siArid2重組腺病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響*

段玉潔， 聶麗珠， 田 玲， 李 治， 陳 震， 唐 霓

(重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

Arid2 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因，定位于第12對(duì)染色體的長臂上，包含21個(gè)外顯子[1],其編碼的蛋白是PBAF(polybromo-associated BRG1-associated factor)復(fù)合物的一種特有亞基，而PBAF是一種依賴ATP酶的染色質(zhì)重塑復(fù)合物，可以通過水解ATP獲得的能量, 改變組蛋白與核小體之間的相互作用,調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化過程。

Arid2蛋白結(jié)構(gòu)分為N端富含保守AT的結(jié)構(gòu)域，RFX型翼狀螺旋DNA結(jié)合域，富含脯氨酸、甘氨酸的結(jié)構(gòu)域以及C端2個(gè)保守鋅指結(jié)構(gòu)域[2]。人類Arid家族包含15個(gè)成員，可分為7個(gè)亞家族：Arid1～5、JArid1和JArid2[3]。研究表明Arid家族的突變失活與人類多種腫瘤如肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、黑色素瘤、非小細(xì)胞型肺癌以及頭頸部癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在丙型肝炎病毒(HCV)感染相關(guān)的HCC中，約18.2%的HCC組織標(biāo)本存在Arid2 的失活突變。

研究表明Arid2等組成的蛋白復(fù)合物SWI/SNF具有腫瘤抑制作用，被認(rèn)為是一類腫瘤抑制因子或抑癌基因，可能通過以下途徑發(fā)揮作用：(1)調(diào)控IFN信號(hào)通路，調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答；(2)調(diào)控pRb信號(hào)通路下游靶基因，抑制細(xì)胞增殖；(3)調(diào)控細(xì)胞骨架蛋白、跨膜糖蛋白CD44等參與調(diào)控細(xì)胞的遷移與侵襲力[5]。Arid2的生物學(xué)功能尚不明確，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展特別是肝細(xì)胞肝癌中的作用目前知之甚少。

小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)是含有21～23個(gè)堿基的單鏈或雙鏈RNA，能夠高效、特異地與目標(biāo)mRNA位點(diǎn)結(jié)合，促使同源mRNA降解，從而特異地下調(diào)甚至沉默目標(biāo)基因的表達(dá)[6]。本研究運(yùn)用小干擾RNA技術(shù)構(gòu)建沉默Arid2 的重組質(zhì)粒，并將質(zhì)粒包裝成腺病毒[7]，通過體外實(shí)驗(yàn)初步分析該基因的功能，為今后的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1質(zhì)粒、細(xì)胞 pSES-1穿梭質(zhì)粒載體、BJ5183菌株及其衍生物AdEasy-1細(xì)胞、腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1和含有無關(guān)序列(scrambled)的siRNA腺病毒Adsicontrol均由美國芝加哥大學(xué)分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室HE Tong-chuan教授惠贈(zèng)；人腎上皮細(xì)胞HEK293和人肝癌細(xì)胞SMMC-7721為本實(shí)驗(yàn)室保存；HEK293細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素+鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基，SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素+鏈霉素)的1640培養(yǎng)基中。

1.2主要試劑 限制性內(nèi)切酶HindIII、KpnI和SfiI購于New England Biolabs；T4 DNA連接酶和質(zhì)粒小量提取試劑盒購于Promega；DNA marker購于TaKaRa；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen；蛋白定量試劑盒購于碧云天公司；Arid2單克隆抗體(兔)購于Santa Cruz；鼠抗IgG-HRP、山羊抗兔多克?、蚩笽gG購于Abcam；ECL發(fā)光試劑購于Millipore；胎牛血清購自Gibco；雙抗(青霉素+鏈霉素)、DMEM和1640培養(yǎng)基購自Hyclone。

