母代高脂飲食誘導(dǎo)子代在小鼠生命早期出現(xiàn)糖脂代謝紊亂且具有雄性易感性

鄭佳，肖新華，張茜，于淼，許建萍，王志新

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科，衛(wèi)生部內(nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

眾所周知，孕期和(或)哺乳期是影響子代生長發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。早在20世紀(jì)90年代，英國南安普敦大學(xué)Barker教授和劍橋大學(xué)Hales 教授就提出“胎兒代謝編程假說”，認(rèn)為生命早期包括孕期和(或)哺乳期營養(yǎng)不良對子代一生有長遠(yuǎn)影響，即早期營養(yǎng)不良者在成年時(shí)患肥胖、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、胰島素抵抗，糖尿病等代謝性疾病風(fēng)險(xiǎn)明顯升高[1]。近年來，大量的臨床隊(duì)列研究和動(dòng)物模型也證實(shí)了這一假說的存在。

大量動(dòng)物研究表明，母鼠營養(yǎng)過剩能夠?qū)е伦哟霈F(xiàn)肥胖，糖耐量異常，胰島素抵抗和血脂紊亂[3-5]。然而，這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)普遍關(guān)注的是母鼠高脂飲食對子鼠成年期甚至老年期的影響，在子鼠生命更早期如斷乳時(shí)是否存在代謝紊亂仍不清楚。因此，本研究旨在探討母鼠高脂飲食對子代生命早期糖脂代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及處理

SPF級 C57BL/6J小鼠，7周齡，雌性16只，雄性8只，體重18～20 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2013-0107】，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所SPF級的飼養(yǎng)間【SYXK(京)2013-0012】。普通飼料高脂飼料均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供?；谝酝鶎?shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，普通飼料的能量組成為：11.4%脂肪、62.8%碳水化合物、25.8%蛋白質(zhì)(總熱量：12.6 kJ/g)。高脂飼料的能量組成為：58%脂肪、25.6%碳水化合物、16.4%蛋白質(zhì)(總熱量：23.4 kJ/g)[6]。

7周齡C57BL/6J雌性和雄性小鼠給予1周時(shí)間適應(yīng)環(huán)境，期間均給予正常飲食。于8周齡時(shí)進(jìn)行交配，下午7時(shí)雌雄鼠2∶1合籠，翌日上午6 時(shí)觀察陰栓，以觀察到陰栓記錄為確定懷孕并記錄懷孕第0.5天。孕鼠單籠飼養(yǎng)并隨機(jī)分為高脂飲食組(high fat diet,HFD)和正常飲食組(normal chow diet,NCD)，每組8只。生產(chǎn)后將窩仔數(shù)量調(diào)整為6只，在哺乳期繼續(xù)孕期飲食飼養(yǎng)，3周后斷乳，具體實(shí)驗(yàn)流程如圖(圖1)。孕期和哺乳期均自由攝食飲水，晝夜各12 h循環(huán)，環(huán)境溫度保持在22±2°C，濕度適宜，每天記錄攝食情況。

子鼠于3周齡時(shí)，空腹12 h后，處死小鼠，從眼眶靜脈叢采血，4000 r/min，5 min常溫離心后取血清，置于-80℃以待進(jìn)行代謝指標(biāo)的測定。另外取肝臟組織置于放入4% 多聚甲醛固定。所有操作均在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所進(jìn)行，均經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 子代體重測量

母鼠于懷孕第0.5天與懷孕第20天測定體重。子鼠于出生第0.5天記錄出生體重，為了減少窩仔數(shù)量的差異，出生體重=窩重/只數(shù)。在哺乳期每只子鼠每三天測量1 次體重。

1.2.2 子代腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)

子代小鼠3 周齡時(shí)禁食12 h 后取尾靜脈血用德國拜安康血糖儀測定空腹血糖值，記為BG0。隨即，給予20%葡萄糖溶液(2 mg/g 體重)腹腔注射，分別于注射后30 min，60 min 和120 min取尾靜脈血測定血糖值，記為BG30、BG60 及BG120。根據(jù)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值計(jì)算糖耐量曲線下面積(area under the curve，AUC)，糖耐量曲線下面積公式為:AUC=0.5×BG0 + BG30)/2 + 0.5×(BG30 + BG60)/2 + 1×(BG60 + BG120)/2[7]。

1.2.3 子代胰島素測定和HOMA-IR值

小鼠血清胰島素測定采用小鼠超敏酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購于美國ALPCO公司，試劑盒編號為：80-INSMSU-E01,Salem,NH，批間差異為4.2%。所有操作均嚴(yán)格按照試劑操作說明書進(jìn)行，并且所有樣本均進(jìn)行雙孔重復(fù)。另外，采用胰島素抵抗指數(shù)穩(wěn)態(tài)模型(HOMA-IR)來評估子代小鼠胰島素抵抗的情況。HOMA-IR 的計(jì)算公式為：HOMA-IR值=空腹胰島素 (μU/mL) × 空腹血糖(mmol/L)/22.5[8]。

