外周血中Treg細胞和Th17細胞與慢性乙型肝炎相關性的Meta分析

潘宗琴，呂 紅，胡世蕓，陳 宇，陳妍雯，肖 政，邱隆敏

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 感染科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院循證醫(yī)學中心，循證醫(yī)學教育部網(wǎng)上合作研究中心遵義醫(yī)學院分中心，貴州 遵義 563099)

據(jù)流行病學調查推算，我國現(xiàn)有慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者約2000萬例[1-2]，慢性乙肝已經(jīng)成為嚴重危害我國人民健康的重大傳染病之一，其發(fā)病機制尚不完全清楚。調節(jié)性T細胞(regulatory T cell , Tregs )和輔助性T細胞17(T helper cell 17, Th17)是新近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群，國內外研究提示Tregs/Th17細胞與HBV感染性疾病有關[3-5]，但其發(fā)揮具體作用目前尚無可靠證據(jù)證實。本研究對以CHB為研究對象，就其與其他HBV感染狀態(tài)外周血中Tregs和Th17細胞頻率的差異比較做相關Meta分析，探討Tregs和Th17細胞在CHB與其它HBV感染狀態(tài)頻率特征，以期揭示其對CHB轉歸的影響，為臨床干預提供依據(jù)。

1 方法

1.1 文獻檢索 兩名檢索員以以下中英文檢索式獨立檢索Pubmed、SCI、Embase、CNKI、CBM及萬方等數(shù)據(jù)庫(建庫至2014-01，不限語種)。中文檢索式：(慢性乙型肝炎or慢性乙肝or CHB or HBV) and (Treg細胞or調節(jié)性T細胞or CD4+CD25+Treg) and (輔助性T細胞17 or Th17細胞)；英文檢索式：(Hepatitis B, Chronic or HBV or hepatitis B virus) and ( regulatory T cells or tregs) and (Th17 or Th17 cells or interleukin 17 producing CD4 T cells)。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①研究類型：臨床研究；②研究設計：病例對照研究；③研究對象：慢性乙型肝炎患者；③干預措施：流式細胞術檢測患者外周血中Tregs及Th17細胞頻率。排除標準：①動物研究、細胞研究；②綜述、會議摘要、無關、重復發(fā)表或數(shù)據(jù)混亂模糊不清的文獻。

1.3 質量評價標準 納入文獻均為病例對照研究，選擇Newcastle-Ottawa Scale(NOS)[6]標準，從選擇、可比性、暴露信息三個方面評價納入文獻質量。

1.4 文獻篩選與質量評價 兩位評價員嚴格按照納入及排除標準、NOS質量評價標準，獨立篩選及評價文獻質量，任何分歧通過討論或與第三方討論解決。

1.5 資料提取 依據(jù)PICOS原則設計資料提取表格包括文獻出處、發(fā)表年代、研究對象及對照的例數(shù)、干預措施(標本來源、檢測方法)、結局指標及研究設計。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用RevMan5.1軟件進行Meta分析。依據(jù)納入研究特征，納入研究定量資料(Tregs、Th17細胞含量及Tregs/Th17在實驗組與對照組之間差異比較)、選用均數(shù)差(mean difference,MD)為合并統(tǒng)計量。對各納入研究結果進行異質性檢驗， 根據(jù)檢驗結果(以α = 0.05為檢驗水準)選擇相應數(shù)據(jù)合并方法。如P>0.05、I2<25%，選用固定效應模型、倒方差法計算合并MD值；反之，選用隨機效應模型、D-L法計算合并MD值，并分析導致異質性的可能原因。

2 結果

2.1 文獻檢索及篩選結果 共檢索出文獻124篇，依次閱讀題目、摘要、全文，排除重復、無關及綜述、會議摘要后、 納入符合文獻12篇，詳見流程圖1。

2.2 納入研究基本特征 納入文獻12篇，均為我國研究，于2010年至2013年，逐年增多。合計納入CHB 413例、HBV攜帶者(asymptomatic HBV carriers, AsC)59例、急性乙型肝炎(acute hepatitis B,AHB)38例及健康對照(healthy control, HC)245例。標本均為外周血，流式細胞術檢測Tregs、Th17細胞，6個研究做了Tregs/Th17比值分析。主要探討Tregs和Th17細胞與不同HBV感染狀態(tài)相關分析(見表1)。結果表明：此類研究近年重視程度增加。

圖1 文獻篩選流程圖

表1納入研究基本特征

出處年代研究對象干預措施結局指標CHBAsCAHBHCI1I2O1O2O3研究設計朱軼晴等[7]201317-1314√√√√_病例對照王萍等[8]201340401530√√√√-病例對照王愛珍等[9]201330--30√√√√√病例對照林綱等[10]201355--30√√√√√病例對照Zhang,G.L[11]201330--18√√√√_病例對照Niu,Y.H[12]201329--20√√√√√病例對照余雪平[13]201270--20√√√√√病例對照胡鳳霞[14]201220--15√√√√_病例對照Xue-Song,L[15]201218121010√√__√病例對照李婕[16]201116--18√√√√_病例對照Zhai, S[17]201130--30√√√√√病例對照高偉[18]2010587-10√√√√_病例對照

