細胞有害物質(zhì)，其特征為具有一個或幾個不配對電子的分子、離子、原子或原子團。ROS 包括超氧化物(O2-)、過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(singlet oxygen，1O2)、羥自由基(HO·)以及各種脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。因含有未配對電子，ROS 的化學性質(zhì)十分活潑。在正常生理情況下，細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生與被清除處于一種動態(tài)平衡之中，使ROS 的含量維持在一個正常的生理水平上。當ROS 產(chǎn)生過量，不能被抗氧化系統(tǒng)及時清除時，作為非特異性細胞毒素，高濃度的ROS 可廣泛攻擊細胞的核酸，脂類及蛋白質(zhì)。致使DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物分子受損，相關(guān)細胞信號轉(zhuǎn)導和基因表達受影響，致使基因突變，線粒體受損，ATP 耗竭，細胞分裂阻滯，碎片增加，細胞凋亡，細胞退化及死亡。因此，光照對胚胎的損傷機理可能包括:①直接損傷DNA;②激發(fā)細胞內(nèi)ROS(特別是H2O2)產(chǎn)生;③破壞線粒體呼吸鏈中的酶;④引發(fā)細胞凋亡。

4 IVF 實驗室光照損傷的控制

光照，尤其是可見光的光照對配子，受精卵以及早期胚胎的負面影響在IVF 臨床實踐中尚沒有引起足夠的注意［16］。許多IVF 實驗室在實際操作中并未將避免光照，減少光照置入認真考慮的范圍內(nèi)［17］。人們對光照損傷的防御措施通常僅停留在控制室內(nèi)照明和減少胚胎在培養(yǎng)箱外的暴露時間上。實際上這是遠遠不夠的。在制定預(yù)防光照損傷的措施時，有些基本要點需要加以明確。例如:紫外線是最具光照毒性的射線;可見光也不是安全的射線;在IVF 操作流程中，室內(nèi)照明并不是造成胚胎光照損傷的主要光照來源。卵子，受精卵和胚胎的95%光照傷害來自于顯微鏡光源。IVF 實驗室控制光照損傷的具體措施應(yīng)該包括:①避免日光照射，實驗室應(yīng)以無窗為宜。②選擇正確的照明光源，避免在實驗室內(nèi)使用任何帶有紫外射線的光源，并控制實驗室內(nèi)各種光源的光照強度。③在顯微鏡上安裝濾光片，將小于500nm 波長的光線濾除。這是消除UV 和藍光的有效措施。④減少不必要的鏡下觀察及操作。⑤選用含有抗氧化因子的培養(yǎng)液。⑥采用低氧培養(yǎng)環(huán)境。由于光照可誘發(fā)基因突變，因此必需不斷地對光照可能造成的試管嬰兒近期和遠期的安全性問題進行評估。

［1］Richard M． Effects of light on mouse embryos:Less is more［J］．PNAS，2007，104(37):14547-14548．

［2］Anne B． Repair of DNA damage lnduced by ultraviolet radiation［J］．Plant Physiol，2010，108(6):891-896．

［3］Nakayama T，Noda Y，Gotoand Y，et al． Effects of visible light and other environmental factors on the production of oxygen radicals by hamster embryos［J］．Theriogenology，2009，41(2):499-451．

［4］Kati K，Sami Sjo V，Jouko V，et al． Viability of bovine embryos following exposure to the green filtered or wider bandwidth light during in vitro embryo production［J］．Human Reproduction，2009，24(2):308-314．

［5］Godley BF，Shamsi FA，Liang FQ，et al．Blue light induces mitochondrial DNA damage and free radical production in epithelial cells［J］．Biol Chem，2005，280(8):21061-21066．

［6］Oh SJ，Gong SP，Lee ST，et al．Light intensity and wavelength during embryo manipulation are important factors for maintaining viability of preimplantation embryos in vitro［J］． Fertil Steril，2007，88(9):1150-1157．

［7］Ashok A，Tamer MS，Mohamed AB，et al．Oxidative stress in an assisted reproductive techniques setting［J］．Fertility and Sterility，2006，86(3):503-512．

［8］Takenaka M，Horiuchi T，Yanagimachi R．Effects of light on development of mammalian zygotes［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(5):14289-14293．

［9］Konig K，Tadir Y，Patrizio P，et al．Effects of ultraviolet exposure and near infrared laser tweezers on human spermatozoa［J］． Hum Reprod，2009，11(8):2162-2164．

［10］Ottosen L，Hindkjr Ingerslev J．Light exposure of the ovum and preimplantation embryo during ART procedures［J］．Assist Reprod and Genet，2009，24(2-3):99-103．

［11］Guerin P，Mouatassim SEI，Menezo Y． Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the pre-implantation embryo and its surroundings［J］．Hum Reprod，2010，7(10):175-189．

［12］Girotti AW． Photosensitized oxidation of membrane lipids:reaction pathways，cytotoxic effects，and cytoprotective mechanisms［J］．Photochem Photobiol B，2010，63(10):103-113．

［13］Mauthe RJ，Cook VM，Coffing SL，et al．Exposure of mammalian cell cultures to benzo pyrene and light results in oxidative DNA damage as measured by 8-hydroxyguanosine formation［J］．Carcinogenesis，2011，16(6):133-139．

［14］Noda Y，Goto Y，Umaoka Y，et al．Culture of human embryos in alpha modification of Eagle's medium under low oxygen tension and low illumination［J］．Fertil Steril，2011，62(6):1022-1027．

［15］Mauthe RJ，Cook VM，Coffing SL．Exposure of mammalian cell cultures to benzopyrene and light results in oxidative DNA damage as measured by 8-hydroxyguanosine formation［J］． Carcinogenesis，2009，16(6):133-139．

［16］Girotti AW． Photosensitized oxidation of membrane lipids:reaction pathways，cytotoxic effects，and cytoprotective mechanisms［J］．Photochem Photobiol，2008，63(8):103-113．

［17］耿潔，胡玉琴，劉蘭蘭．卵子玻璃化冷凍在體外受精-胚胎移植取精失敗周期中的應(yīng)用［J］． 實用醫(yī)院臨床雜志，2014，11(1):156-157．