穿心蓮內(nèi)酯對人舌鱗癌Tca8113細胞增殖和凋亡的影響

涂玉綺，唐維平

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，南昌 332300）

目前，舌鱗癌在口腔惡性腫瘤中的發(fā)病率最高，其生長快，浸潤性強，惡性程度高，且轉(zhuǎn)移高，預(yù)后較差［1］。近年來中草藥中的抗腫瘤藥物成為了研究的熱點［2］。穿心蓮是一種爵科植物，現(xiàn)已有許多國家在研究使用。穿心蓮的主要活性成分有二萜內(nèi)酯類，黃酮類和多酚類物質(zhì)［3－5］。穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，AD）是穿心蓮中的二萜內(nèi)酯類化合物，不僅有抗炎、抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用外，還表現(xiàn)出較強的抗腫瘤作用［6－7］。AD對舌鱗癌作用效果尚未見報道，本研究旨在檢測AD對舌鱗癌Tca8113細胞的增殖、細胞周期和Bax、Bcl－2 mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 AD購于上海源葉生物科技有限公司，RPMI－1640、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）、二甲亞砜（DMSO）均購于北京索來寶科技公司，凱基細胞DNA含量檢測試劑盒購于凱基生物公司，Trizol RNA提取液、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Takara公司，PCR引物由南昌賽爾科學(xué)儀器有限公司長城生物試劑部設(shè)計合成。酶標儀（Dencey Dragon，芬蘭），Biofuge primo?臺式低溫高速離心機（賽默飛世爾科技公司，美國），MyCycler型PCR儀（Bio－RAD，美國），DYCP－31C型電泳儀（北京六一儀器廠生產(chǎn)），流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人舌鱗癌Tca8113細胞為本科室傳代保株。細胞在常規(guī)條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 鏡下觀察細胞形態(tài) 各組細胞（加入AD）分別培養(yǎng)24h和48h后，觀察Tca8113細胞形態(tài)。

1.2.3 MTT法檢測AD對細胞的增殖抑制 將Tca8113細胞按每孔1×104個細胞接種到2塊96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24h。試驗設(shè)陰性對照組、DMSO溶劑對照組、給藥組。給藥組分別加入濃度為0、10、20、40、80、160μg／mL的AD（用DMSO溶解，終濃度小于或等于0.5%）200μL，每組6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48h后，每孔加入 MTT液20μL（5mg／mL），再培養(yǎng)4h，吸盡上清液加入150μL DM－SO，37℃下震蕩10min，上酶標儀檢測，設(shè)定波長為492nm的光密度吸收值，計算細胞的增殖抑制率和IC50值。細胞增殖抑制率（%）＝（1－給藥組OD值／對照組OD值）×100%，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期的分布 將Tca8113細胞按每個孔5×105個置于2塊6孔板中，培養(yǎng)24h。設(shè)對照組和給藥組，給藥組加入AD（終濃度分別為20、40μg／mL，分別命名20、40μg／mL給藥組）。分別培養(yǎng)24h和48h后，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶2.5g／L消化，制成單細胞懸浮液。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，70%的乙醇固定，離心，洗滌，加入100μL 37℃水浴30min，再加入400μL碘化丙啶（PI）4℃避光30min，上流式細胞儀檢測。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）檢測 將Tca8113細胞按每個培養(yǎng)皿1×106個置于5個6cm2的培養(yǎng)皿中。細胞培養(yǎng)24h貼壁后，設(shè)對照組和給藥組，給藥組加入AD（終濃度分別為5、10、20、40μg／mL）。培養(yǎng)24h后，采用 Trizol法提取總RNA。紫外分光光度法測定RNA的A260／A280值及含量，用無核酸酶水將各組總RNA調(diào)整至同一濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。β－actin上游引物5′－CGG GAA ATC GTG CGT GAC－3′，下游引物5′－TGG AAG GTG GAC AGC GAG G－3′，擴增長度為443bp；Bax上游引物5′－AGG ATG ATT GCC GCC GTG GA－3′，下游引物5′－CAC CAC TGT GAC CTG CTC CAG A－3′，擴增產(chǎn)物長度為365 bp；Bcl－2上游引物5′－TGG CCC CCG TTG CTT TTC CT－3′，下游引物5′－AAG CTC CCA CCA GGG CCA AA－3′，擴增產(chǎn)物長度為714bp。熱循環(huán)參數(shù)：β－actin 94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共30個循環(huán)；72℃延伸8min；Bax 94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s、52℃退火30s、72℃延伸40s，共30個循環(huán)，72℃延伸8min。Bcl－295℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)；72℃延伸8min。取PCR產(chǎn)物5μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Tca8113細胞形態(tài)學(xué)變化 倒置顯微鏡下見對照組細胞生長旺盛，貼壁生長，呈多角形，形態(tài)飽滿，加入不同濃度的AD后，部分細胞體積變小，變圓，脫壁細胞增多并漂浮在培養(yǎng)基中。