2 方法

2.1siArid2腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)PubMed公布的Arid2基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA，見表1，將3對(duì)正、反義鏈引物按照1:3稀釋，分別等比例混勻后，沸水煮沸10 min，自然冷卻至室溫以便形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA。用限制性內(nèi)切酶SfiⅠ酶切載體pSES-1使其線性化，用T4 DNA連接酶將上述引物與線性化的載體連接，電轉(zhuǎn)入感受態(tài)菌DH5α中，鋪板后置于37 ℃孵箱中過夜。挑取陽性單克隆菌落，提取質(zhì)粒后送華大基因進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果成功獲得重組質(zhì)粒psiArid2-1、psiArid2-2和psiArid2-3。

表1 引物序列

2.2siArid2腺病毒的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒psiArid2-1、psiArid2-2和psiArid2-3分別用限制性內(nèi)切酶PmeI酶切，使其線性化，再電轉(zhuǎn)入腺病毒同源穿梭質(zhì)粒BJ-AdEasy中，電轉(zhuǎn)產(chǎn)物涂于含100 mg/L卡那霉素的LB平板上，于37 ℃孵箱中孵育過夜，在LB平板上挑取約20個(gè)偏小的單克隆菌，接種于 4 mL 含100 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。用堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒在0.8%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)質(zhì)粒大小篩選出陽性克隆質(zhì)粒pAdsiArid2-1～3。將上述質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感受態(tài)菌E.coliDH5ɑ中擴(kuò)大培養(yǎng)，將提取的重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)一步用限制性內(nèi)切酶PacⅠ進(jìn)行酶切鑒定。

2.3重組腺病毒的包裝擴(kuò)增 用小量抽提試劑盒提取pAdsiArid2-1～3質(zhì)粒，PacⅠ酶切后無水乙醇沉淀法純化。用3 mL無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌HEK293細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，再加入2.5 mL無血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2濕度孵箱中。將13 μL脂質(zhì)體，3 μg AdEasy-siArid2質(zhì)粒和250 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基混勻，室溫靜置15～17min后加入到培養(yǎng)基中，輕輕混勻，于37 ℃、5%CO2濕度孵箱中孵育4 h。吸去轉(zhuǎn)染液，加入7 mL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光情況。轉(zhuǎn)染成功后約10～15 d，收取含病毒的上清，用約1/2的量繼續(xù)感染293細(xì)胞，進(jìn)行新的一輪病毒擴(kuò)增，重復(fù)擴(kuò)增4～5次后獲得滴度較高的重組腺病毒，保存至-80℃。

2.4siArid2腺病毒的鑒定和效率測定 將SMMC-7721細(xì)胞以每孔40%的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將3種重組腺病毒以10 μL為初始量按1/2等比減量后依次加入6個(gè)孔中，即相應(yīng)的6個(gè)孔中所加入的腺病毒量為10μL、5μL、2.5μL、1.25μL、0.75μL和0.37μL)。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)以及熒光強(qiáng)弱，選擇細(xì)胞狀態(tài)良好、熒光強(qiáng)度適中的孔所對(duì)應(yīng)的病毒量作為重組腺病毒的最適滴度。將4×105SMMC-7721細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后分別感染最適滴度的重組腺病毒AdsiArid2-1、AdsiArid2-2、AdsiArid2-3以及對(duì)照腺病毒Adsicontrol。病毒感染后48 h分別提取總蛋白，并用BCA法測定其蛋白濃度。取50 μg蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。按照抗體說明書將膜孵以最適稀釋度的Arid2抗體，4 ℃ 孵育過夜。TBST洗膜40 min后，加入1∶5 000稀釋的羊抗兔Ⅱ抗室溫孵育1 h。TBST洗膜后，加入ECL發(fā)光試劑，用ImageJ 2X灰度比對(duì)軟件分析各組Arid2的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.5MTS法檢測SMMC-7721細(xì)胞的生長 將4×105SMMC-7721細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后分別感染最適滴度的重組腺病毒Adsicontrol和AdsiArid2，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。病毒感染后12 h，將上述細(xì)胞以4×103/well密度重鋪于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別于鋪板后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h向每孔加入20 μL MTS反應(yīng)液，輕輕混勻，于37 ℃、5%CO2孵箱中避光靜置2 h，檢測各時(shí)點(diǎn)的吸光度(A490)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 將2×104SMMC-7721細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后分別感染最適滴度的重組腺病毒Adsicontrol和AdsiArid2，同時(shí)設(shè)置空白處理組作為對(duì)照。病毒感染后12 h，更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，72 h后棄去培養(yǎng)基，并用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入75%的乙醇輕輕重懸收集細(xì)胞。-20 ℃固定細(xì)胞24 h，取等體積的碘化丙啶染液與細(xì)胞懸液混合后，4 ℃靜置30 min,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每種實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行至少3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 siArid2腺病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將構(gòu)建好的3個(gè)重組質(zhì)粒psiArid2-1～3電轉(zhuǎn)入BJ-AdEasy感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行搖菌，提取質(zhì)粒DNA。由于腺病毒的同源重組可以發(fā)生在穿梭質(zhì)粒AdEasy-1的ori區(qū)域之間或者其左臂上，這2種重組方式導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶PacI酶切后會(huì)產(chǎn)生3.0 kb或4.5 kb的片段。用PacI 酶切后2號(hào)、5號(hào)和8號(hào)重組菌落出現(xiàn)約4.5 kb DNA條帶，表明腺病毒重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖1。

