FISH技術(shù)檢測(cè)乳腺癌HER-2基因的應(yīng)用體會(huì)

宋 容，劉 佳，吳立翔

（重慶市腫瘤研究所病理科 400030）

熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)是近年生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展較快的一項(xiàng)新技術(shù)，它的優(yōu)點(diǎn)在于敏感性高、特異性和重復(fù)性好［1］。目前，F(xiàn)ISH技術(shù)是檢測(cè)乳腺癌HER-2基因擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)。與疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，且對(duì)確定臨床治療藥物的選擇至關(guān)重要［2］。但技術(shù)方法應(yīng)用正確與否，容易造成結(jié)果判斷的錯(cuò)誤。因此，本文結(jié)合作者的臨床經(jīng)驗(yàn)，對(duì)FISH技術(shù)的操作進(jìn)行改進(jìn)，在實(shí)踐過程中取得良好效果，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年7月至2013年8月本院乳腺癌標(biāo)本86例，常規(guī)蘇木精-伊紅染色（HE染色）制片確診為浸潤(rùn)性乳腺癌，未經(jīng)過術(shù)前輔助化學(xué)治療，免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）法檢測(cè)c-erbB-2蛋白表達(dá)為（＋）、（＋＋）和（＋＋＋）的標(biāo)本進(jìn)行FISH基因檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 乳腺癌HER-2基因檢測(cè)試劑盒（F ISH法，內(nèi)有SSC、NP-40、HER-2、DAPI），石蠟預(yù)處理試劑盒（1N Na-SCN、胃蛋白酶、蛋白酶緩沖溶液），購(gòu)于雅培公司等。

1.2.2 試劑配制 胃蛋白酶溶液配制后分裝在1.5 mL EP管內(nèi)，置于-20 ℃冰箱中備用。配制好的洗液2＊SSC／0.3%NP-40 p H7.0，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 儀器 ThermoBritr（statspin）雜交儀，三用電熱恒溫水浴箱，離心機(jī)，Nikon Ds-Filc熒光顯微鏡。

1.2.4 FISH技術(shù)檢測(cè)

1.2.4.1 標(biāo)本的處理 乳腺癌粗針穿刺標(biāo)本、麥默通旋切標(biāo)本及乳腺癌根治術(shù)切除標(biāo)本，離體后5 min固定，用10%中性甲醛溶液固定6～48 h，取材后放入全自動(dòng)組織處理機(jī)內(nèi)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度2.5～3μm，裱貼于防脫玻片上。

1.2.4.2 切片處理 放入60 ℃～63 ℃培養(yǎng)箱中烤片過夜，常溫下二甲苯脫蠟10 min，重復(fù)2 次。常溫下無(wú)水乙醇5 min，重復(fù)1 次，切片自然干片或者置于37℃烤片機(jī)上2～5 min，徹底干片。

1.2.4.3 雜交前預(yù)處理 將預(yù)熱至80 ℃的預(yù)處理液1N Na-SCN溶液滴加入切片上，切片放入80 ℃恒溫水浴箱修復(fù)20 min，取出切片放入純水中浸泡3 min；再經(jīng)胃蛋白酶處理，取出切片，吸干組織周圍多余水分，將預(yù)熱至37℃胃蛋白酶液滴加入切片上10～15 min。切片放入純水中浸泡3 min，自然干片或者置于37 ℃烤片機(jī)上2～5 min，徹底干片。然后將切片依次浸入-20 ℃預(yù)冷的75%、85%、100%乙醇脫水各2 min，吸干組織周圍多余水分。

1.2.4.4 變性、雜交及洗滌 切片干燥后，探針混合物滴加于雜交區(qū)域，加蓋蓋玻片，封上封片膠，放入熒光原位雜交儀器上，開始變性，將變性溫度設(shè)置為85 ℃，時(shí)間5 min。然后雜交，雜交溫度為37 ℃，時(shí)間16～18 h；次日挪去切片上的封片膠，玻片置于常溫的洗滌液Ⅰ（2＊SSC／0.3%NP-40）浸泡5 min，除去蓋玻片；將玻片置于（73±1）℃預(yù)熱洗滌液Ⅱ（2＊SSC／0.3%NP-40）浸泡2 min，此步容易掉片。然后置于常溫的洗滌液Ⅲ（2＊SSC／0.3%NP-40）浸泡5 min，徹底干片。-20 ℃預(yù)冷的75%、85%、100%梯度乙醇脫水各1 min，自然干片后，加DAPI 復(fù)染液，蓋上蓋玻片，放于暗盒常溫或者4 ℃冰箱復(fù)染15～20 min，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

