豬飼料中黃曲霉毒素多種檢測(cè)方法的比較

馮艷忠，劉煥奇，沈 偉，王兆山，耿艷紅 ，李鳳蘭，徐會(huì)連，秦國慶，陳赫書，王眾濤，吳賽輝，郭振華，何鑫淼，王文濤，肖紹科，丁元霞，劉 娣

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109；3.山東省濱州職業(yè)學(xué)院，山東 濱州256603 ；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；5.日本自然農(nóng)法國際研究中心；6. InnoTech Nutritiom Solutions ， Durand Road Winnipeg；7.山東省梁山縣第一職業(yè)高級(jí)中學(xué)，山東 濟(jì)寧 272605；8.吉林省通化縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林 通化 134100）

現(xiàn)有飼料原料中霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)有國家標(biāo)準(zhǔn)，但檢測(cè)方法費(fèi)用高、耗時(shí)長，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要，也無法滿足國家對(duì)飼料質(zhì)量安全監(jiān)管和促進(jìn)進(jìn)出口貿(mào)易的迫切需要。因此，研究飼料中黃曲霉毒素安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)特別重要，特別是豬飼料中的銅及其他礦物質(zhì)含量較高，不同的檢測(cè)方法對(duì)結(jié)果可能帶來一定的干擾，應(yīng)該引起我們的重視，因?yàn)椋S曲霉毒素關(guān)系到杜絕畜禽食品安全隱患與危害，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定。

黃曲霉毒素的檢測(cè)方法從最初以薄層色譜法為主，發(fā)展到高效液相色譜法、微柱法、酶聯(lián)免疫吸附法等多種方法的普遍應(yīng)用[1]。

1 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）是測(cè)定黃曲霉毒素的經(jīng)典方法，是我國測(cè)定食品及飼料中AFB1的標(biāo)準(zhǔn)方法之一（GB/ T5009.23—1996）[2]。其原理是將樣品經(jīng)過提取、柱層析、洗脫、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色或黃綠色熒光，黃曲霉毒素B1、B2產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，黃曲霉毒素G1、G2產(chǎn)生黃綠色熒光，并根據(jù)其在薄層上顯示的最低檢出量來確定其含量，是一種半定量檢測(cè)技術(shù)。TLC有單向展開法和雙向展開法，其中雙向展開法能進(jìn)一步除去樣品中的雜質(zhì)，提高靈敏度。TLC法由于設(shè)備簡單，易于普及，所以國內(nèi)外仍在使用，但由于該法樣品前處理繁瑣，且提取和凈化效果不夠理想，提取液中雜質(zhì)較多，因而在展開時(shí)影響斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，雙向展開法雖避免了雜質(zhì)干擾，但增加了操作步驟和時(shí)間。TLC法較適合于對(duì)黃曲霉毒素的定性檢測(cè)，是研究黃曲霉毒素初期所使用的主要方法。

薄層色譜法對(duì)樣品處理繁瑣，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，所需時(shí)間多，易受雜質(zhì)干擾，準(zhǔn)確性差，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員危害大。

2 免疫化學(xué)方法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法是抗原或抗體吸附劑和用酶標(biāo)記的抗體或抗原與標(biāo)本中的待測(cè)物抗原和抗體起特異的免疫學(xué)反應(yīng)，用測(cè)定酶活力的方法來增加測(cè)定的敏感度，是一種定性的方法。大致采用2種方法檢測(cè)黃曲霉毒素：一種是用雙抗體夾心法；另一種是用競(jìng)爭法。免疫吸附法測(cè)定的試劑盒及配套儀器、方法被列入國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.22-2003食品中黃曲霉毒素B1的測(cè)定”[2]。Holladay等[45]采 取 間 接ELISA技術(shù)，檢測(cè)了抗黃曲霉毒素M1-牛血清白蛋白(AFM1-BSA)免疫原的特異性AFM1抗體。為了使用方便，利用酶聯(lián)免疫原理研制出黃曲霉毒素快速測(cè)試盒，能簡便地定量測(cè)定黃曲霉毒素含量。趙曉聯(lián)等[3]應(yīng)用這種快速測(cè)試盒測(cè)定黃曲霉毒素含量，先用三氯甲烷提取樣品，過濾，收集并水浴揮干提取液，再用甲醇溶解，最后用專用黃曲霉毒素試劑盒測(cè)定。關(guān)于運(yùn)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)AFB1的檢測(cè)報(bào)道也較多，目前國外已有較成熟的檢測(cè)食品及飼料中AFB1等真菌毒素的ELISA試劑盒出售，我國自20世紀(jì)90年代以來也有一些以ELISA檢測(cè)食品及飼料中AFB1的研究報(bào)道。如劉冬兒[4]報(bào)道了食品中AFB1的ELISA測(cè)定，線性范圍0.25～5.00ng/mL，檢測(cè)靈敏度達(dá)0.015μg/kg，比薄層色譜法提高300～400倍，回收率大于89.2%，精密度高，測(cè)定時(shí)間短，只需4h。酶聯(lián)免疫吸附法特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低，適于批量檢測(cè)，食品和飼料工業(yè)上可利用此方法來界定食品或飼料中黃曲霉毒素的超標(biāo)問題。由于酶本身的不穩(wěn)定性，用此方法檢驗(yàn)黃曲霉毒素有可能帶來假陽性或假陰性結(jié)果，復(fù)雜樣品受干擾，檢測(cè)準(zhǔn)確度不高。所以研制出的黃曲霉毒素快速測(cè)試盒多以測(cè)定最具毒性的種屬為主，酶聯(lián)免疫吸附法的檢測(cè)精度還有待于提高。