I1：檢測標本(外周血)；I2：檢測技術(流式細胞術)；O1:Tregs占CD4+T細胞的比例；O2:Th17細胞占CD4+T細胞的比例；O3:Tregs/Th17；√：文中有描述；/：文中無描述。

2.3 質量評價 納入文獻12篇，均為病例對照研究，依據(jù)NOS質量評價標準(總分9分)評分如下：①選擇評價：12項研究病例確定恰當，均為一定時間內連續(xù)收集且有代表性的病例，病例定義充分，代表性尚可；對照的定義均明確，但對照的選擇均非社區(qū)對照，選擇評分12項研究均為3分；②可比性評價：6項研究對性別、年齡進行匹配，可比性評分1分，其余6篇還對其他重要混雜因素匹配(如采血前未接受抗病毒、免疫調節(jié)及激素治療等)，可比性評分2分；③暴露評價：12項研究病例和對照的暴露因素均采用相同確定方法(流式細胞術)，但暴露因素的確定均在非盲法情況下進行的調查，且均未對暴露無應答率作描述，暴露評分均為1分。結果表明：整體評分5～6分(評分表略)。

2.4 不同HVB感染狀態(tài)外周血中Tregs、Th17細胞含量及Tregs/Th17比值差異比較

2.4.1 慢性乙型肝炎患者與健康對照(HC)外周血中Tregs、Th17細胞含量及Tregs/Th17比值差異比較 CHB與HC外周血 Tregs和Th17細胞含量的差異比較共納入文獻11篇，CHB327例、HC235例，各研究異質性較大(P<0.000 01，I2=95%；P<0.000 01、I2=99%)，選用隨機效應模型，結果(圖2、圖3)顯示：均數(shù)差(MD)的合并效應量分別等于1.77、0.94，其95%CI分別為[1.01、2.52]、[0.68、1.20]，合并效應量的檢驗Z=4.60，P<0.000 01；Z=7.11，P<0.000 01。CHB外周血中Tregs及Th17細胞含量均高于健康對照者，差異均有統(tǒng)計學意義。

CHB與HC Tregs/Th17比值的差異比較共納入文獻6篇，CHB202例、HC140例，各研究異質性較大(P<0.000 01，I2=93%)，選用隨機效應模型，結果(圖4)顯示：均數(shù)差(MD)的合并效應量等于-1.45，其95%CI分別為[-2.82、-0.07]，合并效應量的檢驗Z=2.06，P=0.04。CHB Tregs/Th17低于健康對照者，差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 CHB與健康對照Tregs含量差異比較的森林圖

圖3 CHB與健康對照Th17細胞含量差異比較的森林圖

圖4 CHB與健康對照Tregs/Th17差異比較的森林圖

2.4.2 CHB患者與AsC外周血中Tregs及Th17細胞含量差異比較 共納入文獻2篇，CHB60例、AsC47例，各研究異質性較大(P<0.00001，I2=95%；P<0.00001、I2=98%)，選用隨機效應模型，結果(圖5、圖6)顯示：均數(shù)差(MD)的合并效應量分別等于1.41、-1.46，其95%CI分別為[-3.39、6.21]、[-3.98、1.05]，合并效應量的檢驗Z=0.57，P=0.57；Z=1.14，P=0.25。CHB 外周血中Tregs含量低于AsC，CHB外周血中Th17細胞含量高于AsC，差異均無統(tǒng)計學意義。

圖5 CHB與AsC Tregs含量差異比較的森林圖

圖6 CHB與AsC Th17細胞含量差異比較的森林圖

2.4.3 CHB與AHB外周血中Tregs及Th17細胞含量差異比較 共納入文獻2篇，CHB57例、AHB53例，各研究異質性較大(P=0.05、I2=74%；P=0.007、I2=86%)，選用隨機效應模型，結果(圖7、圖8)顯示：均數(shù)差(MD)的合并效應量分別等于-2.48、0.98，其95%CI分別為[-4.07、-0.89]、[-1.03、2.99]，合并效應量的檢驗Z=3.06，P=0.002；Z=0.95，P=0.34。CHB外周血中Tregs含量高于AHB，差異有統(tǒng)計學意義；CHB 外周血中Th17細胞含量低于AHB，差異無統(tǒng)計學意義。

圖7 CHB與AHB Tregs含量差異比較的森林圖

圖8 CHB與AHB Th17細胞含量差異比較的森林圖

2.4.5 CHB輕中度及重度外周血中Tregs、Th17細胞含量及Tregs/Th17比值差異比較 CHB輕中度及重度外周血中Tregs、Th17細胞含量的差異比較共納入文獻4篇，輕中度130例、重度83例，各研究異質性較大(P=0.002、I2=79%；P<0.00001、I2=99%)，選用隨機效應模型，結果(圖9、圖10)顯示：均數(shù)差(MD)的合并效應量分別等于0.46、-0.61，其95%CI分別為[-0.68、1.60]、[-1.14、-0.08]，合并效應量的檢驗Z=0.79，P=0.43；Z=2.25，P=0.02。CHB輕中度外周血中Tregs含量高于重度，差異無統(tǒng)計學意義；CHB重度外周血中Th17細胞含量高于輕中度，差異有統(tǒng)計學意義。