在熒光顯微鏡油鏡放大100倍下觀察，HER-2桔紅色，CEP-17 綠色，采用多個(gè)視野任意共選取40 個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)桔紅色信號(hào)和綠色信號(hào)，得出桔紅色信號(hào)／綠色信號(hào)（HER-2／CEP-17），如HER-2／CEP-17＜1.8，HER-2 無(wú)基因擴(kuò)增；如HER-2／CEP-17＞2.2，HER-2 基因擴(kuò)增；如介入兩者之間，重新選取40 個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3 討 論

乳腺癌嚴(yán)重威脅女性身心健康［3-4］，是最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。HER-2／neu原位基因，也稱為cerbB-2 基因，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。HER-2基因擴(kuò)增表達(dá)的檢測(cè)越來(lái)越受到重視，也為乳腺癌的臨床治療和判斷預(yù)后提供更準(zhǔn)確的參考［5］。FISH技術(shù)操作較繁瑣且實(shí)驗(yàn)結(jié)果較不穩(wěn)定，通過實(shí)踐對(duì)FISH技術(shù)檢測(cè)有如下幾點(diǎn)體會(huì)：

首先，F(xiàn)ISH標(biāo)本前期處理的關(guān)鍵是固定，防止組織細(xì)胞發(fā)生自溶，標(biāo)本離體后及時(shí)固定，較大組織采用剖開固定，保證組織充分固定，固定時(shí)間6～48 h 為佳［6］。固定液的量是組織的10 倍，固定液選擇10%中性甲醛溶液。若固定不足，易出現(xiàn)片狀染色，探針信號(hào)弱或缺失。過度固定，容易增加蛋白質(zhì)的交聯(lián)，延長(zhǎng)酶的消化時(shí)間，出現(xiàn)持續(xù)自發(fā)熒光。石蠟切片宜薄，約2.5～3μm較佳，探針相對(duì)容易進(jìn)去，組織結(jié)構(gòu)也可以辨別。切片太厚則很難得到好的雜交信號(hào)，并且信號(hào)容易重疊，極易造成細(xì)胞信號(hào)計(jì)數(shù)困難［7］。切片應(yīng)在溫水中充分展開貼于載玻片上，若切片貼不平就會(huì)造成消化不均勻，而且容易掉片。

石蠟切片預(yù)處理過程很重要，每一次溫度和時(shí)間都要嚴(yán)格控制，將已經(jīng)預(yù)熱至80 ℃的1N NaSCN溶液滴加入組織區(qū)域，放入80℃電熱恒溫水浴箱孵育20 min，溫度高低或時(shí)間長(zhǎng)短，都影響酶的消化時(shí)間的控制；在FISH技術(shù)操作過程中胃蛋白酶消化是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，若在此步驟處理不當(dāng)，影響最后的結(jié)果［8］。掌握正確的胃蛋白酶消化方法和時(shí)間控制是實(shí)驗(yàn)結(jié)果成敗的關(guān)鍵，本文采用胃蛋白酶滴加消化法替代了國(guó)內(nèi)現(xiàn)行的浸入消化法，孵育溫度37 ℃，實(shí)驗(yàn)取得最佳效果。用胃蛋白酶滴加消化替代蛋白酶K浸泡消化，克服了因蛋白酶K溶液易沉淀，造成組織切片上下及前后消化不均勻，影響結(jié)果的正確判讀。用胃蛋白酶滴加消化法，節(jié)約酶的用量，降低成本，縮短消化時(shí)間，提高了工作效率。胃蛋白酶滴加在組織區(qū)域消化時(shí)間12～15 min 最佳，可出現(xiàn)清晰信號(hào)，細(xì)胞核清晰可見、核膜完整、顏色適中。如果組織消化不足，出現(xiàn)核顏色較深、亮，強(qiáng)自發(fā)熒光，襯染背景過強(qiáng)，則預(yù)處理孵育時(shí)間應(yīng)增加30 min，或胃蛋白酶溶液消化時(shí)間延長(zhǎng)至20 min。過度消化，細(xì)胞核顏色褪色，細(xì)胞邊界消失，細(xì)胞膜呈鋸齒狀且核內(nèi)見空洞。若出現(xiàn)此現(xiàn)象應(yīng)重新操作樣本，減少預(yù)處理時(shí)間，或胃蛋白酶消化時(shí)間縮短。