2.2 放射免疫法

放射免疫法與酶免疫法類似。但放射免疫法存在放射污染，已被淘汰。

2.3 親合層析法

利用免疫化學(xué)原理，抗體選擇性吸附抗原物質(zhì)AFB1，具有高靈敏、高選擇、高特異性等特點(diǎn)，提高凈化效果及檢測(cè)靈敏度，減少有毒、有害試劑的使用，有利于操作人員的健康和環(huán)境保護(hù)。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）是近幾年發(fā)展起來的檢測(cè)AFB1方法，主要是用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，在適宜的流動(dòng)相條件下，采用反相C18柱，使多種黃曲霉毒素同時(shí)分離。文鏡[5]采用國產(chǎn)硅鎂吸附柱層析分離純化玉米中AFB1，用HPLC法檢測(cè)，方法簡便，純化效果好，最低檢出量為0.08ng，回收率為92.87%，該法制柱方便，而且降低了成本。李佐卿等[6]則將免疫學(xué)技術(shù)和HPLC法相結(jié)合采用免疫親和柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，AFB1回收率達(dá)到97.3%，相關(guān)系數(shù)r=0.9994，最低檢出限為6.25pg，該法將提取、凈化、濃縮一次完成，大大簡化了前處理過程提高了工作效率及方法的靈敏度，但增加了成本。高效液相色譜法靈敏、分辨率高，可作定性、定量分析，同時(shí)可檢測(cè)多個(gè)黃曲霉毒素種類，適于大批量樣品的分析。高效液相色譜法儀器設(shè)備昂貴，技術(shù)水平要求高，每次實(shí)驗(yàn)所使用的化學(xué)藥劑和處理途徑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響程度差別很大，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精度造成影響；樣品還需進(jìn)行繁瑣的純化處理，不適合快速檢測(cè)。

4 微柱篩選法

微柱篩選法是將樣品提取液通過由氧化鋁與硅鎂吸附劑組成的微柱層析管，雜質(zhì)被氧化鋁吸附，黃曲霉毒素被硅鎂吸附劑吸附，在365nm紫外線下呈藍(lán)紫色熒光，其熒光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與黃曲霉毒素的含量成正比，由于微柱不能分離黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，故檢測(cè)結(jié)果為黃曲霉毒素的總量。微柱篩選法測(cè)定黃曲霉毒素，主要是用來檢驗(yàn)黃曲霉毒素的存在與否以及快速篩選出超標(biāo)樣品。要對(duì)黃曲霉毒素種類進(jìn)行區(qū)分定量檢驗(yàn)，則需要對(duì)不同黃曲霉毒素組分進(jìn)行分離，再利用其他方法檢測(cè)。因此，微柱篩選法并不能完成整個(gè)黃曲霉毒素的檢測(cè)過程，僅適用于定性檢驗(yàn)。

[1]JaneRoben.Noveltechnologiesforaflatoxindetectionopeningr e m a r k s[C].P r o c e d i n g so fthe2ndFungalGenomics,3rdF um on is inElimin a t i o nan d15thAflatoxinEliminationWorkshops,Texas,2002.54.

[2]GB8381—1987飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定方法半定量薄層色譜法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,1987.

[3]SDHolladay.間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)黃曲霉毒素抗體的評(píng)價(jià)[J].貴州畜牧獸醫(yī),1993,17(1)：46-47.

[4]陳福生,李根久.醬油中黃曲霉毒素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)[J].中國調(diào)味品,1998(8)：26-30.

[5]劉冬兒.酶聯(lián)免疫吸附分析法測(cè)定食品中的黃曲霉毒素B1[J].食品工業(yè)科技,2002,23(10)：79-89.

[6]文鏡.玉米中黃曲霉毒素B1的硅鎂吸附柱層析分離純化及HPLC的定量分析[J].食品科學(xué),1996,17（1）：68-70.

[7]李佐卿,謝東軍,孫大為,等.免疫親和柱HPLC熒光檢測(cè)酒中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].光譜試驗(yàn)室,2001,18(1)：28-31.