CHB輕中度及重度Tregs/Th17比值的差異比較共納入文獻3篇，輕中度92例、重度63例，各研究異質性較大(P=0.05、I2=68%)，選用隨機效應模型，結果(圖11)顯示：均數(shù)差(MD)的合并效應量等于-10.88，其95%CI分別為[-26.51、4.76]，合并效應量的檢驗Z=1.36，P=0.17。CHB重度 Tregs/Th17高于輕中度，差異無統(tǒng)計學意義。

圖9 CHB輕中度及重度外周血Tregs含量差異比較的森林圖

圖10 CHB輕中度及重度外周血Th17細胞含量差異比較的森林圖

圖11 CHB輕中度及重度Tregs/Th17差異比較的森林圖

2.5 發(fā)表偏倚評價 從研究的漏斗圖(未列出)基本對稱，可以看出無明顯發(fā)表偏倚。

3 討論

Tregs和Th17細胞是功能相互拮抗的一對免疫細胞[19-20]，為探討Tregs和Th17細胞在不同HBV感染狀態(tài)中的分布特征，揭示其對CHB發(fā)生、發(fā)展及轉歸的影響。本研究系統(tǒng)評價12篇文獻，納入研究均采用流式細胞術檢測外周血Tregs和Th17細胞，均為病例對照研究，采用NOS評價標準評價研究質量，整體評分為5～6分，提示研究質量不高。異質性原因分析可能與各研究標本采集時間及采集前是否用藥未標化，Tregs、Th17細胞檢測分選手段不同及流式細胞儀檢測靈敏度不一等因素有關。因此我們認為：為相關領域提供更加科學可靠證據(jù)，未來相關研究必須嚴謹、科學設計。

近年來，Tregs和Th17細胞在HBV感染發(fā)病機制中的作用越來越受到重視，相關研究較多，但是結論不盡一致，本研究以CHB為研究對象，比較其與其他HBV感染狀態(tài)外周血中Tregs和Th17細胞頻率的差異。結果表明CHB 外周血中Tregs和Th17均高于健康對照(P<0.000 01、P<0.000 01)，但是與健康對照相比Tregs/Th17比值降低(P=0.04)，表明CHB 外周血Tregs/Th17出現(xiàn)失衡，推測Tregs增加率不及Th17細胞，Th17細胞的升高可能是導致CHB肝臟炎癥的主要原因。

AsC外周血中Tregs含量高于CHB(P=0.57)，而Th17細胞含量低于CHB(P=0.25)，推測增高的Tregs在AsC體內發(fā)揮一定的免疫負調作用，使得HBV無法清除，病毒長期存在，機體表現(xiàn)為免疫耐受狀態(tài)，降低的Th17細胞抑制炎癥反應，故AsC無肝臟炎癥表現(xiàn)；CHB與之相反，表現(xiàn)為伴隨肝臟炎癥損傷的免疫清除狀態(tài)。但此差異均無統(tǒng)計學意義，具體機制有待進一步研究證實。

急性乙型肝炎多見于成年人感染HBV后的一個急性自限性的病理過程，而慢性乙型肝炎的預后及轉歸較急性乙肝更為復雜，機體的免疫功能及狀態(tài)是決定預后的主要因素。本次Meta分析結果表明：CHB外周血中Tregs含量高于AHB(P=0.002)，Th17細胞含量低于AHB(P=0.34)。推測可能機制為：AHB在HBV感染急性期以Th17細胞升高為主，優(yōu)勢表達的Th17細胞增強炎癥反應，導致免疫損傷及肝臟炎癥表現(xiàn)；而慢性乙肝體內以發(fā)揮免疫負調作用的Tregs為主導地位，升高的Tregs下調免疫應答，機體清除HBV的能力下降，導致感染的慢性化。

隨著CHB病情加重外周血中Tregs含量降低(P=0.43)，Th17細胞含量升高(P=0.02)，Tregs/Th17比值增大(P=0.17)。推測炎癥反應輕的CHB輕中度以抗炎細胞Tregs[21]增加為主，而炎癥反應重的CHB重度以促炎細胞Th17細胞[22]增加為主，在CHB進展的慢性進程中，外周血中Tregs/Th17比值可能呈現(xiàn)動態(tài)改變。

總之，Tregs及Th17細胞在不同HBV感染狀態(tài)表現(xiàn)不同的消長情況。Tregs在AsC和CHB輕中度中呈優(yōu)勢表達，發(fā)揮其免疫負調作用，抑制機體清除HBV的能力，導致感染慢性化；而Th17細胞在AHB及CHB重度中占主導地位，促進炎癥反應，肝臟炎癥損傷重。Tregs/Th17失衡可能與CHB發(fā)生、發(fā)展及轉歸密切相關，Tregs及Th17細胞有望成為CHB預后及轉歸的重要預警標志。但納入研究間異質性較大，確切機制尚有待高質量研究證實。

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