華支睪吸蟲膜抗原/排泄分泌抗原酸性磷酸酶的克隆、表達(dá)、生物學(xué)特征分析及組織定位*

鄭明慧， 胡坤華， 張 彤， 劉 煒， 余新炳

(1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510120；中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院 2熱帶病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，病原生物學(xué)教研室， 3藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080； 4中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院廣東省肝病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510630)

華支睪吸蟲(Clonorchissinensis，C.sinensis,Cs)也稱肝吸蟲，廣泛分布于亞洲地區(qū)，包括中國(guó)、韓國(guó)、朝鮮、日本及東南亞等，可引起宿主的膽石癥、膽管炎、肝纖維化、肝硬化及肝膽管癌等，是一種重要的食源性寄生蟲病[1]。

寄生蟲的排泄分泌產(chǎn)物(excretory-secretory pro-ducts，ESP)參與寄生蟲與宿主的相互作用[2]， 具有重大的臨床診斷意義和臨床病理意義。 ESP 在華支睪吸蟲幼蟲移行至肝膽管致肝膽管癌方面起重要作用[3]。寄生蟲的排泄分泌抗原(excretory-secretory antigens, ESA)是蟲體與宿主密切接觸的媒介之一，其釋放到蟲體外寄生部位與宿主細(xì)胞如肝星狀細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞甚至肝細(xì)胞直接接觸而引起一系列的生物效應(yīng)，蟲體及其分泌排泄成分可造成膽石癥、肝膽管炎、肝纖維化、肝硬化及肝癌等[1]。

寄生蟲的膜抗原:吸蟲具有相同的皮層結(jié)構(gòu), 最外一層是沒有細(xì)胞間隔的合胞體, 皮層表膜是合胞體細(xì)胞膜, 是蟲體與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的一個(gè)重要界面, 許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和胞內(nèi)代謝終產(chǎn)物和其它有毒物質(zhì)的排出需要通過表膜上的協(xié)助因子來完成[4]。

酸性磷酸酶(acid phosphatase, AP)分布很廣, 從低等生物大腸桿菌、酵母到高等動(dòng)植物組織、體液以及人類肝臟、前列腺都存在[5]。AP參與磷酸酯代謝、代謝調(diào)節(jié)、能量轉(zhuǎn)換以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[6]。

那么， 華支睪吸蟲酸性磷酸酶具有哪些生物學(xué)特征，其在蟲體代謝及致病中起什么作用，其是否為華支睪吸蟲膜抗原/排泄分泌抗原，目前尚缺乏充分研究。

本研究目的是對(duì)華支睪吸蟲膜抗原/排泄分泌抗原酸性磷酸酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá)、生物學(xué)特征分析及組織定位。

材 料 和 方 法

1 CsAP生物信息學(xué)分析

從華支睪吸蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中尋找C.sinensisESA酸性磷酸酶(CsAP)全長(zhǎng)序列。以生物信息學(xué)進(jìn)行全長(zhǎng)分析(Vector NTI Suite 8.0)、理化性質(zhì)分析、信號(hào)肽分析及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2 CsAP克隆、表達(dá)和純化

CsAP序列的編碼區(qū)(不包含信號(hào)肽)以上游引物(5’-AAA GAT ATC GGG GCG ACC AAC GTT CT-3’)及下游引物(5’-GGG AAG CTT TTA AAA TGT GGG GTT CAG TTG-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 1 min, 58 ℃ 1 min, 72 ℃ 80 s, 35 個(gè)循環(huán) (TaKaRa)，以EcoR Ⅴ 及HindⅢ雙酶切并純化后，重組入帶有6×His-tag的 pET-30a 表達(dá)載體 (Novagen)，以1 mmol/L IPTG于37 ℃、4 h誘導(dǎo)表達(dá) (包涵體形式表達(dá))。8 000×g、4 ℃離心10 min,收集菌體，以SDS-PAGE分離并收集重組融合蛋白，以銅染試劑盒(Bio-Rad)染色，切割目的蛋白條帶并進(jìn)行電洗脫[7-8]，親和層析純化后 (Novagen)，PBS (pH 7.4)透析濃縮后Bradford定量分析[9]，行SDS-PAGE及Western blotting分析其完整性。

