赤水丹霞來(lái)源抗白色念珠菌放線菌分離及進(jìn)化分析

王 苗，李園園，邵美云，羅顯濤，吳述銘，曾令榮，胡詠雄，岳昌武

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州省特色微生物資源及藥物開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

白色念珠菌是最常見的條件致病性真菌，可以引起皮膚念珠菌病、黏膜念珠菌病、內(nèi)臟及中樞神經(jīng)念珠菌病以及齲齒等多種疾病。近年來(lái)，隨著大劑量抗生素、激素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，以及器官移植術(shù)的開展，白色念珠菌引起的發(fā)病率漸趨增高，并可危及生命造成嚴(yán)重后果[1-4]，抗白色念珠菌藥物副作用及白色念珠菌耐藥問(wèn)題也給白色念珠菌病的防治帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[5-6]。本研究從赤水丹霞山土樣中，共篩選得到7株具有抗白色念珠菌活性的放線菌，其中6株為鏈霉菌，1株為地中海擬無(wú)枝酸菌，可為開發(fā)放線菌來(lái)源的抗白色念珠菌的藥物提供菌株來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣 土樣采自赤水丹霞山區(qū)地表10 ～20 cm土層，共300份，無(wú)菌樣品袋中常溫保存、運(yùn)輸。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基:ISP2固體培養(yǎng)基(葡萄糖4g，CaCO32g，麥芽抽提物10g，酵母抽提物4g，瓊脂粉15g，加去離子水定容到1L)；自來(lái)水酵母粉瓊脂培養(yǎng)基(酵母浸汁0.25g，K2HPO40.5g，瓊脂粉18g，加去離子水定容到1L)；高氏1號(hào)培養(yǎng)基(可溶性淀粉 20g，KNO31g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)e SO40.01g，瓊脂20g，加去離子水定容到1L)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：無(wú)鈣GYM固體培養(yǎng)基(葡萄糖4g，酵母抽提物4g，麥芽抽提物10g，瓊脂粉15g，加去離子水定容到1L)；含鈣GYM固體培養(yǎng)基(無(wú)鈣GYM+CaCO32g)；液體GYM培養(yǎng)基(葡萄糖4g，酵母抽提物4g，麥芽抽提物10g，1 mL微量元素預(yù)混液，加去離子水定容至1L)。以上培養(yǎng)基121 ℃，30 min，滅菌后備用。

1.1.3 測(cè)活菌 白色念珠菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.4 主要試劑 常規(guī)生化試劑均為分析純，購(gòu)自成都科龍化工；抗菌藥物購(gòu)自sigma公司；培養(yǎng)基成份購(gòu)自碧迪生物上海公司；酚/氯仿等DNA提取試劑購(gòu)自北京索萊寶公司；分子生物學(xué)試劑及酶類購(gòu)自大連寶生物公司。

1000×微量元素預(yù)混液(ZnSO4·7H2O 2g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2g，MnCl2·4H2O 2g，CuSO4·5H2O 2g，Na2B4O7·10H2O 2g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 2g 加去離子水800mL，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，并定容?L，常溫保存)。

抗菌藥物儲(chǔ)液：重鉻酸鉀50 mg/L，制霉菌素20 mg/L，萘啶酮酸20 mg/L，放線菌酮50 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 土壤樣品預(yù)處理：分別稱取2g樣品于無(wú)菌研缽中，加入CaCO30.2g，用無(wú)菌杵研磨成細(xì)粉，裝入50 mL無(wú)菌離心管中，28 ℃風(fēng)干2周，加入無(wú)菌水30 mL，在28 ℃搖床充分震蕩1.5 h，使其充分懸浮，55 ℃烘箱中靜置25 min，促使放線菌孢子萌發(fā)[7]。

菌株分離：將土壤預(yù)混液分別梯度稀釋為10-1、10-2和10-33個(gè)濃度梯度，振蕩混勻后分別及時(shí)吸取200 μL土樣懸濁液均勻涂布于含抗菌藥物(終濃度為重鉻酸鉀50 μg/L，制霉菌素20μg/L，萘啶酮酸20 μg/L，放線菌酮50 μg/L)的固體分離培養(yǎng)基表面，28 ℃靜置培養(yǎng)，隨時(shí)觀察培養(yǎng)基上菌落狀態(tài)，挑取放線菌形態(tài)的單菌落，進(jìn)一步純化培養(yǎng)[8]。

