淫羊藿苷通過(guò)降低MMP-9抗自發(fā)性高血壓大鼠心室重構(gòu)*

王穎婉，李葉麗，李意奇，張麗梅，徐尚福，楊丹莉

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

心室重構(gòu)可見(jiàn)心肌細(xì)胞肥大、凋亡、心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)堆積，膠原量增加，膠原網(wǎng)受到破壞，心肌組織纖維化等，表現(xiàn)為心肌肥厚、心腔擴(kuò)大、心臟的收縮和舒張功能障礙。心室重構(gòu)是導(dǎo)致心力衰竭的關(guān)鍵因素，是心臟疾病走向終末期的一個(gè)必然階段[1]。因此，防治心室重構(gòu)已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。由于ECM的降解依賴基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，所以MMPs在心室重構(gòu)的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[2]。

淫羊藿具有“補(bǔ)腎陽(yáng)，祛風(fēng)濕，益氣力，強(qiáng)心力”等功效。淫羊藿苷(Icariin，Ica)是淫羊藿的主要活性成分之一，具有降血壓、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及抗骨質(zhì)疏松等作用[3]。本研究擬觀察淫羊藿苷是否具有抗自發(fā)性大鼠心室重構(gòu)的作用，及該效應(yīng)是否與MMP-9有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 14周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，14周齡同源正常的京都大鼠(WKY)，SPF級(jí)，體重260～300 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。

1.2 試劑及儀器 淫羊藿苷(純度 ≥ 98 %)購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥有限公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司； MMP-9、TIMP-1 mRNA引物由寶生物工程(大連)有限公司合成；real-time RT-PCR 擴(kuò)增儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；通用酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD 公司。

1.3 分組及給藥 21只14周齡雄性SHR大鼠隨機(jī)分為模型組、Ica低劑量組(20 mg/kg)、Ica高劑量組(40 mg/kg)，每組7只，7只WKY大鼠為空白對(duì)照組。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，Ica低、高劑量組灌胃給藥，每日2次，至26周齡，空白和模型組給予等體積雙蒸水，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死全部動(dòng)物，取標(biāo)本備用。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)

1.4.1 大鼠血清中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的檢測(cè) 采用ELISA方法檢測(cè)大鼠血清中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量。腹主動(dòng)脈取血2 mL，置于促凝管中，離心后取上清，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、加樣、溫浴、洗滌、加酶、洗滌、顯色、測(cè)定。計(jì)算出大鼠血清中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量。

1.4.2 病理學(xué)觀察 取各組大鼠心臟組織，置于10%福爾馬林固定48 h后，經(jīng)脫水、包埋、切片和HE染色，觀察心肌形態(tài)學(xué)改變。

1.4.3 心肌組織中MMP-9、TIMP-1因子 mRNA的表達(dá) 每組各取心臟標(biāo)本7例，采用real-time RT-PCR法檢測(cè)。MMP-9、TIMP-1的mRNA 序列引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成(見(jiàn)表1)。目的基因表達(dá)相對(duì)定量法：以PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct值)為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，依次計(jì)算平均Ct值=(Ct1 + Ct2)/2(重復(fù)管)；dCt =平均Ct值-中間值；基因的表達(dá)=2-dCt；相對(duì)定量=目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)×100，將空白對(duì)照組的mRNA 表達(dá)量設(shè)定為100。

表1用于Real time RT-PCR的引物序列

基因基因庫(kù)編碼上游下游MMP-9NM_031055.1AGCCGGGAACGTATCTGGATGGAAACTCACACGCCAGAAGTIMP-1NM_053819.1CATCTCTGGCCTCTGGCATCCATAACGCTGGTATAAGGTG-GTCTCβ-actinNM_031144.2GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGACTCATCGTACTCCTGCTT-GCTG

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的結(jié)果 與空白組WKY大鼠相比，模型組SHR大鼠的Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯上升(P<0.01)，與模型組相比，Ica低、高劑量組的Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯下降(P<0.01或P<0.05)，且Ica低高劑量組間無(wú)差異。

組別Ⅰ型膠原(nmol/L)Ⅲ型膠原(nmol/L)空白組3.30±0.177.01±0.74模型組3.92±0.38**13.71±3.76**Ica低劑量組(20 mg/kg)3.34±0.22#6.61±1.08##Ica高劑量組(40 mg/kg)3.41±0.20#8.15±1.36#F3.4437.138

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 病理學(xué)觀察 HE染色顯示，與空白組相比，模型組心肌細(xì)胞肥大、延長(zhǎng)，排列紊亂，膠原聚集，血管周圍纖維化和心肌間質(zhì)纖維化明顯增加。與模型組相比，Ica低、高劑量組心肌細(xì)胞排列較整齊，血管周圍纖維化及間質(zhì)纖維化均減輕(見(jiàn)圖1)。

注：A：空白組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組。 圖1 淫羊藿苷對(duì)SHR大鼠左室心肌病理學(xué)的影響(HE× 200)

2.3 心肌組織中MMP-9、TIMP-1因子mRNA的表達(dá) 與空白組相比，模型組MMP-9、TIMP-1 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。與模型組相比，Ica低、高劑量組MMP-9 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01或P<0.05)，TIMP-1 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01或P<0.05)，且Ica低高劑量組間無(wú)差異(見(jiàn)表3)。

