豬偽狂犬病病毒的檢測方法研究進(jìn)展

顧 凡，黃 山，劉鵬娟，黃劍波，卓秀萍，朱 玲

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川 雅安；2.四川省雅安市石棉縣畜牧局，四川 雅安）

偽狂犬病(pseudorabies，PR)又稱奧葉茲基氏病，是由皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科中的偽狂犬病病毒(PRV或 ADV)引起的一種或多種動(dòng)物感染的急性傳染病，其中豬最易感，發(fā)病也最嚴(yán)重，是病毒的長期儲(chǔ)存者和排毒者，且具有高致死率，這無疑給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須上報(bào)的多動(dòng)物病毒共患病，該病自1902年在美國發(fā)現(xiàn)以來曾在全球范圍內(nèi)流行。目前一些國家已經(jīng)成功根除了這一疾病，但在我國，該病在大多數(shù)養(yǎng)殖區(qū)域依然存在。為了預(yù)防、控制進(jìn)而最終根除該病，研究人員對該病進(jìn)行了廣泛的研究，在國內(nèi)外研究人員的不懈努力下，建立了若干病原學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)等檢測方法。以下是這幾類主要方法的綜述。

1 病原學(xué)檢測方法

1.1 病理組織學(xué)檢測

成年豬主要表現(xiàn)為隱性感染，無明顯癥狀；母豬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎，仔豬表現(xiàn)發(fā)熱、昏迷、神經(jīng)癥狀、肌肉震顫，嚴(yán)重時(shí)四肢劃水樣運(yùn)動(dòng)，體溫升高達(dá)42 ℃。取樣本的腦和脊髓做組織切片，蘇木素-伊紅染色后觀察呈現(xiàn)非化膿性腦炎變化，其他部分剖檢特征不明顯。在神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可檢出A型核內(nèi)包涵體，眼觀主要見腎臟有針尖狀出血點(diǎn)，其他肉眼病變不明顯。

1.2 病毒分離檢測

病毒分離是采取病死豬或處于發(fā)熱期病豬的腦組織（中腦和腦橋含毒量最高）、腎及扁桃體等組織來分離病毒，經(jīng)滅菌的平衡鹽溶液或生理鹽水稀釋后接種在被培養(yǎng)成單層的細(xì)胞上，觀察至出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變。病毒分離鑒定是診斷該病的可靠方法，被認(rèn)為是診斷該病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。研究表明，用病毒分離免疫熒光染色和核酸探針雜交的方法分別檢測實(shí)驗(yàn)室感染的一株P(guān)RV，結(jié)果顯示，病毒分離方法和核酸探針雜交方法在檢測病料上具有很好的一致性。

1.3 動(dòng)物接種試驗(yàn)檢測

取分離的病毒上清液，在家兔腹側(cè)皮下注射2 mL/只。開始時(shí)家兔精神萎靡，食欲不振，于接種后8 h和10 h左右體溫上升最終達(dá)到39.5～41.5 ℃。2～3 d后，注射局部出現(xiàn)奇癢癥狀(啃咬注射部位)，致使皮膚破損出血，隨即后肢麻痹，臥地不起，不時(shí)出現(xiàn)痙攣，維持1～2 d后抽搐死亡。雞胚接種3～4 d后，雞胚死亡。囊膜水腫、充血、出血，并有數(shù)量不等、大小不一白色痘斑樣病灶，胚體萎縮，頭蓋部突起，全身彌漫性出血?？赏ㄟ^此現(xiàn)象判斷為已感染偽狂犬病病毒。

1.4 病毒粒子的形態(tài)觀察

偽狂犬病病毒有皰疹病毒的一般形態(tài)特點(diǎn)，即病毒粒子呈橢圓形或圓形外觀，位于細(xì)胞核內(nèi)，無囊膜的病毒粒子直徑約為110～150 nm，位于胞漿內(nèi)帶囊膜的成熟粒子直徑為150～180 nm。囊膜表面有呈放射狀排列的纖突，長度約為8～10 nm。核心致密，未成熟的病毒粒子呈中空狀。

2 血清學(xué)檢測方法

2.1 中和試驗(yàn)

