• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    EGCG通過mTOR通路拮抗低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡與自噬*

    2014-08-13 12:39:40曹錦霞王紅衛(wèi)
    中國病理生理雜志 2014年11期
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)細(xì)胞低氧孵育

    曹錦霞, 王 浩, 王紅衛(wèi), 游 詠

    (南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院,湖南 衡陽 421000)

    表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是茶多酚的活性成分,越來越多的研究表明,EGCG在神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)[1]、對抗氧化應(yīng)激[2]、抗炎[3]及抑制脂質(zhì)聚集[4]等多種生物學(xué)功能方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。

    雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶,不僅具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的功能[5],還在細(xì)胞增殖分化、凋亡等諸多方面發(fā)揮作用[6]。研究已經(jīng)報(bào)道缺氧可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡并引起細(xì)胞自噬[7]。由于mTOR通路發(fā)揮多種蛋白表達(dá)與功能的調(diào)節(jié)作用,我們設(shè)想mTOR通路可能介導(dǎo)了EGCG對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

    目前,EGCG對低氧誘導(dǎo)的凋亡與自噬方面的研究并未深入展開。EGCG是否能拮抗低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷,以及mTOR通路是否參與其中尚未明了。本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mTOR的確介導(dǎo)了CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致細(xì)胞凋亡與自噬。這些方面的研究結(jié)果對于相關(guān)藥物走向臨床應(yīng)用有重要的提示作用。

    材 料 和 方 法

    1 細(xì)胞及培養(yǎng)

    PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞中心,使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的細(xì)胞種植于6、 24、 96孔板中進(jìn)行觀察及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

    2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測細(xì)胞活力

    將對數(shù)期的細(xì)胞均勻種植于96孔板,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)及以上復(fù)孔,每孔加樣100 μL,待細(xì)胞貼壁并密度達(dá)到75%時(shí),藥物處理24 h。然后每孔加入5 μL的CCK-8試劑。2~4 h后使用450 nm酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(A)。

    3 細(xì)胞形態(tài)觀察

    將對數(shù)期的細(xì)胞均勻種植于24孔板,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)及以上復(fù)孔,每孔加樣500 μL,待細(xì)胞貼壁并密度達(dá)到75%時(shí),藥物處理24 h。然后使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

    4 細(xì)胞免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)LC-3的表達(dá)

    細(xì)胞處理24 h后,PBS清洗細(xì)胞并用純冰甲醇固定;室溫下Ⅰ抗室溫孵育1 h;然后PBST快速洗2遍,Ⅱ抗避光室溫孵育1 h; PBST快速洗2遍后加入DAPI,室溫孵育2 min后使用熒光顯微鏡觀察,每孔取至少3個(gè)視野觀察并拍照。

    5 Western blotting檢測beclin-1和mTOR的表達(dá)

    細(xì)胞處理24 h后,提取細(xì)胞蛋白并定量。使用濃度為10%、8%的凝膠進(jìn)行蛋白電泳,電泳完畢使用PVDF膜制作“三明治”采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜;轉(zhuǎn)膜完成后常溫5%脫脂奶粉TBST封閉液封閉1 h;用TBST稀釋Ⅰ抗后搖床上孵育過夜;TBST洗膜3次,Ⅱ抗常溫下?lián)u床孵育2 h;TBST洗膜3次后成像儀顯影。

    6 ELISA檢測caspase-3的表達(dá)

    細(xì)胞處理24 h后,提取細(xì)胞中的蛋白并定量。按說明書配制好所有的試劑:酶標(biāo)板每孔加入100 μL的蛋白樣品,覆膜覆蓋后室溫在搖床上孵育3 h,3 h后去除板內(nèi)液體并在每孔加入300 μL的1×洗滌液,重復(fù)2次,然后每孔加入200 μL的1×活性液,在酶標(biāo)儀使用450 nm波長處讀取A值。

    7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    所有數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean± SEM)表示,使用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異采用單因素方差分析中的最小顯著差異檢驗(yàn)(LSD),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 CoCl2誘導(dǎo)的低氧促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡及自噬