組別MMP-9TIMP-1空白組100±14.14100±9.38模型組255.21±11.45**150.64±5.83**Ica低劑量組(20 mg/kg)173.96±12.32#275.06±17.98#Ica高劑量組(40 mg/kg)155.87±2.87##250.26±3.68##F7.713 21.291

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

SHR大鼠與人類原發(fā)性高血壓的發(fā)病過(guò)程和機(jī)理非常相似，此鼠高血壓自發(fā)率為100%，還能繼發(fā)高血壓性心血管病變。WKY大鼠是SHR大鼠同源血壓正常的京都大鼠。有研究表明，SHR大鼠在24周齡時(shí)即可明顯發(fā)生血管周圍纖維化和間質(zhì)纖維化[4]。本研究中14周齡雄性SHR大鼠喂養(yǎng)至26周齡，模型組大鼠血清Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯上升，病理學(xué)HE染色結(jié)果顯示心肌細(xì)胞肥大、延長(zhǎng)，排列紊亂，膠原聚集，血管周圍纖維化和間質(zhì)纖維化，可認(rèn)為心室重構(gòu)模型制模成功。而Ica低、高劑量組給藥至26周齡時(shí)，心肌細(xì)胞排列較模型組整齊，血管周圍纖維化程度及間質(zhì)纖維化減少，大鼠血清Ⅰ、Ⅲ型膠原含量較模型組明顯下降。因此，可以認(rèn)為Ica具有抗自發(fā)性高血壓大鼠心室重構(gòu)的作用。

心肌中MMPs是特異性降解心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的酶家族，是影響心室重構(gòu)的重要因素。有實(shí)驗(yàn)表明，MMPs的升高與左心室重構(gòu)有密切的關(guān)系[5]。Spinale 等對(duì)37例擴(kuò)張型心肌病患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)左心室MMPs 的含量較空白組高2倍。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶-9，又稱明膠酶B，是MMPs中分子量最大的酶。在纖維化早期MMP-9是分解ECM的主要酶，可引起ECM退化，導(dǎo)致心肌排列紊亂及收縮功能異常[6]。MMP-9除降解基質(zhì)組分外，還能調(diào)控膠原合成，正常的膠原蛋白可被MMP-9分解，并被缺乏連接結(jié)構(gòu)的纖維代替，最終纖維化增加伴隨MMP-9升高[7]。本研究中，模型組大鼠MMP-9的表達(dá)明顯升高，而Ica低、高劑量組大鼠較模型組MMP-9的表達(dá)均明顯降低。提示Ica抗SHR心室重構(gòu)的機(jī)制可能與降低MMP-9的表達(dá)有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)，是MMP-9內(nèi)源性抑制劑，通過(guò)與之結(jié)合，特異性抑制MMP-9的活性。有研究表明，增加TIMP-1的表達(dá)可減少成纖維細(xì)胞的形成[8]。本研究結(jié)果顯示，Ica可明顯增加TIMP-1的表達(dá)，減少心肌血管周圍纖維化和間質(zhì)纖維化的形成。但值得注意的是，模型組的TIMP-1表達(dá)也升高，這可能與MMP-9的顯著升高，代償性地激活TIMP-1有關(guān)，但隨著病程的延續(xù)和加重，TIMP-1代償性的升高并不能完全抑制MMP-9的表達(dá)。綜上，Ica抗SHR心室重構(gòu)的機(jī)制可能與降低MMP-9、升高TIMP-1的表達(dá)有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Karaahmet T，Tigen K，Dundar C，et al. The effet of cardiac fibrosis on left ventricular remodeling，diastolic function，and N-terminal pro-B-type natriuretic peptide

levels in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy [J] . Echocardiography，2010，27(8)：854-960.

[2] 商卓，王文. 基質(zhì)金屬蛋白酶與壓力超負(fù)荷致心室重構(gòu)的研究進(jìn)展 [J]. 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2010，38(3)：324-327.

[3] 李利生，劉娟，王安斌，等. 淫羊藿苷對(duì)大鼠肝藥物代謝Ⅱ相酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)[J]. 2012，35(1)：13-16.

[4] 于學(xué)軍，戚文航，顧德官，等.自發(fā)性高血壓大鼠左室肥厚及心肌纖維化的動(dòng)態(tài)變化[J]. 高血壓雜志，1999，7(2)：159-162.

[5] 劉軍鋒，賈克剛，劉運(yùn)德. 基質(zhì)金屬蛋白酶與心臟重構(gòu)及心肌病理?yè)p害的研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年心血管病雜志， 2007，7(9)：499-500.

[6] Li M，Yang G，Xie B，et al. Changes in matrix metalloproteinase-9 levels during progression of atrial fibrillation [J]. J int Med Res，2014，42(1)：224-230.

[7] Roten L，Nemoto S，Simsic J，et al . Effects of gene deletion of the tissue inhibitor of the matrix metalloproteinase-Type 1 ( TIMP-1) on left Ventricular geometry and function in mice [J].J Mol Cell Cardiol，2000，32(1)：109 - 120.

[8] Kinoshita T，Ishikawa Y，Arita M，et al. Antifibrotic response of cardiac fibroblasts in hypertensive hearts through enhanced TIMP-1 expression by basic fibroblast growth factor [J]. Cardiovasc Pathol，2014，23(2)：92-100.