3 C. sinensis 排泄分泌抗原、粗抗原及膜蛋白的制備及GST標(biāo)簽蛋白的純化

將活動(dòng)良好的、完整的華支睪吸蟲成蟲以DMEM (Gibco)于37 ℃、5% CO2無菌培養(yǎng)3 h，收集培養(yǎng)液上清為分泌排泄抗原，透析濃縮后-80 ℃保存?zhèn)溆肹10]。C.sinensis成蟲以PBS勻漿，10 000×g、4 ℃離心15 min, 收集上清為粗抗原，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ阅さ鞍滋崛≡噭┖?Calbiochem)提取C.sinensis成蟲膜蛋白-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

pGEX-4T-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α并進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增其拷貝數(shù), 提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)以IPTG 誘導(dǎo)標(biāo)簽蛋白表達(dá)，以GST-bind純化試劑盒 (Novagen)進(jìn)行標(biāo)簽蛋白純化, PBS中進(jìn)行透析, 視情況進(jìn)行濃縮，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

4 抗血清制備

CsAP (每只200 μg)與等體積福氏完全佐劑混勻，給SD大鼠皮下多點(diǎn)注射免疫，間隔2周進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫(每只100 μg,加等體積不完全福氏佐劑)；再間隔2周用上述方法進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫。末次免疫后2周大鼠眼球采血，分離血清，ELISA法測(cè)抗體效價(jià)后保存于-80 ℃?zhèn)溆??？笴sESA血清制備方法同上。

5 Western blotting分析

SDS-PAGE (15%)分析CsAP及CsESA, 電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Qbiogene)，以CsAP及CsESA抗血清、感染C.sinensis大鼠血清及正常大鼠血清分別進(jìn)行免疫印跡識(shí)別；同上述方法，以CsAP抗血清、感染C.sinensis大鼠血清及正常大鼠血清分別進(jìn)行免疫印跡識(shí)別C.sinensis膜蛋白；6×His單克隆抗體 (Boster Co.) 分別進(jìn)行免疫印跡識(shí)別CsAP及含有pET30a 的BL21；然后，以HRP標(biāo)記的兔抗大鼠或兔抗小鼠IgG (Boster Co.)作為Ⅱ抗，以二氨基聯(lián)苯胺為底物顯色。

6 CsAP于 C. sinensis 各發(fā)育階段免疫組化定位

將從感染華支睪吸蟲動(dòng)物體內(nèi)分離的成蟲及囊蚴固定后制作石蠟切片，尾蚴、雷蚴活體以丙酮固定。脫蠟后的石蠟切片和活體玻片以自發(fā)熒光淬滅劑(Applygen)處理，PBS-T清洗后，以10% BSA 的PBS 4 ℃封閉過夜。PBS-T清洗后，以CsAP的抗血清孵育室溫1h, 同樣方法以大鼠免疫前血清為對(duì)照。PBS-T清洗后，以FITC標(biāo)記的Ⅱ抗goat anti-rat IgG (1∶400) (Invitrogen)室溫孵育30 min。PBS-T清洗后，熒光顯微鏡拍照(Olympus IX61)。

7 健康及C. sinensis感染、日本血吸蟲(Schistosoma japonicum， S.japonicum, Sj)感染人血清

73份感染C.sinensis、50份感染S.japonicum病人血清及35份健康人血清檢測(cè)診斷抗原特異性；以CsAP分別檢測(cè)不同蟲荷的C.sinensis病人血清(EPG<1 000 14份、EPG 1 001～5 000 50 份、EPG 5 001～10 000 18 份病人血清)和35份健康人血清檢測(cè)診斷抗原敏感性。