1.2.4 子代甘油三酯和膽固醇的測定

小鼠血清甘油三酯和膽固醇的測定采用比色法，試劑盒分別購于美國BioVision公司，試劑盒編號分別為甘油三酯(K603-100 ,Mountain View,CA)，膽固醇(K622-100,Mountain View,CA)。所有操作均嚴(yán)格按照試劑操作說明書進(jìn)行，并且所有樣本均進(jìn)行雙孔重復(fù)。

1.2.5 子代肝臟組織HE染色

3周齡子代小鼠處死后，剪開腹部，取肝臟，放入4% 多聚甲醛固定，24 h 后放入梯度酒精常規(guī)脫水包埋切片，切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察不同組別之間肝臟的病理改變。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,子鼠的出生體重，3周齡體重、糖耐量曲線下面積，胰島素，HOMA-IR值，總膽固醇、甘油三酯采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)實(shí)現(xiàn)，子鼠3周齡糖耐量實(shí)驗(yàn)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖采用方差分析,P< 0.05 認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 母鼠孕期體重、血糖變化情況

正常飲食組母鼠與高脂飲食組母鼠在孕前體重和血糖均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(19.2±1.61 vs.19.6±1.23，P> 0.05)。孕后第0.5天，較正常飲食組母鼠相比，高脂飲食組母鼠體重稍重(22.63±2.31 vs.26.43±2.32,P=0.043)，而兩組之間血糖差異無顯著性(P> 0.05)(表1)。

表1 高脂飲食組和正常組母鼠體重和血糖情況

2.2 子代小鼠體重增長情況

較正常飲食組子鼠相比，高脂飲食組子鼠出生體重稍輕(1.67±0.17 vs.1.51±0.14,P<0.05)。然而出生后第17天和出生后第21天，高脂飲食子鼠較正常組體重較重(圖2)，其中雄鼠在兩組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(8.74±1.14 vs.9.73±0.79,P=0.038)，而雌鼠未見明顯差異(表2)。

2.3 子代小鼠3周齡糖耐量情況和曲線下面積

由圖2 可知，高脂飲食組3周齡雄性子鼠腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)30 min和60 min血糖明顯高于正常組(P<0.001和P<0.01)，雌性小鼠在30 min(P<0.01)血糖高于正常組，差異均具有顯著性(圖3)。糖耐量曲線下面積比較，雄性子鼠高脂飲食組明顯大于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(8.08±1.49 vs.16.45±5.95,P=0.0016)。而雌性子鼠糖耐量曲線下面積在兩組之間差異無顯著性(表2)。

2.4 子代小鼠3周齡血清胰島素和胰島素抵抗指標(biāo)的評價(jià)

3周齡時(shí)，兩組雄性和雌性子代小鼠空腹胰島素水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。在評估胰島素抵抗的指標(biāo)方面，雄性小鼠HOMA-IR值高脂飲食組明顯高于正常飲食組(P<0.05)，而雌性小鼠HOMA-IR值在兩組之間差異無顯著性(P=0.13) (圖4)。

注：*P<0.05 vs.NCD組，各組n =8，NCD:正常飲食，HFD：高脂飲食。

2.5 子代小鼠3周齡血脂情況

3周齡時(shí)，兩組雄性和雌性子代小鼠空腹甘油三酯水平的差異均無顯著性(P均> 0.05)。而雄性和雌性子代小鼠空腹膽固醇水平高脂飲食組均高于正常飲食組，差異均具有顯著性(P值分別為<0.0001和0.0004)(表2)。

2.6 子代小鼠3周齡肝臟病理情況

由肝臟HE染色可知，高脂飲食組子鼠在3周齡時(shí)肝細(xì)胞就已經(jīng)出現(xiàn)明顯氣球樣變，伴有大量脂肪空泡形成，多為小泡型。而在正常飲食組子鼠的肝臟組織中沒有發(fā)現(xiàn)這一改變(圖5，見彩插1)。

3 討論

近年來，糖尿病的發(fā)病率急劇攀升。盡管人們普遍認(rèn)為基因與生活方式是糖尿病等代謝性疾病增加的主要因素，但是糖尿病發(fā)病率的急劇上升很難僅僅從基因和生活方式上得到解釋。隨著Barker 等[1]提出“胎兒代謝編程假說”這一理論之后，越來越多的研究開始關(guān)注早期發(fā)育環(huán)境對成年期發(fā)生代謝性疾病的影響。大量的臨床研究和動(dòng)物模型顯示早期營養(yǎng)不良者(包括營養(yǎng)缺乏與營養(yǎng)過剩)在成年期甚至老年期患肥胖、動(dòng)脈硬化、胰島素抵抗、糖尿病等代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高[9-12]。