    1.1CoCl2誘導(dǎo)的低氧促進(jìn)了PC12細(xì)胞的凋亡 不同濃度的氯化鈷(CoCl2)處理PC12細(xì)胞24 h后,顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài), CCK-8檢測細(xì)胞活力,并提取蛋白檢測細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示:50、150、250 μmol/L濃度的CoCl2處理后的PC12細(xì)胞狀態(tài)(可以從細(xì)胞形態(tài),貼壁能力及突觸的長度等來評估)明顯下降;細(xì)胞活力也隨CoCl2濃度依賴性下降,見圖1A (P<0.01);凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)明顯升高,見圖1B(P<0.05)。

    1.2CoCl2誘導(dǎo)的低氧促進(jìn)了PC12細(xì)胞自噬的發(fā)生 PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度的氯化鈷(CoCl2)處理24 h后,用Western blotting的方法檢測自噬蛋白Beclin-1的表達(dá),并采用蛋白免疫熒光的手段觀察胞核內(nèi)LC-3的表達(dá)情況。由圖1C可以觀察到beclin-1蛋白隨著CoCl2濃度的升高而表達(dá)增多,自噬標(biāo)志蛋白LC-3的表達(dá)亦存在相同的趨勢,見圖4(LC-3的表達(dá)量通過細(xì)胞核內(nèi)小藍(lán)色亮點(diǎn)的數(shù)量進(jìn)行評估),提示CoCl2誘導(dǎo)的低氧確實(shí)促進(jìn)了PC12細(xì)胞自噬的發(fā)生。

    2 EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及自噬

    2.1EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 通過細(xì)胞形態(tài)觀察我們可以發(fā)現(xiàn),與對照組相比,150 μmol/L的CoCl2誘導(dǎo)的低氧對細(xì)胞狀態(tài)有嚴(yán)重?fù)p傷,而加入不同濃度的EGCG后,細(xì)胞狀態(tài)較損傷組有明顯好轉(zhuǎn),見圖2。單用EGCG則未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)與正常PC12細(xì)胞有明顯差異,見圖4。

    同時(shí)我們使用CCK8檢測細(xì)胞活力和ELISA檢測caspase-3表達(dá)水平從而對細(xì)胞的凋亡程度進(jìn)行評估,結(jié)果顯示與150 μmol/L的CoCl2處理組相比,同時(shí)加入不同濃度的EGCG處理后,細(xì)胞活力有一定程度的恢復(fù),見圖3A(P<0.01)。相比較于CoCl2處理組,不同濃度的EGCG處理后caspase-3的表達(dá)水平有一定程度的下降,見圖3B(P<0.01)。

    Figure 1. CoCl2 induced hypoxia promoted apoptosis and autophagy in PC12 at 24 h. A: cell viability was determined by CCK-8; B: caspase-3 was determined by ELISA; C: the expression of beclin-1 was detected by Western blotting using an anti-beclin-1 antibody; D: mTOR expression was detected by Western blotting. Mean±SEM. n=3. * P<0.05, **P<0.01 vs control group (0 μmoL/L).

    2.2EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬 我們對150 μmol/L的CoCl2以及不同濃度的EGCG處理PC12細(xì)胞24 h后的自噬標(biāo)志蛋白beclin-1和LC-3進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示:CoCl2單獨(dú)處理細(xì)胞后的beclin-1表達(dá)水平明顯升高,而不同濃度EGCG的處理對beclin-1的表達(dá)水平有一定程度的抑制,見圖3C(P<0.05)。從免疫熒光我們可以觀察到與CoCl2單獨(dú)處理組相比,加入150 μmol/L的EGCG對細(xì)胞核內(nèi)LC-3的表達(dá)有一定程度的抑制,而單獨(dú)使用150 μmol/L的EGCG處理的PC12細(xì)胞LC-3的表達(dá)與對照組無明顯差異,見圖4。

    3 EGCG通過調(diào)控mTOR通路拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與自噬

    3.1CoCl2誘導(dǎo)的低氧抑制mTOR通路的表達(dá) 為明確mTOR對EGCG抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性的介導(dǎo)作用,我們用不同濃度的CoCl2處理PC12細(xì)胞24 h后,Western blotting檢測mTOR的表達(dá),從結(jié)果可以觀察到mTOR的表達(dá)水平呈濃度依賴性下降,見圖1D(P<0.05)。

