銀杏外種皮中染料木素的提取及分離

陳金銘 趙麗薇 莊鵬宇

(河北聯(lián)合大學(xué)藥學(xué)院 河北唐山 063000;①唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)林工程系)

銀杏是單科屬種植物，原產(chǎn)于我國(guó)，是現(xiàn)存種子植物中最古老的孑遺植物，有“活化石”之稱。其食用部分種核，俗稱白果，藥膳兼用，其根、莖、葉均可入藥，具有重要的研究?jī)r(jià)值和利用價(jià)值［1］。銀杏為裸子植物，其“果實(shí)”即為種子，最外層的種皮包被銀杏種核，成熟時(shí)呈黃色或黃棕色，柔軟多汁，具特殊的臭味，此為銀杏外種皮。

近些年來，在銀杏的研究進(jìn)展中，國(guó)內(nèi)外對(duì)銀杏葉中化學(xué)成分的研究工藝和方法已經(jīng)比較深入，但是相對(duì)而言，對(duì)銀杏外種皮中化學(xué)成分的開發(fā)還缺乏一定的研究，本文通過對(duì)銀杏外種皮進(jìn)行提取和分離，得到染料木素，并對(duì)其進(jìn)行薄層色譜測(cè)定，使用紫外可見光光譜測(cè)定等定性鑒別的方法加以驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)為銀杏外種皮的研究工藝及方法提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 銀杏外種皮，染料木素(sigma公司，純度98%)，羧甲基纖維素鈉(CMC，中國(guó)醫(yī)藥公司北京采購(gòu)供應(yīng)站)，薄層層析硅膠(GF-254，青島海洋化工公司)，柱層析硅膠(柱層層析硅膠，煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)公司)，石油醚(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，乙酸乙酯(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，乙醇(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)，正丁醇(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)，甲醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器 DS-1高速組織搗碎機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)，SL-302N電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，索氏提取器，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，ZF-1三用紫外分析儀(上?？等A生化儀器制造廠)，766-6型遠(yuǎn)紅外快速干燥箱(上海三星電熱儀器廠)，TU-1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用有限責(zé)任公司)。

1.3 方法

1.3.1 前處理。銀杏外種皮于60℃下烘干至恒重，用高速組織搗碎機(jī)搗碎，粉末過40目篩，取樣粉30g，用濾紙包好，置于索氏提取器中，向索氏提取器的圓底燒瓶中加入140mL石油醚(沸程30～60℃)，回流脫脂6h，將殘?jiān)〕?，置于通風(fēng)處自然晾干，備用。

1.3.2 提取。取20g經(jīng)過脫脂處理的銀杏外種皮粉末置于250mL錐形瓶中，按固液比1:10的比例加入體積分?jǐn)?shù)為65%乙醇液200mL，密閉條件下浸泡12h，室溫下在55℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1h，回收乙醇，再旋轉(zhuǎn)蒸干。待冷卻至室溫時(shí)，向其中加入100mL無水乙醇，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min，可得米黃色的提取液。過濾，可得到異黃酮的乙醇溶液，將其在55℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇。用80mL水飽和正丁醇溶液溶解，再用正丁醇飽和水溶液分3 次萃取(25mL，25mL，40mL)，棄去下層水層以除去糖類及色素，取上層溶液旋轉(zhuǎn)蒸干，得棕黃色固體，為銀杏異黃酮苷元［2］。

1.4 分離［3］

1.4.1 GF-254薄層層析板的制備。取羧甲基纖維素鈉(CMC)10g溶于1000mL沸水中配制成濃度為1%的CMC液，取上清液與薄層層析硅膠按約30mL:10g的比例混和調(diào)勻，待無氣泡時(shí)將調(diào)好的層析硅膠均勻鋪在潔凈的玻璃板上，放置于水平臺(tái)上自然晾干。將晾干的薄層板置烘箱中110℃活化30min，將活化好的GF-254薄層層析板置干燥器中備用。

1.4.2 洗脫劑(展開劑)的選擇。采用乙酸乙酯，氯仿:乙酸乙酯=1:1，氯仿:甲醇:乙酸=10:1:0.1分別做層析液，用染料木素標(biāo)準(zhǔn)品及上步提取的樣品在活化好的硅膠GF-254板上點(diǎn)樣，定距展開。風(fēng)干后，在ZF-1三用紫外分析儀于254nm下照射，觀察斑點(diǎn)的顏色，經(jīng)計(jì)算斑點(diǎn)的比移值乙酸乙酯Rf為(0.57，0.13)，氯仿:乙酸乙酯 =1:1 Rf為(0.44，0.26)，氯仿:甲醇:乙酸=10:1:0.1 Rf為(0.31，0.18)，符合要求的展開劑為乙酸乙酯。