8 明膠酶譜法分析CsAP降解膠原能力

(1)調(diào)整CsAP、CsMAP-2(作為重組蛋白對(duì)照)、牛血清白蛋白和GST (作為對(duì)照)蛋白濃度調(diào)整使所上蛋白總量一致。與4×上樣緩沖液(4% SDS，0.25 mmol/L Tris-HCl，40% 甘油，0.1% 溴酚藍(lán))按照1∶3混合。(2)配制分離膠和濃縮膠，4 ℃進(jìn)行SDS-PAGE 100 v 恒壓跑至分離膠和濃縮膠交界處改為90 mA恒流，直至溴酚藍(lán)跑出膠外。(3)凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100，50 mmol/L Tris -HCl，5 mmol/L CaCl2，1 μmol/L ZnCl2，pH 7.6) 中振蕩洗脫2次,每次45 min, 然后用漂洗液(除不含Triton X- 100 外其余同洗脫液) 漂洗2次,每次20 min, 接著,將凝膠置于孵育液(50 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/L CaCl2, 1 μmol/L ZnCl2, 0.02% Brij-35, pH 7.6) 中37 ℃ 孵育42 h。(4)染色液(0.05% 考馬斯亮藍(lán)、30%甲醇、10%乙酸) 染色3 h,及脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%和10%,乙酸濃度分別為10%、10%和5%) 分別脫色后，顯示位于藍(lán)色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照分析。

9 ELISA

包被緩沖液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液， pH 9.6)將CsAP稀釋至10 mg/L，0.1 mL/well于96孔酶標(biāo)板，4 ℃過夜。次日用PBS-Tween 20(PBS溶液中含0.05% Tween 20，PBS-T)洗滌3次，每次5 min。5%脫脂奶粉37 ℃、2 h封閉，PBS-T洗滌后加1∶200稀釋的待檢樣品0.1 mL于包被反應(yīng)孔中，37 ℃孵育2 h。另設(shè)空白、陰性對(duì)照。PBS-T洗滌3次后，每孔加入1∶20 000 HRP標(biāo)記的兔抗大鼠IgG，37 ℃孵育1 h。洗滌后，每孔加入TMB溶液(BD Biosciences)，顯色5～10 min。每孔0.05 mL中加入2 mol/L硫酸。全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)儀(Labsystems Dragon, Multiskan MK3)于450 nm測(cè)A值。Cut-off 值=正常人血清A值均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)方法，以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CsAP生物信息學(xué)分析

CsAP全長(zhǎng)1 816 bp,編碼區(qū)為68～1 477，在5’端和3’端都有非翻譯區(qū)，該基因?yàn)槿L(zhǎng)基因。CsAP的ORF共有1 410 bp，編碼470個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為55.3 kD, 第1～27位氨基酸為分泌信號(hào)肽序列。其跨膜區(qū)包括第6～29位氨基酸由內(nèi)向外的跨膜區(qū)和第426～450位氨基酸由外向內(nèi)的跨膜區(qū)，見圖1。

2 CsAP在大腸桿菌BL21 E. coli表達(dá)與純化

成功構(gòu)建于pET-30a原核質(zhì)粒，于BL21E.coli表達(dá),CsAP菌體沉淀中有目的條帶表達(dá)，包涵體經(jīng)洗滌后，以SDS-PAGE分離，以銅染試劑盒染色，切割目的蛋白條帶并進(jìn)行電洗脫，親和層析純化后得到分子量為55.3 kD的目的條帶，見圖2A。

3 CsAP重組蛋白Western blotting分析

CsAP蛋白分子量均與理論分子量相符，可被His單抗識(shí)別及其抗血清識(shí)別其單體及二聚體，并可被抗CsESA及抗CsAP的多克隆抗體分別識(shí)別其單體及二聚體;CsESA可被抗CsESA的多克隆抗體識(shí)別, 并可被抗CsAP的多克隆抗體識(shí)別其單體及二聚體[11]，見圖2B。

C.sinensis成蟲膜蛋白可被C.sinensis感染大鼠血清識(shí)別，識(shí)別抗CsAP的多克隆抗體識(shí)別; 與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，見圖2C。

Figure 1. Bioinformatics analysis of CsAP. Nucleotide sequence and the deduced amino acid squence of the CsAP cDNA. The location of the N-terminal signal sequence was underlined. And the locations of transmembrane domains were framed.