血清中和試驗(yàn)技術(shù)(SNT)是檢測病毒比較經(jīng)典的血清學(xué)方法，應(yīng)用比較方便，很多國家都采用此法檢測PRV，方六榮等[3]用MSNT進(jìn)行了PRV的血清學(xué)調(diào)查。通過監(jiān)測中和指數(shù)和中和效價(jià)，發(fā)現(xiàn)MSNT的特異性很強(qiáng)，但敏感性較低。邱德新等[4]應(yīng)用血清中和實(shí)驗(yàn)(SNT)和偽狂犬病乳膠凝集實(shí)驗(yàn)(LAT)診斷試劑盒進(jìn)行了PRV抗體效價(jià)測定和相關(guān)性分析，結(jié)果表明2種方法檢測結(jié)果符合率高，特異性強(qiáng)，快速簡便和實(shí)用。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是目前最為廣泛應(yīng)用的一種免疫檢測方法，是被國際貿(mào)易指定檢測PRV的方法之一[5]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其作為檢測豬PR的首選血清學(xué)方法。美國也將ELISA作為PR的3種法定檢測方法之一。它是以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固體載體上，隨后的一系列免疫學(xué)和酶促生化反應(yīng)都在此固相載體上進(jìn)行的免疫酶測定實(shí)驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)適用于實(shí)驗(yàn)室大批樣品檢查，產(chǎn)地檢疫，流行病學(xué)調(diào)查和無本病健康豬群的篩選建立。

包 括 gE-ELISA，gC-ELISA，gG-ELISA ，gE-ELISA是一種靈敏度很高的ELISA，它是根據(jù)疫苗株缺失的糖蛋白構(gòu)建的一種鑒別ELISA。國內(nèi)蔣玉雯等[6](1988)建立了檢測偽狂犬病病毒抗體間接ELISA方法，認(rèn)為ELISA敏感性高，且快速、簡便，適于大面積血清學(xué)調(diào)查。Oirschot等通過ELISA中和試驗(yàn)檢測感染豬血清，進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，gC-ELISA和gE-ELISA方法較為敏感；Marchioli和Cook等建立了阻斷gG-ELISA技術(shù)，該方法較常規(guī)ELISA方法敏感性低[7]。唐勇[8]在克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上建立了gG-LAT、gG-ELISA 和 gE-LAT、gE-ELISA。結(jié)果表明，gG-LAT和gG-ELISA特異性強(qiáng)、敏感性高，目前，國際上有各種商品化ELISA試劑盒出售。汪招雄等[9]以豬偽狂犬病病毒(PRV)Ea株特異性單克隆抗體576株為捕獲抗體，純化的抗PRVIgG為檢測抗體，建立了檢測PRV抗原的雙抗體夾心ELISA方法。結(jié)果表明，雙抗體夾心間接ELlSA方法也具有敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織中PRV的檢測。

2.3 乳膠凝集試驗(yàn)

乳膠凝集試驗(yàn)技術(shù)(LAT)是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將抗原先用乳膠包被，然后再與相應(yīng)血清反應(yīng)，幾分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果。美國已經(jīng)有商品化的LAT試劑盒供臨床使用，LAT操作簡單、方便、快速，且敏感性高、特異性強(qiáng)，據(jù)實(shí)驗(yàn)比較，LAT比SNT敏感、適用于疫病監(jiān)測或流行病學(xué)調(diào)查，以及種豬群檢疫凈化陽性豬的初次篩選。另一方面，查找及消除非特異性凝集是今后努力的目標(biāo)之一。

2.4 血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)

該方法利用偽狂犬病毒能夠凝集某種動(dòng)物紅血球，HA可被抗偽狂犬病病毒的高免血清特異性抑制的原理來達(dá)到檢測偽狂犬病病毒的目的。吳平等[10]用單克隆抗體致敏綿羊紅細(xì)胞建立了反向間接血凝抑制試驗(yàn)(HI)，廖文軍[11]等以純化的抗人紅細(xì)胞單鏈抗體(ScFv)-PRV gE蛋白雙功能融合蛋白為抗原，建立了檢測豬偽狂犬病病毒gE抗體的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)[12]。與美國進(jìn)口的PRV抗體檢測gE-ELISA診斷試劑盒比較，紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測方法具有操作簡便、敏感性、特異性較高的特點(diǎn)，可用于PRV野毒感染的快速篩查。王云龍等[13]（2009)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室對比試驗(yàn)及臨床樣品檢測也證實(shí)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)具有簡便、特異、快速、適于基層養(yǎng)殖者使用的特點(diǎn)，在獸醫(yī)的檢測技術(shù)上具有很好的應(yīng)用前景。