    3.2EGCG拮抗CoCl2對mTOR通路的抑制作用 PC12細(xì)胞同時(shí)經(jīng)過不同濃度的EGCG處理24 h后,mTOR表達(dá)水平相較于CoCl2處理組出現(xiàn)濃度依賴性上升,見圖3D(P<0.05),單獨(dú)使用EGCG對mTOR的表達(dá)無明顯影響。提示mTOR通路可能參與介導(dǎo)了EGCG抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性。

    3.3雷帕霉素(mTOR特異性阻滯劑)逆轉(zhuǎn)了EGCG對CoCl2誘導(dǎo)的凋亡與自噬的拮抗作用 上述結(jié)果提示mTOR通路可能參與了EGCG抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性的介導(dǎo)作用,為進(jìn)一步了解EGCG是否通過mTOR通路發(fā)揮作用,我們使用mTOR特異性阻滯劑:雷帕霉素(RAPA)來阻斷mTOR通路,從細(xì)胞狀態(tài)的結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)加入RAPA處理后,EGCG對細(xì)胞狀態(tài)的改善作用被逆轉(zhuǎn);單獨(dú)使用RAPA,細(xì)胞狀態(tài)沒有發(fā)生明顯的改變,見圖2。使用RAPA后,用CCK8檢測細(xì)胞活力,我們發(fā)現(xiàn)加入RAPA處理,PC12細(xì)胞的活力較EGCG處理組明顯下降;同時(shí),凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)水平升高,見圖5(P<0.05)。

    加入RAPA處理后,EGCG對細(xì)胞自噬的抑制效果也同樣被逆轉(zhuǎn)。自噬蛋白beclin-1的表達(dá)水平較EGCG處理組有一定程度的升高,見圖5C(P<0.05)。同時(shí),RAPA處理后的EGCG組LC-3在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)水平亦出現(xiàn)升高,見圖4。而單用RAPA則對LC-3在細(xì)胞核的表達(dá)水平與對照組無明顯差異。

    Figure 2. Effect of EGCG on hypoxic apoptosis induced by CoCl2 in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h (×400). 1: control group; 2: CoCl2 50 μmol/L; 3: CoCl2 150 μmol/L; 4: CoCL2 250 μmol/L; 5:CoCl2 150 μmol/L+EGCG 10 μmol/L; 6: CoCl2 150 μmol/L+ EGCG 20 μmol/L;7: CoCl2 150 μmol/L+ EGCG 40 μmol/L; 8: EGCG 40 μmol/L; 9: CoCl2 150 μmol/L+EGCG 20 μmol/L+RAPA 100 nmol/L; 10: RAPA 100 nmol/L.

    討 論

    中國人飲茶的習(xí)慣最早始于神農(nóng)時(shí)代,時(shí)至當(dāng)今仍然被傳承與發(fā)揚(yáng)。茶葉中主要成分茶多酚的作用越來越得到研究者們的重視,表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為茶多酚生物活性的主要成分,更是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)所在。據(jù)報(bào)道:EGCG一方面有積極的抗腫瘤作用,例如肺癌[8]、宮頸癌[9]、胃癌[10]及胰腺癌[11]等,另一方面,對正常細(xì)胞的抗凋亡等保護(hù)預(yù)防作用[1]也多有研究。同時(shí),眾所周知,神經(jīng)細(xì)胞缺氧會引起一系列的生理、病理反應(yīng),像氧化應(yīng)激、自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]等,當(dāng)超過細(xì)胞的清除能力時(shí),會引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[13],最終導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。因此,深入闡明缺氧對神經(jīng)細(xì)胞毒性的機(jī)制對神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病防治和人類的健康同樣具有重大的意義。

    Figure 3. Effects of EGCG on hypoxic apoptosis and autophagy induced by CoCl2 in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG for 24 h. A: the cell viability was determined by CCK-8 assay; B: caspase-3 was determined by ELISA; C, D: the expression of beclin-1 and mTOR was detected by Western blotting. Mean±SEM.n=3.* P<0.05, ** P<0.01 vs control group (0 μmol/L); #P<0.05, ##P<0.01 vs CoCl2 150 μmol/L group .

    Figure 4. Effects of EGCG on hypoxic autophagy induced by CoCl2 in PC12 cells.PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h. The expression of LC-3 was determined by immunofluorescence using an anti-LC-3 antibody. 1: control group; 2: CoCl2 150 μmol/L; 3: CoCl2 150 μmol/L + EGCG 20μmol/L; 4: CoCl2 150 μmol/L + EGCG 20 μmol/L +RAPA 100 nmol/L; 5: EGCG 20 μmol/L; 6: RAPA 100 nmol/L.

    EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及自噬 PC12細(xì)胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤,其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能與多巴胺能神經(jīng)元有一定相似性,廣泛地用于神經(jīng)細(xì)胞的研究。此外,一些研究表明,在許多細(xì)胞中CoCl2可以模擬誘導(dǎo)細(xì)胞的缺氧環(huán)境[14],如PC12、C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[15]。為了明確缺氧對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用,我們采用PC12細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞模型,不僅觀察了缺氧環(huán)境下神經(jīng)細(xì)胞的狀態(tài),還通過細(xì)胞活力的檢測和caspase-3的表達(dá)水平客觀評估了其凋亡程度,并檢測了細(xì)胞中自噬標(biāo)志性蛋白beclin-1和LC-3的表達(dá),事實(shí)上,CoCl2誘導(dǎo)的缺氧確實(shí)增加了細(xì)胞的凋亡,并上調(diào)了細(xì)胞的自噬作用。其它相關(guān)研究也證實(shí),CoCl2誘導(dǎo)的缺氧可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[5]、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[16]的發(fā)生。這些研究結(jié)果都與我們對缺氧環(huán)境對細(xì)胞凋亡和自噬增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致。

    EGCG通過調(diào)控mTOR通路拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與自噬,mTOR是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶,可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成,并影響細(xì)胞的增殖、凋亡,同時(shí)在細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激、自噬等生物學(xué)功能中發(fā)揮作用[17]。我們通過檢測mTOR在CoCl2誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境以及EGCG處理后的表達(dá)發(fā)現(xiàn):CoCl2誘導(dǎo)的缺氧抑制了mTOR的表達(dá),而EGCG則恢復(fù)了其活性,說明mTOR介導(dǎo)了CoCl2誘導(dǎo)的缺氧對神經(jīng)細(xì)胞毒性。

    Figure 5. Effects of RAPA on EGCG-induced downregulation of apoptosis in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h.A: the cell viability was determined by CCK-8 assay; B:caspase-3 was determined by ELISA;C: the expression of beclin-1 was detected by Western blotting. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs control group;# P<0.05, ## P<0.01 vs CoCl2 150 μmol/L group.

    阻斷mTOR通路后EGCG是否能拮抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性?為了得到答案,我們采用mTOR特異性阻滯劑雷帕霉素功能處理細(xì)胞后,結(jié)果提示細(xì)胞凋亡增加,凋亡蛋白caspase-3表達(dá)增多;自噬水平升高,自噬標(biāo)志蛋白beclin-1和LC-3表達(dá)均升高,說明mTOR通路阻斷后,加重了CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性,抵消了EGCG拮抗低氧所致的細(xì)胞損傷,EGCG通過調(diào)控mTOR通路發(fā)揮抑制凋亡、降低自噬的生物學(xué)作用,從而拮抗低氧所致的神經(jīng)毒性。

    值得注意的是,通過觀察阻斷mTOR通路表達(dá)的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)加入RAPA阻斷mTOR通路后相比于對照組并未完全抑制PC12細(xì)胞的活力,并且自噬水平下降的程度有限,這提示我們可能還存在其它的通路使得EGCG發(fā)揮其抗凋亡,抑制自噬的生物學(xué)作用。

    通過研究,我們證實(shí)了EGCG通過mTOR通路拮抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧引起的PC12細(xì)胞的凋亡與自噬。這為缺氧的神經(jīng)毒性機(jī)制的研究提供了新的線索和思路,基于目前的研究,運(yùn)用EGCG治療神經(jīng)細(xì)胞缺氧所致的損傷或許是新的途徑與策略,同時(shí),這對于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究與治療也開辟了新的視角。

    [參 考 文 獻(xiàn)]

    [1] Renno WM, Al-Khaledi G, Mousa A, et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) modulates neurological function when intravenously infused in acute and, chronically injured spinal cord of adult rats[J]. Neuropharmacology, 2014, 77:100-119.

    [2] Niu Y, Na L, Feng R, et al. The phytochemical, EGCG, extends lifespan by reducing liver and kidney function damage and improving age-associated inflammation and oxidative stress in healthy rats[J]. Aging Cell, 2013, 12(6):1041-1049.