變性、雜交的溫度和時(shí)間要適宜，探針混合物滴加在雜交區(qū)域，及時(shí)加蓋蓋玻片，用橡膠封邊，避免組織產(chǎn)生干片現(xiàn)象。加蓋蓋玻片動(dòng)作宜輕，避免產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致無(wú)信號(hào)和雜交率低。變性的最佳溫度85 ℃，時(shí)間5 min，雜交溫度37 ℃，時(shí)間16～18 h。標(biāo)本變性、雜交的溫度和時(shí)間未達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求步驟，可導(dǎo)致雜交無(wú)信號(hào)或雜交率低。造成原因可能是變性溫度過低、時(shí)間太短則無(wú)法打開DNA雙鍵。若變性溫度太高，時(shí)間太長(zhǎng)使標(biāo)本無(wú)法復(fù)性。若雜交溫度太低，時(shí)間太短使變性不充分。

充分的洗滌，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測(cè)過程中洗滌的時(shí)間、溫度和p H值嚴(yán)格掌握。作者采用自己配制洗滌液2＊SSC／0.3%NP-40（p H＝7.0）代替了50%甲酰胺3 次洗滌，不影響結(jié)果判斷，節(jié)約時(shí)間，降低成本，避免了甲酰胺對(duì)人體的危害。將配制好的2＊SSC／0.3%NP-40（p H＝7.0），放入4 ℃冰箱貯藏備用。用時(shí)觀察液體是否透明清亮，及時(shí)發(fā)現(xiàn)洗滌液是否渾濁，可以避免出現(xiàn)信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)等情況發(fā)生。洗滌不充分而出現(xiàn)綠色云霧狀背景，影響信號(hào)判讀，重新洗滌后綠色背景消失，為了防止洗掉組織自身信號(hào)，洗滌時(shí)間應(yīng)控制在10～12 min內(nèi)。洗滌時(shí)間長(zhǎng)、溫度高容易掉片。每次洗滌時(shí)應(yīng)振蕩數(shù)秒鐘，去除非特異性雜交物和降低蛋白自發(fā)熒光。在上述操作過程中應(yīng)注意避光。

總之，影響FISH熒光原位雜交信號(hào)的因素很多，組織大小、固定選擇和樣本質(zhì)量都可以影響FISH的結(jié)果。準(zhǔn)確掌握溶液的濃度、p H值，各步驟的溫度、時(shí)間，及時(shí)發(fā)現(xiàn)洗滌液是否渾濁，是FISH技術(shù)成功的關(guān)鍵。

［1］ 劉楊，龐達(dá).FISH技術(shù)在乳腺癌HER-2 基因檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.國(guó)際免疫學(xué)雜志，2009，32（2）：110-113.

［2］ 李琳，田玉旺，朱紅艷.乳腺癌HER-2 基因擴(kuò)增FISH檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用體會(huì)［J］.診斷病理學(xué)雜志，2010，17（4）：309.

［3］ 周雪瑞，黃選東.乳腺與乳腺癌［J］.生物學(xué)通報(bào)，2004，39（7）：26-27.

［4］ 沈鎮(zhèn)宇，邵志敏.乳腺腫瘤學(xué)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005：14-16.

［5］ 邢璐，談順，盧玉娟，等.FISH技術(shù)檢測(cè)乳腺癌HER-2 基因的探討［J］.診斷病理學(xué)雜志，2012，19（5）：400.

［6］ 陳杰.臨床病理科診斷常規(guī)［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2013：34.

［7］ 陳順平，余英豪.FISH技術(shù)在病理蠟塊操作中的應(yīng)用體會(huì)［J］.實(shí)用癌癥雜志，2010，25（5）：525.

［8］ 陳順平.FISH中酶消化細(xì)胞的幾點(diǎn)體會(huì)［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2010，26（1）：116-117.