2.5 免疫組化

免疫組織化學(xué)技術(shù)按照標(biāo)記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自顯影法等，利用抗原抗體特異性結(jié)合原理和組織化學(xué)方法，使其結(jié)合部位顯示出來，以達(dá)到對動(dòng)物組織或細(xì)胞中的抗原的定位、定量、定性的研究。其中運(yùn)用得較多的為免疫熒光試驗(yàn)(FA)，在1995年建立的熒光抗體染色（FA）技術(shù)可直接檢測組織培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)感染和自然感染的動(dòng)物病料中的PRV，同時(shí)做了阻斷試驗(yàn)和 TGEV、PEDV、HEV、RV、CDV、BEFV、BVDV 等交叉檢測試驗(yàn)，證明該診斷方法具有較高的特異性和敏感性。熒光抗體染色具有特異性強(qiáng)、精確性高和操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，是一種快速檢測PRV的方法。另一種常用方法，膠體金免疫層析，利用PCR技術(shù)從PRV基因組中克隆gE抗原表位基因，將其插入到載體中，構(gòu)建成原核表達(dá)質(zhì)粒，并誘導(dǎo)其表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后作為抗原，結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)，利用雙抗原夾心法在國內(nèi)首先建立了PRV gE抗體檢測的免疫層析試紙條。此后，廖文軍等也制作出檢測PRV gE抗體的雙抗原膠體金試紙條，其特異性和敏感性與美國IDEXX和法國LSI gE-ELISA抗體檢測診斷試劑盒檢測結(jié)果一致。該方法操作簡單、靈敏度高、特異性好，適合豬偽狂犬病的臨床診斷及豬偽狂犬病野毒感染的快速篩查。

2.6 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

利用微量瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)檢查豬血清中PRV抗體，AGID的原理是抗原和抗體在瓊脂中自由擴(kuò)散相遇后發(fā)生肉眼可見的沉淀。由于AGID技術(shù)操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，特異性好，無需特殊設(shè)備，與SNT技術(shù)相比有很大的優(yōu)勢，因此適用于基層獸醫(yī)單位和大型豬場的現(xiàn)場的定性診斷及豬群有無隱性感染的普查。

2.7 免疫電泳技術(shù)

免疫電泳技術(shù)(IE)是利用凝膠電泳與雙向免疫擴(kuò)散2種技術(shù)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法，建立了對流免疫電泳方法（CIE）檢測豬PRV血清抗體，研究人員又以中和試驗(yàn)做參考，對比研究了CIE和微量免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（MID）對PRV抗體檢測的效果，結(jié)果表明兩者敏感性相近，卻都不如中和試驗(yàn)敏感。但是 CIE 和 MID 方法對血清質(zhì)量要求不如VN方法嚴(yán)格。同時(shí)CIE表現(xiàn)出的快速診斷優(yōu)勢很明顯，特異性好，無交叉反應(yīng)。

3 分子生物學(xué)方法

3.1 核酸探針技術(shù)