    [3] Liu Q, Qian Y, Chen F, et al. EGCG attenuates pro-inflammatory cytokines and chemokines production in LPS-stimulated L02 hepatocyte[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2014, 46(1):31-39.

    [4] Kim HS, Montana V, Jang HJ, et al. Epigallocatechin gallate (EGCG) stimulates autophagy in vascular endothelial cells: a potential role for reducing lipid accumulation[J]. J Biol Chem, 2013, 288(31):22693-22705.

    [5] Hu J, Zhao TZ, Chu WH, et al. Protective effects of 20-hydroxyecdysone on CoCl(2)-induced cell injury in PC12 cells[J]. J Cell Biochem, 2010, 111(6):1512-1521.

    [6] Tang Z, Bereczki E, Zhang H, et al. Mammalian target of rapamycin (mTor) mediates tau protein dyshomeostasis: implication for Alzheimer disease[J]. J Biol Chem, 2013, 288(22):15556-15570.

    [7] Hwang SK, Kim HH. The functions of mTOR in ischemic diseases[J]. BMB Rep, 2011, 44(8):506-511.

    [8] Liu LC, Tsao TC, Hsu SR, et al. EGCG inhibits transforming growth factor-beta-mediated epithelial-to-mesenchymal transition via the inhibition of Smad2 and Erk1/2 signaling pathways in nonsmall cell lung cancer cells[J]. J Agric Food Chem, 2012, 60(39):9863-9873.

    [9] Muthusami S, Prabakaran DS, An Z, et al. EGCG suppresses Fused Toes Homolog protein through p53 in cervical cancer cells[J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(10):5587-5596.

    [10] Park JS, Khoi PN, Joo YE, et al. EGCG inhibits recepteur d’origine nantais expression by suppressing Egr-1 in gastric cancer cells[J]. Int J Oncol, 2013, 42(3):1120-1126.

    [11] Shankar S, Marsh L, Srivastava RK. EGCG inhibits growth of human pancreatic tumors orthotopically implanted in Balb C nude mice through modulation of FKHRL1/FOXO3a and neuropilin[J]. Mol Cell Biochem, 2013, 372(1-2):83-94.

    [12] Zhang H, Li H, Liu X, et al. Effect of caspase-9 inhibition on endoplasmic reticulum stress induced cortical neuronal injury in rats[J]. Int J Clin Exp Med, 2013, 6(7):546-551.

    [13] Liu SY, Chen CL, Yang TT, et al. Albumin prevents reactive oxygen species-induced mitochondrial damage, autophagy, and apoptosis during serum starvation[J]. Apoptosis, 2012, 17(11):1156-1169.

    [14] Lee M, Kang H, Jang SW. CoCl2induces PC12 cells apoptosis through p53 stability and regulating UNC5B[J]. Brain Res Bull, 2013, 96:19-27.

    [15] Chhunchha B, Fatma N, Kubo E, et al. Curcumin abates hypoxia-induced oxidative stress based-ER stress-mediated cell death in mouse hippocampal cells (HT22) by controlling Prdx6 and NF-κB regulation[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2013, 304(7):C636-C655.

    [16] Chen S, Ren Q, Zhang J, et al. N-acetyl-L-cysteine protects against cadmium-induced neuronal apoptosis by inhibiting ROS-dependent activation of Akt/mTOR pathway in mouse brain[J]. Neuropathol Appl Neurobiol, 2014,40(6):759-777.

    [17] Wang Y, Hu Z, Liu Z, et al. mTOR inhibition attenuates DNA damage and apoptosis through autophagy-mediated suppression of CREB1[J]. Autophagy, 2013, 9(12):2069-2086.