Figure 1. Identification of recombinant adenoviruses by Pac I digestion.Three of the 9 potential clones released a 4.5-kb fragment after Pac I digestion(Lane 2,Lane 5 and Lane 8).M: DNA marker 2000.

2 siArid2重組腺病毒的構(gòu)建

將已構(gòu)建好的pAdsiArid2-1～3重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，48 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的感染情況。在轉(zhuǎn)染后7 d，上述細(xì)胞中均可見明顯的紅色熒光，且呈現(xiàn)腺病毒包裝過程中出現(xiàn)的典型“彗星狀”熒光，隨著轉(zhuǎn)染天數(shù)的增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，約轉(zhuǎn)染后10 d，部分細(xì)胞由貼壁轉(zhuǎn)為漂浮，大約14 d后，收集含病毒顆粒的上清,見圖2。

3 鑒定重組干擾腺病毒的抑制效率

將SMCC-7721細(xì)胞分別感染重組腺病毒AdsiArid2-1～3，并設(shè)置空白對(duì)照組和Adsicontrol組，細(xì)胞感染后48 h收集總蛋白，行Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測Arid2蛋白的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。結(jié)果顯示：以GAPDH為內(nèi)參照，AdsiArid2-1組的灰度比值為0.749±0.020，AdsiArid2-2的灰度比值為0.473±0.028，AdsiArid2-3的灰度比值為0.415±0.017，空細(xì)胞(mock)和Adsicontrol組的灰度比對(duì)值分別為0.772±0.031、0.783±0.018。統(tǒng)計(jì)分析顯示，mock組與Adsicontrol組的Arid2表達(dá)量無明顯差異，與Adsicontrol組相比，AdsiArid2-2和AdsiArid2-3對(duì)Arid2的表達(dá)均有明顯抑制作用(P<0.05)，其中以AdsiArid2-3的抑制作用更強(qiáng)，而AdsiArid2-1的抑制作用不明顯(P>0.05)。以上結(jié)果表明AdsiArid2-3沉默Arid2表達(dá)的效果最好。因此，在后續(xù)MTS和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中選擇AdsiArid2-3作為實(shí)驗(yàn)組,見圖3。

Figure 2. Package of recombinant adenoviruses in HEK293 cells.Transfected HEK293 cells were observed under fluorescence field at 10 d(×400).

Figure 3. Arid2 protein expression in SMCC-7721 cells transfe-cted with Adsicontrol,AdsiArid2-1, AdsiArid2-2 and AdsiArid2-3.Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs Adsicontrol group; #P<0.05 vs mock group.