核酸探針又稱核酸雜交，利用核苷酸堿基順序互補(bǔ)的原理，用特異的基因探針即識(shí)別特異堿基序列(靶序列)的有標(biāo)記的一段單鏈DNA(或RNA)分子，與被測定的靶序列互補(bǔ)，以檢測被測靶序列的技術(shù)。郭萬柱等[14]建立了用32P標(biāo)記PRV全基因組DNA和重組質(zhì)粒PSAGI-19 DNA作探針檢測PRV的DNA的斑點(diǎn)雜交法，2種探針均能檢測到10 pg的PRV DNA，但由于同位素標(biāo)記探針的放射性污染及危害使其應(yīng)用范圍受限。在PCR出現(xiàn)之前，原位雜交是短時(shí)間檢查 PRV 潛伏感染最敏感的方法[15]。此后，劉志杰等[16]利用PCR技術(shù)擴(kuò)增gE基因片段，制備了地高辛標(biāo)記的gE基因核酸探針，特異性好，對PRV野毒的最低檢出量為4 pg，敏感性高，與PCR檢測結(jié)果一致，表明該核酸探針技術(shù)靈敏性得到了提高，此后，國內(nèi)學(xué)者相繼利用偽狂犬病病毒保守性強(qiáng)的gp50基因擴(kuò)增產(chǎn)物制成地高辛標(biāo)記的探針，該探針的靈敏度達(dá)到 2pg DNA。即可用于豬偽狂犬病野毒感染的臨床診斷。由于核酸探針具有特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)而被應(yīng)用于PRV的診斷。DNA雜交技術(shù)雖然具有很高的敏感性，然而操作步驟比較繁瑣，需要提純DNA，僅限在條件較好的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種選擇性擴(kuò)增DNA或RNA的方法，通過測序?qū)Ρ葋磉_(dá)到檢測病毒的目的。Belak等建立了檢測PRV gB 基因的PCR方法，應(yīng)用它可以從PRV感染細(xì)胞、鼻細(xì)胞、急性與慢性感染的臟器中檢測到DNA，其中檢出率最高的組織為三叉神經(jīng)節(jié)，幾乎為100%。Harding等建立了擴(kuò)增PRV gD 基因以區(qū)分來自人和其他動(dòng)物皰疹病毒的PCR方法。國內(nèi)學(xué)者又建立復(fù)合 PCR，可用于擴(kuò)增 PRV gB、gE 基因，可有效地鑒別野毒感染和疫苗接種[17]。孫德剛等[18](2007)，建立了擴(kuò)增 PRV gD基因的PCR 方法，其特異性都較之前好。期間還有實(shí)時(shí)熒光定量PCR[19-21]，針對臨床上的混合感染問題又建立了多重PCR方法。潘群興等[22]建立了一種同時(shí)檢測豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)疫苗株與野毒株的多重PCR方法；曲光剛等[23]建立了PRV、PPV雙重PCR檢測方法，具有良好的特異性和敏感性；岳豐熊[24]建立了一種能夠同時(shí)檢測PCV2、PPV、PRV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的多重PCR方法(mPCR)；國外研究人員又建立了快速檢測PRV、PPV、PCV1和PCV2的多重PCR方法[25-26]；LeeCS等[27]建立了可同時(shí)檢測豬體內(nèi)偽狂犬病病毒、細(xì)胞巨化病毒和豬圓環(huán)病毒的多重PCR方法；YueF等[28]建立了快速檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重PCR方法。通過不同組合可檢測出1種或多種病毒。此后國內(nèi)研究者又參照GenBank中的豬瘟病毒(CSFV)、豬流感病毒(SIV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV) 、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基因序列，設(shè)計(jì)了5對引物擴(kuò)增其目的片段，通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化建立了檢測CSFV、SIV 、PCV2、PRV 和 PRRSV 的 多 重PCR(mPCR)診斷方法[29]。敏感性和特異性結(jié)果顯示，該mPCR對5種病毒的最低核酸檢測量為10 pg。PCR技術(shù)檢測PRV具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速、簡便、適合應(yīng)用在PRV的臨床檢測工作中。

3.3 環(huán)介導(dǎo)的恒溫檢測方法

環(huán)介導(dǎo)的恒溫檢測方法(LAMP)是一種快速簡便特異的檢測方法，已廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌病和病毒病的檢測。研究表明，利用該方法所建立的反應(yīng)體系在恒溫65 ℃水浴鍋中作用60 min便可得到環(huán)介導(dǎo)恒溫反應(yīng)所特有的階梯狀條帶，而豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和健康豬睪丸細(xì)胞的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，該檢測方法的敏感性是普通PCR方法的100倍。LAMP核酸檢測方法在檢測PRV早期感染方面具有顯著優(yōu)勢，如果能組裝成核酸檢測試劑盒，將會(huì)是就地臨床檢測PRV野毒感染的有力檢測工具。