    猜你喜歡
    神經(jīng)細(xì)胞低氧孵育
    間歇性低氧干預(yù)對腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響
    熊果酸減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡
    中成藥(2021年5期)2021-07-21 08:39:04
    三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測定及其代謝
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    Wnt/β-catenin信號通路在低氧促進(jìn)hBMSCs體外增殖中的作用
    操控神經(jīng)細(xì)胞“零件”可抹去記憶
    Hoechst33342/PI雙染法和TUNEL染色技術(shù)檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡的對比研究
    NF-κB介導(dǎo)線粒體依賴的神經(jīng)細(xì)胞凋亡途徑
    裸鼴鼠不同組織中低氧相關(guān)基因的表達(dá)
    av免费在线看不卡| 嫩草影视91久久| 中出人妻视频一区二区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 两个人的视频大全免费| 国产一区二区在线av高清观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 97热精品久久久久久| 99久久精品热视频| 全区人妻精品视频| 日本黄色片子视频| 偷拍熟女少妇极品色| 日韩制服骚丝袜av| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美激情在线99| 国产亚洲精品久久久com| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 中国美白少妇内射xxxbb| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品久久久久久成人av| 亚洲人与动物交配视频| 禁无遮挡网站| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美性感艳星| 91在线精品国自产拍蜜月| 成人特级av手机在线观看| 天堂√8在线中文| 日本 av在线| 最新中文字幕久久久久| 男人舔奶头视频| av福利片在线观看| 免费av观看视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久久a久久爽久久v久久| 校园春色视频在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲在线自拍视频| 人妻久久中文字幕网| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 一本一本综合久久| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中国国产av一级| 国产亚洲91精品色在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 日本成人三级电影网站| 欧美+日韩+精品| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品99久久久久久久久| 91狼人影院| 美女被艹到高潮喷水动态| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| h日本视频在线播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日本熟妇午夜| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久人妻av系列| 亚洲在线自拍视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 最新在线观看一区二区三区| 男插女下体视频免费在线播放| 偷拍熟女少妇极品色| 村上凉子中文字幕在线| 国产毛片a区久久久久| 欧美高清成人免费视频www| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品亚洲美女久久久| 精品一区二区三区av网在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 简卡轻食公司| 成人无遮挡网站| 国产一区二区在线av高清观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 少妇的逼水好多| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美性感艳星| 黄片wwwwww| av.在线天堂| 色av中文字幕| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 男女视频在线观看网站免费| 十八禁网站免费在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 免费看a级黄色片| 国产成人精品久久久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品不卡视频一区二区| 国产激情偷乱视频一区二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 热99re8久久精品国产| 最近手机中文字幕大全| 变态另类丝袜制服| 日日啪夜夜撸| 亚洲成人av在线免费| 在线国产一区二区在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 好男人在线观看高清免费视频| 偷拍熟女少妇极品色| 有码 亚洲区| 亚洲美女视频黄频| 亚洲精品在线观看二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 日日撸夜夜添| 神马国产精品三级电影在线观看| 精品福利观看| 亚洲欧美日韩东京热| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 成年免费大片在线观看| 午夜福利在线观看吧| 乱人视频在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产精品日韩av在线免费观看| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日韩欧美在线乱码| 日本一本二区三区精品| 国产精品久久久久久久久免| 国产亚洲精品久久久com| 国模一区二区三区四区视频| 69人妻影院| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美日韩在线观看h| av中文乱码字幕在线| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 99热这里只有是精品在线观看| 午夜福利在线观看吧| 男女视频在线观看网站免费| 一区二区三区四区激情视频 | 日韩中字成人| eeuss影院久久| 性欧美人与动物交配| 中国国产av一级| 国产私拍福利视频在线观看| 成人国产麻豆网| 亚洲乱码一区二区免费版| 伊人久久精品亚洲午夜| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久久欧美国产精品| 欧美日韩国产亚洲二区| 波多野结衣巨乳人妻| 久久亚洲国产成人精品v| 免费人成在线观看视频色| 国产成人a区在线观看| 国产高清三级在线| 国产乱人偷精品视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美激情在线99| 亚洲高清免费不卡视频| 六月丁香七月| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 男人舔奶头视频| 亚洲美女黄片视频| 在线天堂最新版资源| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲国产精品合色在线| 亚洲成人av在线免费| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久久久久久久中文| 啦啦啦韩国在线观看视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 