2.2 AD對Tca8113細胞增殖的抑制作用 細胞的抑制率隨著AD濃度的增加而升高，存在劑量依賴性（P＜0.01）；隨著作用時間的延長，同一濃度的AD對舌鱗癌細胞的抑制率升高，具有時間依賴性（P＜0.05）。細胞加AD培養(yǎng)24h后的細胞半數(shù)致死值（IC50）為74.66μg／mL，見表1。

2.3 AD對Tca8113細胞周期分布的影響 不同濃度的AD分別作用24h和48h后Tca8113細胞周期分布結(jié)果見表2、3，圖2、3。結(jié)果顯示在相同的時間內(nèi)，隨著AD濃度的升高，G0／G1期細胞比例有明顯上升（P＜0.01），S期細胞比例明顯下降（P＜0.01）；在相同濃度的AD的作用下，隨著作用時間的延長，G0／G1期細胞比例明顯上升，而S期細胞比例明顯下降，而對照組細胞周期隨時間的變化細胞周期分布變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），AD能使Tca8113細胞周期阻滯于G0／G1期，且表達出明顯的劑量和時間依賴性。

2.4 RT－PCR檢測結(jié)果 結(jié)果顯示隨著AD濃度的增加，Tca8113舌癌細胞中Bax mRNA的表達水平逐漸增加；而Bcl－2mRNA的表達量逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4，圖4。

表1 不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對舌癌細胞抑制率（，n＝6）

表1 不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對舌癌細胞抑制率（，n＝6）

AD濃度（μg／mL） 抑制率（%）24h 48h 00010 2.37±0.19 11.37±1.0120 11.34±1.01 27.43±1.9340 36.65±1.99 46.08±3.2880 49.61±3.34 65.59±6.33160 72.11±5.01 79.47±7.33

圖1 AD對Tca8113細胞增殖的抑制作用

表2 不同濃度AD作用24hTca8113舌癌細胞周期分布（，n＝3）

表2 不同濃度AD作用24hTca8113舌癌細胞周期分布（，n＝3）

濃度（μg／mL）細胞周期（%）G0／G1 S G2／M 0（對照組）39.45±0.56 56.55±0.53 4.00±0.0820 49.10±0.81 46.57±0.60 4.32±0.2340 56.61±0.64 36.86±0.73 6.53±0.17

表3 不同濃度AD作用48hTca8113舌癌細胞周期分布（，n＝3）

濃度（μg／mL）細胞周期（%）G0／G1 S G2／M 0（對照組）40.16±1.03 58.21±0.75 1.52±0.3820 57.34±0.65 37.23±0.76 5.43±0.2140 63.70±0.65 32.28±0.54 4.02±0.12

表4 不同AD濃度作用24h后對細胞Bax、Bcl－2mRNA相對表達量的影響（，n＝3）

表4 不同AD濃度作用24h后對細胞Bax、Bcl－2mRNA相對表達量的影響（，n＝3）

Bax Bcl－20（對照組）AD濃度（μg／mL）0.383±0.013 1.137±0.0165 0.513±0.021 0.913±0.02510 0.631±0.036 0.570±0.03020 0.733±0.042 0.403±0.03240 0.916±0.048 0.333±0.025

圖2 AD作用24h后對細胞周期的影響

圖3 AD作用48h后對細胞周期的影響

圖4 RT－PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討 論

舌癌的治療手段目前是以手術(shù)為主，放化療為輔的綜合治療［1］?；煘橐环N全身性的治療手段，越來越受到腫瘤學(xué)界的重視，近年來中草藥中的抗腫瘤藥物成為研究的熱點［2，8］。

MMT法是一種檢測細胞存活和生長的方法，已廣泛用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選［9］。它的特點是靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡單、經(jīng)濟快速［9］。本實驗中采用 MTT法對AD抑制人舌鱗癌Tca8113細胞增殖的作用進行了測定并求出各濃度AD對人舌鱗癌細胞的抑制率，發(fā)現(xiàn)AD能夠明顯的抑制人舌鱗癌細胞的增殖。隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制率逐漸的增大，具有明顯的時間－劑量效應(yīng)。