3.4 基因芯片

基因芯片（又稱DNA芯片、生物芯片，genechip）技術(shù)作為一項(xiàng)高新技術(shù)，在面積不大的載體上如玻片上可實(shí)現(xiàn)對多種目的基因的同時(shí)檢測[30]。它是基于PCR技術(shù)和核酸雜交的原理，事先對載體表面進(jìn)行特定處理，將寡核苷酸片段或cDNA片段有序地、高密度地排列于固相載體上，形成DNA微陣列，用高精密度的激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)進(jìn)行雜交信號的檢測[31]。將gE基因作為目的基因，并根據(jù)其基因設(shè)計(jì)引物與探針，采用不對稱PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，將探針固定在表面經(jīng)過醛基化處理過的芯片上來檢測豬偽狂犬病病毒，構(gòu)建了PRV病原檢測基因芯片，達(dá)到了對豬偽狂犬病病毒檢測的目的[32]。

4 其他方法

除以上常用的檢測方法外，還有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn)、對流免疫電泳等試驗(yàn)檢測方法。

5 討論與展望

偽狂犬病病毒屬于皰疹病毒， 一旦感染就會(huì)終身帶毒， 注射疫苗雖能減少其發(fā)病， 但是不能完全阻止其感染和排毒， 在應(yīng)激條件下( 如密度過大、混群、轉(zhuǎn)欄、分娩等)，潛伏的病毒就會(huì)被激活，反過來影響其他正常豬。故開展種豬PRV的凈化是解決感染的首要問題。而要進(jìn)行凈化，建立能有效區(qū)分野毒感染和疫苗免疫的鑒別檢測方法則相當(dāng)重要。gE抗體檢測試劑盒是一種阻斷gE-ELISA，由于目前普遍使用gE基因缺失疫苗，因此通過gE-ELISA方法可以將疫苗免疫豬和野毒感染豬區(qū)別開來，在亞臨床感染和隱性感染的診斷中具有顯著優(yōu)勢。通過gE-ELISA的血清學(xué)檢測以及基于gE基因的PCR方法對發(fā)病豬檢測是目前實(shí)驗(yàn)室診斷中廣泛使用的方法。在規(guī)?；i場進(jìn)行全群采樣或抽樣后進(jìn)行g(shù)E抗體和基因的檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行隔離或淘汰處理，有計(jì)劃地進(jìn)行檢測可以顯著降低豬場的偽狂犬病病毒感染率，通過數(shù)次的檢測淘汰可以在某些豬場根除豬偽狂犬病病毒感染。因此在檢測方法中g(shù)E基因的檢測方法是將來根除豬偽狂犬病的主要方法也必將在豬偽狂犬病的凈化中發(fā)揮重要作用。

[1] 韓勇，李文剛，項(xiàng)朝榮，等.豬偽狂犬病病毒的分離和鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28(3)：43-45.

[2] 沈強(qiáng)，衛(wèi)秀余，金愛華，等.偽狂犬病弱毒株的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究［J].中國獸醫(yī)雜志，2000，26（9）：5-8.

[3] 方六榮，陳煥春，何啟蓋，等.應(yīng)用微量中和試驗(yàn)進(jìn)行豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)查[J].中國畜禽傳染病，1998，20(3)：151-153.

[4] 邱德新，陳煥春，何啟蓋，等.乳膠凝集試驗(yàn)與血清中和試驗(yàn)檢測豬偽狂犬病血清抗體的比較[J].中國預(yù)防醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22(4)：302-305.

[5] 牛春玲，祁小樂，崔保安，等. ELISA在豬偽狂犬病診斷中的應(yīng)用[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 ， 2004， 25(3)： 16-18.

[6] 蔣玉雯，黃國安，馮軍.應(yīng)用ELISA檢測豬的狂犬病病毒抗體 [J].中國畜禽傳染病，1988，40(3)；35-36.

[7] Gut M，Jaeobs L，Tyborowska J，et a1.A highly specific and sensitive competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)based on baculovirus expressed pseudorabies Virus glycoprotein gE and gI complex[J].Vet Microbiol，1999，69 (4)： 239-249.

[8] 唐勇.豬偽狂犬病鑒別診斷研究與豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組序列的測定[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[9] 汪招雄，何啟盞，劉麗娜，等.檢測偽狂犬病病毒雙抗體夾心間接ELISA方法的建立與應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006， 28(2)：220-225.