最近在线观看免费完整版| 免费看av在线观看网站| 99热这里只有精品一区| 国产久久久一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜激情欧美在线| 中国美女看黄片| 久久精品夜色国产| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产视频内射| 久久99热6这里只有精品| 人妻少妇偷人精品九色| 一本久久中文字幕| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲国产精品sss在线观看| 日本与韩国留学比较| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 91久久精品电影网| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲自拍偷在线| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产不卡一卡二| 热99在线观看视频| 成年女人永久免费观看视频| 最后的刺客免费高清国语| 啦啦啦啦在线视频资源| 观看免费一级毛片| 特级一级黄色大片| 麻豆久久精品国产亚洲av| av国产免费在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲av免费在线观看| 亚洲精品色激情综合| 欧美精品国产亚洲| 亚洲国产欧美人成| 久久久精品94久久精品| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国国产精品蜜臀av免费| 两个人视频免费观看高清| 午夜老司机福利剧场| 亚洲精品久久国产高清桃花| 1024手机看黄色片| 99热6这里只有精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 热99re8久久精品国产| 亚洲图色成人| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产精品电影一区二区三区| 久久久久国产网址| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产高清不卡午夜福利| ponron亚洲| 亚洲国产精品sss在线观看| www.色视频.com| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲最大成人手机在线| 国产三级中文精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 日韩av在线大香蕉| 免费搜索国产男女视频| 精品久久久久久久末码| 99久国产av精品国产电影| 国产精品一二三区在线看| 老女人水多毛片| 内射极品少妇av片p| 熟女电影av网| 两个人的视频大全免费| 美女免费视频网站| 日本 av在线| 久久久久久国产a免费观看| 久久久精品欧美日韩精品| 色播亚洲综合网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 三级毛片av免费| 99热这里只有精品一区| 免费观看精品视频网站| 成人永久免费在线观看视频| 黄色日韩在线| 波多野结衣高清无吗| 免费av毛片视频| 六月丁香七月| 亚洲人成网站高清观看| 九九在线视频观看精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 天美传媒精品一区二区| 久99久视频精品免费| 淫妇啪啪啪对白视频| 99久久九九国产精品国产免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 性色avwww在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 六月丁香七月| 成人美女网站在线观看视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲国产精品国产精品| 欧美+日韩+精品| 身体一侧抽搐| 日韩欧美精品v在线| 热99在线观看视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 在线观看午夜福利视频| 日本在线视频免费播放| 欧美最黄视频在线播放免费| av天堂中文字幕网| 精品久久久久久久久亚洲| 日韩欧美三级三区| av在线天堂中文字幕| 人妻少妇偷人精品九色| 天堂影院成人在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产av在哪里看| 国产一区二区激情短视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲第一电影网av| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 听说在线观看完整版免费高清| 久久6这里有精品| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 在线播放无遮挡| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲真实伦在线观看| 黑人高潮一二区| 亚洲精品国产成人久久av| 一本久久中文字幕| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩成人伦理影院| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲性久久影院| 日韩制服骚丝袜av| 简卡轻食公司| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品免费一区二区三区在线| 乱系列少妇在线播放| 91在线观看av| 精品国产三级普通话版| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲久久久久久中文字幕| av福利片在线观看| 99热只有精品国产| 亚洲国产精品成人久久小说 | 天堂影院成人在线观看| 小说图片视频综合网站| 黑人高潮一二区| 好男人在线观看高清免费视频| 99热精品在线国产| av在线观看视频网站免费| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 99久国产av精品国产电影| 91在线观看av| 深夜a级毛片| 美女免费视频网站| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品一二三区在线看| 久久鲁丝午夜福利片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 插阴视频在线观看视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产高潮美女av| 91久久精品国产一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 赤兔流量卡办理| 国产精品无大码| 卡戴珊不雅视频在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 亚洲美女视频黄频| 中国美女看黄片| 黄色欧美视频在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 国产精品日韩av在线免费观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久久国产网址| 精品乱码久久久久久99久播| 最近在线观看免费完整版| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美又色又爽又黄视频| 日韩欧美免费精品| 色尼玛亚洲综合影院| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲电影在线观看av| 长腿黑丝高跟| 99热这里只有是精品在线观看| 大香蕉久久网| 色吧在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久中文看片网| 简卡轻食公司| 国产成人一区二区在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产乱人视频| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产精品国产高清国产av| 日韩三级伦理在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品99久久久久久久久| 