4 免疫熒光分析CsAP重組蛋白在C. sinensis的組織定位和發(fā)育時(shí)期定位

免疫組織化學(xué)定位顯示CsAP熒光顯示于成蟲的表皮層和腸支，在囊蚴也有顯示，在雷蚴和尾蚴未顯示熒光，CsMAP-2(作為重組蛋白對(duì)照)可定位于雷蚴，在尾蚴未顯示定位，見圖3。CsAP組織定位于成蟲的表皮層，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)膜蛋白結(jié)果一致。

Figure 2. Cloning, expression and identification of recombinant CsAP. A: expression and purification of CsAP; B: identification and antigenicity of recombinant CsAP; C: transmembrane domains prediction by TMpred (left) and identification by Western blotting (right) for CsAP.

Figure 3. Immunohistochemistry staining of CsAP localization.A: immunofluorescence for CsAP localization in C. sinensis adult (×100) and metacercaria (×200). i: intestine; T: tegument and tegumentary cells. B: immunofluorescence for CsAP localization in C. sinensis cercaria and redia (×100).

5 CsAP對(duì)膠原的降解作用

CsAP 在其分子量相應(yīng)位置顯示清晰的膠原降解負(fù)染條帶，而對(duì)照重組蛋白(包涵體復(fù)性)CsMAP-2未顯示明顯的膠原降解負(fù)染條帶，表明CsAP包涵體復(fù)性較為成功，見圖4。

Figure 4. Gelatin zymography assay of CsAP.A: SDS-PAGE identification of CsMAP-2(recombinant protein as control), CsAP and the controls (BSA and GST); B: collagen-containing native PAGE identification of the collagen degradation effect of CsMAP-2(recombinant protein control), CsAP and the controls (BSA and GST).

6 CsAP重組蛋白ELISA分析

ELISA分析表明CsAP識(shí)別華支睪吸蟲病人和日本血吸蟲病人存在交叉免疫識(shí)別(P>0.05)；CsAP及粗抗原識(shí)別輕、中、重度感染程度的華支睪吸蟲病人的差別不明顯(P>0.05)。CsAP總IgG抗體滴度于3周達(dá)高峰，抗體效價(jià)均大于1∶25 600，見圖5。

Figure 5. ELISA analysis of CsAP. A: immunoreactivity of the recombinant CsAP and the crude antigens against serum samples from patients infected with C.sinensis (Cs) and S.japonicum (Sj), and healthy persons (control); B: immunoreactivity of the recombinant CsAP against serum samples from different fluke burden patients infected with C.sinensis; C: antibody development curves of IgG antibody of CsAP.

討 論

在本研究中，重組、表達(dá)、純化了一個(gè)屬于組氨酸酸性磷酸酶家族的CsAP，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其具有跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽，故推測(cè)其為膜抗原及分泌排泄抗原。

生物信息學(xué)分析跨膜蛋白預(yù)測(cè)、膜蛋白免疫印跡分析表明，CsAP是蟲體膜抗原及ESA的成分之一。其組織定位于蟲體表膜及腸支，表膜是蟲體與外界溝通的重要媒介，其交叉免疫反應(yīng)廣泛存在于蠕蟲間，故不是華支睪吸蟲病的特異性診斷抗原；而腸支是蟲體分泌排泄的重要途徑，可能參與華支睪吸蟲致肝纖維化的過程[1]。同時(shí)，免疫組化分析表明，CsAP在囊蚴也有顯示，在雷蚴和尾蚴未顯示熒光，推測(cè)其可能選擇性表達(dá)于成蟲及囊蚴階段，有利于其對(duì)宿主的免疫逃避[12]。

AP存在于細(xì)胞溶酶體中，其活性在正常情況下相當(dāng)穩(wěn)定,當(dāng)受到不良因素影響時(shí),其活性增強(qiáng),一方面吞噬消化變性壞死結(jié)構(gòu), 另一方面水解正常細(xì)胞結(jié)構(gòu),加速細(xì)胞變性壞死過程[13],肝細(xì)胞受損時(shí),此酶活性增高，可降解成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的膠原[14-15]。本研究中的膠原降解實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了CsAP的降解能力。

綜上所述，本研究克隆、表達(dá)了華支睪吸蟲的酸性磷酸酶基因，并對(duì)其分子生物學(xué)特征、組織定位進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步探討華支睪吸蟲膜抗原/分泌排泄抗原酸性磷酸酶的功能及診斷價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。我們將通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其與華支睪吸蟲病肝纖維化之間的關(guān)系及其作用機(jī)制。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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