注：**P<0.01，***P<0.001vs NCD組，各組雌雄n=8，NCD:正常飲食，HFD：高脂飲食。

注：*P<0.05 vs.NCD組，各組雌雄n =8，NCD：正常飲食，HFD：高脂飲食。

本研究顯示，較正常飲食組子鼠相比，高脂飲食子鼠雖然出生體重更低，然而3周以后，在斷乳時(shí)，高脂飲食子鼠體重就高于正常飲食組，并且在雄性小鼠中差異更為明顯。高脂飲食小鼠的生長率提示“追趕型生長”現(xiàn)象的存在。所謂追趕生長又叫補(bǔ)償性生長，用來描述因不良因素導(dǎo)致生長遲緩的個(gè)體在去除這些因素后出現(xiàn)的生長加速現(xiàn)象。大量證據(jù)顯示追趕生長能顯著增加肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病的易感性[13]。如果追趕生長發(fā)生在在生命早期即一出生就開始出現(xiàn)體重的急劇增加，那么追趕生長所帶來的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)更大[14]。通過監(jiān)測母鼠攝食量從而評價(jià)母鼠和子鼠的攝氏情況，結(jié)果顯示，在孕期和哺乳期兩組母鼠攝食量明顯差異，那么造成這一現(xiàn)象的存在可能與高脂飲食有關(guān)，與正常飲食相比，高脂飲食含有豬油、蛋黃粉、蔗糖、膽固醇 和酪蛋白等原料，因此能量較高。哺乳期的高脂飲食相對于正常飲食仍處于一種不良的宮內(nèi)環(huán)境之下，因此可以解釋高脂飲食組子鼠體重較低，而孕后期這一不良的宮內(nèi)環(huán)境解除，伴隨著高脂飲食的攝入，可能導(dǎo)致母乳能量較高，加之子鼠處于生長發(fā)育的高峰期，攝食量會(huì)較大，從而導(dǎo)致斷乳后體重明顯高于正常組。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，較正常飲食組子鼠相比，在斷乳時(shí)，高脂飲食組子鼠體重較重，并且已經(jīng)出現(xiàn)糖耐量異常，胰島素抵抗，血清膽固醇水平升高和肝臟脂肪變性。既往有研究顯示，母鼠在孕前，孕期和哺乳期持續(xù)高脂飲食能夠?qū)е伦哟?周至36周齡出現(xiàn)代謝性疾病，如肥胖，血脂紊亂，胰島素抵抗和糖尿病[5,15-17]。另一項(xiàng)研究顯示，母鼠高脂飲食能夠?qū)е伦哟?5周齡出現(xiàn)非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝炎，繼續(xù)飼養(yǎng)至30周齡，這種現(xiàn)象更為嚴(yán)重[18]。然而，這些實(shí)驗(yàn)都局限于只能觀察到早期不良營養(yǎng)對子鼠成年期或者老年期的影響，并不清楚這種不良的影響是何時(shí)開始出現(xiàn)的。因此與以往研究不同的是，本研究關(guān)注的是早期營養(yǎng)不良對子代生命更早期(斷乳時(shí))的影響，而不是成年期或者老年期，結(jié)果提示，在斷乳時(shí)這種不良的影響已經(jīng)存在并且會(huì)持續(xù)影響。

本研究顯示，在高脂飲食組，較雌性子鼠而言，雄性子鼠更易出現(xiàn)肥胖、糖耐量異常、胰島素抵抗，這與之前的研究結(jié)果一致[19,20]。這可能與雄性小鼠攝食量更多相關(guān)，另一解釋可能為雌性小鼠的糖脂代謝可能受到性激素水平的調(diào)節(jié)。

綜上所述，母代高脂飲食可以在生命早期水平就能影響子代小鼠的代謝狀態(tài)，使代謝相關(guān)器官功能受損，從而增加子代發(fā)生代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，推測可能是因?yàn)槟复涣嫉臓I養(yǎng)狀況引起宮內(nèi)環(huán)境的改變，從而導(dǎo)致在胚胎發(fā)育期或新生兒期造成與代謝相關(guān)的一些基因功能發(fā)生改變，從而引起子代在生命早期水平出現(xiàn)代謝紊亂[21]。如今，表觀遺傳學(xué)已經(jīng)成為眾多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。越來越多的數(shù)據(jù)顯示表觀遺傳學(xué)機(jī)制在糖脂代謝異常的發(fā)生發(fā)展的過程中起著十分關(guān)鍵的作用[22]。因此，表觀遺傳修飾是否與宮內(nèi)環(huán)境改變從而造成子代在生命早期出現(xiàn)代謝性疾病有關(guān)，這也是我們即將要進(jìn)一步深入研究和探討的問題。

(本文圖5見彩插1。)

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