細胞增殖周期分為有絲分裂期（M期）和間期（G1期、S期和G2期），有絲分裂結(jié)束后暫時處于靜止狀態(tài)的細胞為G0期。G0／G1、G1／S、G2／M 是細胞周期的檢測點，能修復(fù)受損的細胞，不能修復(fù)的細胞則發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞能跨過檢測點不進行細胞修復(fù)，進入周期下一階段，使凋亡受阻［10－11］。本實驗中舌癌細胞在不同濃度的AD作用下，分別培養(yǎng)24、48h，實驗組細胞隨著AD濃度的升高與作用時間的延長，細胞周期中G0／G1期細胞比例由（39.45±0.65）%上升至（63.70±0.65）%，S期細胞比例由（56.55±0.64）%下降至（32.28±0.54）%，而對照組在不同的時間里細胞周期的分布變化不大（P＞0.05），顯示AD能阻滯細胞于G0／G1期，使細胞不能進入S期和G2／M期進行DNA合成和細胞分裂，從而導(dǎo)致細胞不能進入下一個周期，成為細胞凋亡一個因素。

腫瘤的發(fā)生不僅與細胞增殖有關(guān)，而且與細胞凋亡有關(guān)。細胞凋亡由基因調(diào)控，是一個主動而有序的細胞自我消亡過程［12］。研究發(fā)現(xiàn)Bcl－2家族是在細胞凋亡中有重要作用的一類蛋白質(zhì)，Bcl－2是細胞內(nèi)的抗凋亡基因，能夠阻止細胞凋亡進程；Bax是 Bcl－2家族中的促凋亡基因，發(fā)揮促凋亡作用［13－15］。實驗采用RT－PCR法檢測AD對人舌鱗癌Tca8113細胞Bax、Bcl－2mRNA的表達的影響。分析結(jié)果顯示AD作用24h后，Bax mRNA的表達量顯著升高，并隨著濃度的增加而升高；Bcl－2mRNA的表達量顯著降低，并隨著濃度的增加而降低。從而說明AD誘導(dǎo)細胞凋亡可能與Bcl－2／Bax的表達有密切的關(guān)系。

本實驗結(jié)果提示AD能抑制舌鱗癌細胞的增殖、改變細胞周期的分布，并且AD誘導(dǎo)細胞凋亡還可能與通過調(diào)節(jié)Bcl－2／Bax的表達有關(guān)，為臨床上舌癌的治療提供了一定的理論依據(jù)。

［1］賈瓊.舌癌的綜合治療現(xiàn)狀［J］.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，32（3）：280－282.

［2］Gordaliza M.Natural products as leads to anticancer drugs［J］.Clin Transl Oncol，2007，9（12）：767－776.

［3］Chao WW，Lin BF.Isolation and identification of bioactive compounds in Andrographis paniculata （Chuanxinlian）［J］.Chin Med，2010，5（1）：17.

［4］Rao KY，Vimalamma G，Rao CV，et al.Flavonoids and andrographolides from Andrographis paniculata［J］.Phytochemistry，2004，65（16）：2317－2321.

［5］Xu C，Chou GX，Wang ZT.A new diterpene from the leaves of Andrographis paniculata Nees［J］.Fitoterapia，2010，81（6）：610－613.

［6］楊瓊，李曙光，董建華，等.穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物的抗腫瘤作用及機制［J］.山東醫(yī)藥，2009，49（12）：108－109.

［7］楊靜.穿心蓮內(nèi)酯的研究進展［J］.中草藥，2009，40（7）：1168－1170.

［8］邱蔚六，鄭家偉.應(yīng)重視口腔頜面部惡性腫瘤的綜合序列治療［J］.中國口腔頜面外科雜志，2005，3（3）：179－182.

［9］司徒鎮(zhèn)強，吳軍正.細胞培養(yǎng)［M］.2版.西安：世界圖書出版西安公司，2006：200.

［10］Schmitt E，Paquet C，Beauchemin M，et al.DNA－damage response network at the crossroads of cell－cycle checkpoints，cellular senescence and apoptosis［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2007，8（6）：377－397.

［11］陳文娟，陳燕，吳裕丹，等.姜黃素調(diào)節(jié) HL－60細胞周期蛋白表達的研究［J］.臨床血液學(xué)雜志，2001，14（5）：215－217.

［12］楊志杰，李秀麗.中醫(yī)藥誘導(dǎo)細胞凋亡治療惡性腫瘤的研究進展［J］.中醫(yī)學(xué)報，2013，28（1）：18－20.

［13］Choi BH，Kim W，Wang QC，et al.Kinetin riboside preferentially induces apoptosis by modulating Bcl－2family proteins and caspase－3in cancer cells［J］.Cancer Lett，2008，261（1）：37－45.

［14］楊連君.Bcl－2，Bax與腫瘤細胞凋亡［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2003，10（3）：232－234.

［15］Sambaziotis D，Kapranos N，Kontogeorgos G.Correlation of bcl－2and Bax with apoptosis in human pituitary adenomas［J］.Pituitary，2003，6（3）：127－133.