4 siArid2對(duì)于SMCC-7721細(xì)胞增殖活性的影響

MTS結(jié)果顯示，AdsiArid2組在72 h和96 h的吸光度值分別為1.13±0.05和1.23±0.04，mock組72 h和96 h的吸光度值分別為0.92±0.03和1.07±0.08，Adsicontrol組72 h和96 h的吸光度值分別為0.91±0.01、1.03±0.02。通過以上數(shù)值可以看出AdsiArid2組在72 h和96 h的吸光度值與對(duì)照組相比明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明沉默Arid2基因的表達(dá)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，見圖4。

Figure 4. The effects of recombinant adenovirus on the proliferation of SMMC-7721 cells.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs Adsicontrol group;#P<0.05 vs mock group.

5 siArid2對(duì)于細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)的分析結(jié)果顯示，感染腺病毒72 h后，AdsiArid2組SMMC-7721細(xì)胞處于G1期和S期的百分比分別為55.67%±0.38%和31.93%±0.38%；mock組處于G1期和S期細(xì)胞百分比分別為63.57%±2.90%和24.75%±2.53%；而Adsicontrol組處于G1期和S期細(xì)胞百分比分別為66.02%-2.13%和24.37%±1.91%。從以上數(shù)值可以看出，感染AdsiArid2腺病毒組，SMMC-7721細(xì)胞G1期縮短,S期延長，細(xì)胞處于活躍增殖狀態(tài)，細(xì)胞周期進(jìn)程加快，見圖5。

Figure 5. The percentage of cell phase.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs Adsicontrol group.

討 論

HCC是全球最常見的十大惡性腫瘤之一，在我國，肝癌死亡率已居癌癥死亡率的第二位[1]。癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素作用的過程，包括細(xì)胞分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活、原癌基因與抑癌基因的失衡以及腫瘤干細(xì)胞的分化等。其中抑癌基因的失活一直在癌癥研究中受到重視[8]。

Arid2，存在于PBAF復(fù)合物中，而PBAF復(fù)合物是SWI/SNF復(fù)合物的一種類型。SWI/SNF復(fù)合物是一種ATP依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物，它可以利用催化ATP水解釋放的能量改變組蛋白與DNA之間的相互作用來調(diào)整染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這對(duì)于轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的順利進(jìn)行具有重要意義[9]。功能學(xué)研究顯示，Arid2是PBAF復(fù)合物中唯一的短半衰期轉(zhuǎn)錄因子，通過小干擾RNA抑制Arid2的表達(dá)可以降低PBAF復(fù)合物中其它蛋白的表達(dá)[10]。Arid2被發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌、黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中均存在不同程度的突變[11-13]，其中在丙型肝炎病毒相關(guān)的HCC中存在3種形式的突變：移碼突變、無義突變和剪接位點(diǎn)突變[1]。Arid2的突變失活能否影響肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程，可能發(fā)揮作用的機(jī)制，目前的認(rèn)識(shí)與研究都知之甚少。因此本研究旨在通過小干擾RNA技術(shù)構(gòu)建siArid2的重組腺病毒，初步觀察其對(duì)于細(xì)胞生長及細(xì)胞周期的影響，為之后更加深入地研究Arid2的抑癌機(jī)制提供重要的前期工作基礎(chǔ)。