[10] 吳平，程由銓，莊向生，等.應(yīng)用反向間接血凝(抑制)試驗(yàn)檢測偽狂犬病[J].中國獸醫(yī)科技，1991，2l(11)：24-25.

[11] 廖文軍，吳健敏，覃紹敏，等.檢測豬偽狂犬病病毒gE抗體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的建立及應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(2)：162-165.

[12] 劉賀生，崔保安，何寶祥，等.偽狂犬病病毒血凝及血凝抑制試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志，2005，41(12)：20-21.

[13] 王云龍，王國強(qiáng)，李智濤，等.偽狂犬病病毒gE基因的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 ，2009，30(7)：38-42.

[14] 郭萬柱，馮炳芳.應(yīng)用32P標(biāo)記DNA探針檢測偽狂犬病病毒的研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，9(1)：52-56.

[15] 王琴，郭萬柱，陰文奇.應(yīng)用生物素標(biāo)記DNA探針檢測偽狂犬病病毒的研究[J].中國病毒學(xué)，1996，11(3)：284-286.

[16] 劉志杰，任慧英，溫建新，等.用地高辛標(biāo)記的核酸探針檢測豬偽狂犬病毒野毒感染的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39(11)：1621-1624.

[17] 周斌，蘇鑫銘，張素芳，等.PCR快速檢測偽狂犬病病毒野毒感染[J].中國病毒學(xué) ，2004，19(6)：612-615.

[18] 孫德剛，吳發(fā)興，李曉成，等.豬偽狂犬病PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國動(dòng)物檢疫 ，2007，24(2)：29-30.

[19] 趙麗，崔保安，陳紅英.等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測偽狂犬病病毒方法的建立與初步應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29(4)：433-436.

[20] 劉園園，吳暉，肖性龍.等.豬偽狂犬病病毒.TaqMan—MGB熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(4)：76-79.

[21] 呂建強(qiáng)，何云蔚，盧體康，等.偽狂犬病病毒實(shí)時(shí)熒光PCR的建立和應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31(3)：21-25.

[22] 潘群興，陳德，何孔旺，等.檢測PCV2、PPV、PRV疫苗株與野毒株的多重PCR方法[J].中國病毒學(xué)，2005，20(6)：603-606.

[23] 曲 光 剛 ， 沈 志 強(qiáng) ， 管 宇， 等.PRV、PPV雙重PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用[J].中國動(dòng)物檢疫，2007，24(11)：22-23.

[24] 岳豐熊，崔尚金，冉多良，等.PCV2 PPVPRV和PRRSV多重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38(8)：691-696.

[25] 趙耘，秦玉明，張廣川，等.豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒多重PCR方法的建立以及初步應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)雜志 ，2007，43(2)：3-6.

[26] Huang C，Hung JJ，WuCY，eta1.Multiplex PCR for rapid Detectionof pseudorabies virus，porcine parvovirus and por-cine cireoviruses[J].Vet Microbiol，2004，101(3)： 209-214.

[27] LeeCS.Moon HJ，YangJ S.et s1.Multiplex PCR for the simultaneous detection of pseudorabies virus，porcine cyto-megalovirus，andporcine Circovirusin pigs[J].JVirol Meth，2007，139(1)：139.

[28] Yue F，Cui S.Zhang C，et a1.A multiplex PCR for rapid and simultaneous detection of Porcine circovirus type 2，porcine parvovirus，porcine pseudorabies virus，and porcine repro.ductive and respiratory syndrome virus in clinical specimens [J].Virus Genes，2009，38(3)：392—397.

[29] 劉麗娜，何啟蓋，陳煥春，等.用多重PCR鑒別豬偽狂犬病野毒與疫苗毒的研究[J].中國獸醫(yī)科技，2005，35(2)：95-98.

[30] 張煥容，曹三杰，文心田，等.豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒病和豬流行性乙型腦炎檢測基因芯片的制備及檢測方法研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29(10)：796-801.

[31] 符芳，楊玉菊，陳微晶，等.五種重要豬病病毒基因芯片探針的建立及其應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2010，40(5)：501-505.

[32] 張煥容，曹三杰，文心田，等.偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒和流行性乙型腦炎病毒檢測基因芯片的制備[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，27(5)：667-670.