免费电影在线观看免费观看| 久久人人爽人人片av| 国产成人freesex在线 | 观看免费一级毛片| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 中文字幕久久专区| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美成人a在线观看| 国内精品久久久久精免费| 久久人人精品亚洲av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美日韩在线观看h| 成人无遮挡网站| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 22中文网久久字幕| 日日干狠狠操夜夜爽| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品无大码| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产免费男女视频| 一区福利在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 在线看三级毛片| 日韩精品中文字幕看吧| 国产伦精品一区二区三区视频9| 男人和女人高潮做爰伦理| 看黄色毛片网站| 看非洲黑人一级黄片| 国产成人影院久久av| 久久久欧美国产精品| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜福利视频1000在线观看| 赤兔流量卡办理| 亚洲美女视频黄频| 最近在线观看免费完整版| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 白带黄色成豆腐渣| 一级毛片电影观看 | 亚洲,欧美,日韩| 国产精品久久久久久精品电影| 午夜精品在线福利| 国产午夜精品论理片| 久久精品国产自在天天线| 日本一二三区视频观看| 日韩国内少妇激情av| 美女黄网站色视频| 美女高潮的动态| av福利片在线观看| 色综合站精品国产| 国产91av在线免费观看| 12—13女人毛片做爰片一| 久久6这里有精品| 国产伦精品一区二区三区四那| 少妇人妻一区二区三区视频| 俺也久久电影网| 国产精品亚洲美女久久久| 免费电影在线观看免费观看| 国产视频内射| 全区人妻精品视频| 久久久久久久午夜电影| 欧美激情在线99| 中文字幕免费在线视频6| 中文字幕av成人在线电影| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久久欧美国产精品| 精品午夜福利在线看| 成熟少妇高潮喷水视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 欧美一区二区精品小视频在线| 久久精品91蜜桃| 国产男人的电影天堂91| 国产精品久久电影中文字幕| 日日啪夜夜撸| 午夜免费激情av| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产高清视频在线观看网站| 免费看日本二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 一级毛片我不卡| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲美女视频黄频| 国产精品一区www在线观看| 亚洲色图av天堂| 国产精品女同一区二区软件| av黄色大香蕉| 精品人妻视频免费看| 亚洲成人久久爱视频| 免费无遮挡裸体视频| or卡值多少钱| 日本在线视频免费播放| 久久久精品94久久精品| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜激情福利司机影院| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品久久久久久久末码| 97超碰精品成人国产| 午夜a级毛片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 久久九九热精品免费| 免费观看在线日韩| 俺也久久电影网| 熟女电影av网| 欧美激情在线99| 欧美激情久久久久久爽电影| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国国产精品蜜臀av免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲自偷自拍三级| 真实男女啪啪啪动态图| 美女黄网站色视频| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲美女视频黄频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日本五十路高清| 午夜激情福利司机影院| 欧美一区二区精品小视频在线| 成人性生交大片免费视频hd| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲高清免费不卡视频| h日本视频在线播放| 狠狠狠狠99中文字幕| 少妇的逼水好多| 亚洲av免费在线观看| 丝袜喷水一区| 深夜精品福利| 男女那种视频在线观看| 在线免费观看的www视频| av黄色大香蕉| 日韩欧美三级三区| 亚洲av成人精品一区久久| 变态另类丝袜制服| 亚洲在线自拍视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品久久久久久久久久久久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产大屁股一区二区在线视频| 色吧在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 一a级毛片在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 深夜a级毛片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美日韩乱码在线| 亚洲性久久影院| 18禁在线播放成人免费| 赤兔流量卡办理| 久久久久久久午夜电影| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 在线播放国产精品三级| 草草在线视频免费看| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲中文字幕日韩| 偷拍熟女少妇极品色| av在线亚洲专区| 97超视频在线观看视频| 精品无人区乱码1区二区| 神马国产精品三级电影在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产淫片久久久久久久久| 国产高清视频在线播放一区| 久久午夜亚洲精品久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 春色校园在线视频观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 伦理电影大哥的女人| 亚洲高清免费不卡视频| av福利片在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 丝袜美腿在线中文| 黄色一级大片看看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产在线男女| 97在线视频观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产成人福利小说| 青春草视频在线免费观看| 久久久久久国产a免费观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 99热只有精品国产| 亚洲在线观看片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 丝袜喷水一区| 深夜精品福利| 成人美女网站在线观看视频| 亚州av有码| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久a久久爽久久v久久| 色吧在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 久久精品国产清高在天天线| 久久精品国产亚洲av天美| 在线观看一区二区三区| 亚洲人成网站在线播| 黄片wwwwww| 色av中文字幕| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产久久久一区二区三区| 91av网一区二区|