通過分析Arid2編碼區(qū)序列，我們設(shè)計(jì)了3段編碼區(qū)的siRNA片段，分別構(gòu)建3個(gè)siArid2的重組質(zhì)粒，并進(jìn)一步構(gòu)建了其重組腺病毒，且通過Western blotting我們篩選出了抑制效果最明顯的重組腺病毒AdsiArid2-3。將該腺病毒感染體外培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞后，在72 h和96 h時(shí)細(xì)胞的吸光光度值(A值)較對(duì)照組顯著增加，說明沉默Arid2的表達(dá)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長。Arid2參與調(diào)控細(xì)胞增殖的具體機(jī)制尚不明確。有研究表明，Arid家族其它成員如Arid1A、Arid1B可以通過與E2F-Rb信號(hào)通路相關(guān)分子相互作用調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與增殖[14]。細(xì)胞周期分為G0/G1、G2、S和M四個(gè)周期，各期都存在關(guān)鍵的檢測點(diǎn)，例如G1/S和G2/M檢測點(diǎn)。各檢測點(diǎn)功能正常可以保證細(xì)胞周期順利進(jìn)行。其中，G1/S檢測點(diǎn)在細(xì)胞周期進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，決定細(xì)胞周期能否啟動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞增殖[15-17]。通過流式細(xì)胞學(xué)分析，SMCC-7721細(xì)胞在感染重組腺病毒AdsiArid2后，G0/G1期細(xì)胞百分比減少，S期細(xì)胞百分比增加，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示Arid2有可能通過調(diào)控肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了沉默Arid2表達(dá)的重組腺病毒，初步觀察了Arid2對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，對(duì)于Arid2是如何調(diào)控肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能及其相關(guān)的分子機(jī)制，還需進(jìn)一步深入研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Zhao H, Wang J, Han Y, et al.ARID2: a new tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2011, 2(11):886-891.

[2] Shain AH, Pollack JR. The spectrum of SWI/SNF mutations, ubiquitous in human cancers[J].PLoS One, 2013, 8(1):e55119.

[3] Cajuso T, H?nninen UA, Kondelin J, et al. Exome sequencing reveals frequent inactivating mutations inARID1A,ARID1B,ARID2 andARID4Ain microsatellite unstable colorectal cancer[J]. Int J Cancer, 2014, 135(3):611-623.

[4] Manceau G, Letouzé E, Guichard C,et al. Recurrent inactivating mutations ofARID2 in non-small cell lung carcinoma[J]. Int J Cancer, 2013, 132(9):2217-2222.

[5] Oike T, Ogiwara H, Nakano T, et al. Inactivating mutations in SWI/SNF chromatin remodeling genes in human cancer[J]. Jpn J Clin Oncol, 2013, 43(9):849-855.

[6] Wilkins C, Dishongh R, Moore SC, et al. RNA interference is an antiviral defence mechanism inCaenorhabditiselegans[J]. Nature, 2005, 436(7053):1044-1047.

[7] Luo J, Deng ZL, Luo X, et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system[J]. Nat Protoc, 2007, 2(5):1236-1247.

[8] Hodis E, Watson IR, Kryukov GV,et al.A landscape of driver mutations in melanoma[J]. Cell,2012, 150(2):251-263.

[9] Gangaraju VK, Bartholomew B. Mechanisms of ATP dependent chromatin remodeling[J]. Mutat Res, 2007, 618(1-2):3-17.

[10]Wu JI. Diverse functions of ATP-dependent chromatin remodeling complexes in development and cancer[J]. ActaBiochim Biophys Sin (Shanghai), 2012, 44(1):54-69.

[11]Shain AH, Giacomini CP, Matsukuma K, et al. Convergent structural alterations define SWItch/Sucrose NonFermentable (SWI/SNF) chromatin remodeler as a central tumor suppressive complex in pancreatic cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(5):E252-E259.

[12]Ho L, Ronan JL, Wu J, et al. An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(13):5181-5186.

[13]Biankin AV, Waddell N, Kassahn KS,et al.Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes[J]. Nature, 2012, 491(7424):399-405.

[14]Blais A, Dynlacht BD. E2F-associated chromatin modifiers and cell cycle control[J]. Curr Opin Cell Biol, 2007, 19(6):658-662.

[15]秦瑞英，夏永華，任艷芳. AEG-1表達(dá)下調(diào)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞周期和侵襲能力的影響及其機(jī)制[J]. 中國病理生理雜志,2013, 29(6):1020-1024.

[16]楊 英,付士波,鞠桂芝. siRNA沉默P21表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期解偶聯(lián)和細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2007, 23(2):209-212.

[17]廖 剛,王子衛(wèi),張 能，等. 人表皮生長因子受體顯性負(fù)性突變體誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(3):430-435.