1.4.3 硅膠柱的制備［4］。根據(jù)樣品的質(zhì)量選擇色譜柱的規(guī)格為φ20mm×600mm。取柱層析硅膠150g置于燒杯中，110℃活化1h，用加入一定量的洗脫劑，浸泡后超聲提取1h以除去氣泡。將色譜柱(φ40mm×400mm)垂直固定在支架上，在玻璃柱底端加入脫脂棉，使其成為一個(gè)表面平整的薄層，并加入少量的洗脫劑浸泡。沿玻璃棒加入硅膠，一邊沉降一邊加入，并且在色譜柱的管外輕輕給予敲打，使硅膠均勻地沉降，用洗脫劑洗脫至回收液無殘?jiān)?/p>

1.4.4 樣品的加入。將2g銀杏異黃酮樣品用少量的甲醇溶解，加入3g硅膠，置于蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸除溶劑至成“細(xì)沙流狀”。將樣品均勻的加到硅膠柱中使其均勻沉降。

1.4.5 展開與洗脫。當(dāng)樣品溶液全部沉降后，打開活塞將液體徐徐放出，當(dāng)液面與柱面相平時(shí)，緩緩加入洗脫劑，使洗脫劑的液面高出柱面約10cm。在層析的過程中逐步增加洗脫劑洗脫，用試管收集流份，每管收集10mL。

1.4.6 薄層層析。將各試管的流份在活化好的硅膠GF-254板上點(diǎn)樣，以乙酸乙酯為展開劑，定距展開。風(fēng)干后，在ZF-1三用紫外分析儀于254nm下照射，觀察斑點(diǎn)的顏色并計(jì)算斑點(diǎn)的比移值Rf。

1.4.7 紫外吸收峰。以甲醇作為對(duì)照，取0.5mL各試管流份，用適量甲醇稀釋，并將染料木素標(biāo)準(zhǔn)品將甲醇稀釋，在波長(zhǎng)200～600nm，吸光度0～3下測(cè)定紫外可見光光譜。

2 結(jié)果

2.1 柱層析分離結(jié)果 經(jīng)過薄層色譜展開后，試管6～15管的Rf為0.54，有紫色熒光斑點(diǎn)，即為分離得到的染料木素。

2.2 紫外可見光光譜鑒定結(jié)果 紫外可見光光譜測(cè)定，由于不知銀杏外種皮流分與染料木素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的具體濃度，在用甲醇溶液不斷稀釋的過程中，得到兩個(gè)峰形基本一致的圖譜，因此可初步判定銀杏外種皮中含有染料木素。

2.3 通過柱層析分離得到的流分，再用薄層色譜和紫外可見光光譜測(cè)定的結(jié)果，最終可初步判定銀杏外種皮中含有染料木素。

3 討論

①本實(shí)驗(yàn)用了3種洗脫劑進(jìn)行對(duì)比，乙酸乙酯為展開劑的各成分斑點(diǎn)間的距離較遠(yuǎn)，即每?jī)煞N成分的比移值差距較大，所以相對(duì)來說用乙酸乙酯做洗脫劑可以更好地分離。②在進(jìn)行薄層色譜分離時(shí)，由于各種原因，比移值并不是非常精確，例如22管的成分為過渡成分，比移值表現(xiàn)并不明顯，而在紫外吸收可見光光譜中表現(xiàn)明顯，更為精確。③為了更準(zhǔn)確地鑒定出銀杏外種皮中含有染料木素，由于用常規(guī)的一次硅膠柱色譜需要反復(fù)進(jìn)行分離，容易造成的樣品損失及大量時(shí)間的浪費(fèi)。所以可以采用重結(jié)晶技術(shù)，從銀杏葉提取物的水解物中提純出染料木素。④染料木素具有降低血糖的作用，如此，通過對(duì)銀杏外種皮中染料木素的提取分離，就找了含染料木素的新藥用植物，這樣就擴(kuò)大了新藥源。此外，染料木素還具有誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡、提高抗癌藥效、抑制血管生成等作用，是一種很有潛力的癌癥化學(xué)預(yù)防劑，其抗癌作用及機(jī)制具有廣泛的應(yīng)用前景。

［1］陳 鵬.銀杏產(chǎn)業(yè)提升和可持續(xù)發(fā)展［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002.28-30

［2］高俊濤，趙春燕.大豆異黃酮的研究進(jìn)展［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，26(1):56

［3］羅 虹，劉 鵬，李燕丹.大豆異黃酮苷元提取工藝的研究［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，28(4):45

［4］裴月湖，孔令義.天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005.23-25