1.2.2 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 將篩選得到的活性菌株利用經(jīng)典溶菌酶/SDS結(jié)合酚/氯仿法提取基因組總DNA為模板，利用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通用引物序列27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R (5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')，PCR反應(yīng)條件為：50 μL反應(yīng)體系94 ℃，預(yù)變性5 min；PCR熱循環(huán)程序?yàn)?4 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由上海立菲生物公司完成。測(cè)序結(jié)果用Blast軟件[9]在線比對(duì)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用Blast程序[9]在線進(jìn)行序列相似性比對(duì)搜索，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得相似性較高且是有效描述的典型菌株的16S rRNA序列作為參比對(duì)象，采用MEGA 5.0軟件進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹[10-12]。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物抽提 用接種環(huán)挑取少許待測(cè)菌株孢子劃線接種于裝有100 mL 含鈣GYM固體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28 ℃靜置培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)物加入100 mL乙酸乙酯，150 rpm，振搖24 h充分萃取，靜置30 min，取上層乙酸乙酯層于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，38 ℃蒸干，加入1 mL甲醇重溶抽提物，用于活性測(cè)試。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物抗白色念珠菌活性測(cè)試 白色念珠菌接種GYM液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床200 rpm培養(yǎng)16～18 h。取2 mL新鮮菌液與200 mL即將凝固的無(wú)鈣GYM固體培養(yǎng)基混勻后迅速倒板，待培養(yǎng)基凝固后用無(wú)菌打孔器打直徑為5 mm孔，分別吸取50 μL前述抽提產(chǎn)物于孔中，測(cè)試平板置于28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。根據(jù)抑菌圈的有無(wú)和大小判定抗菌活性及強(qiáng)弱。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化分析 共采集300份土壤樣品，從中分離得到分離菌株600株，根據(jù)形態(tài)初步排重后選取其中28株放線菌形態(tài)的菌株進(jìn)行了16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化分析。其中有26株屬于鏈霉菌，2株屬于地中海擬無(wú)枝酸菌(見圖1)。

◆為標(biāo)準(zhǔn)菌株;▲為抗白色念珠菌。圖1 28株分離菌株系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2 部分赤水來(lái)源的抗白色念珠菌活性的鏈霉菌分離菌株菌落形態(tài)特征Streptomycessp.CSDX201，中間凸型，無(wú)橫隔，不斷裂，邊緣較薄，有明顯的光滑的肉粉色孢子，基內(nèi)菌絲淺粉色，氣生菌絲白色。Streptomycessp.CSDX1，中間凹型，邊緣較薄，產(chǎn)生氣生菌絲，孢子絲有橫隔，孢子淺黃色，多刺。Streptomycessp.CSDX258, 扁平型，為肉粉色，在培養(yǎng)基上形成具高度分支的基內(nèi)菌絲。Streptomycessp.CSDX26，饅頭型，較厚，孢子凸起，成白色狀態(tài)分布(見圖2)。

2.3 分離菌株抗菌活性 將獲得的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取濃縮物對(duì)臨床分離致病菌白色念珠菌進(jìn)行抗菌活性篩選，共發(fā)現(xiàn)7株分離菌株表現(xiàn)抗白色念珠菌活性(見圖3)，其中6株為鏈霉菌，占總數(shù)的22.22%，1株為地中海擬無(wú)枝酸菌，占總數(shù)的3.70%。其中Streptomycessp.CSDX258、Streptomycessp.CSDX26、Streptomycessp.CSDX201、Streptomycessp.CSDX225及Streptomycessp.CSDX097表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗白色念珠菌活性(抑菌圈直徑可達(dá)4～7cm)。Streptomycessp.CSDX1與Amycolatopsissp.CSDX220有較強(qiáng)的抗白色念珠菌活性(抑菌圈直徑可達(dá)1.5 ～3 cm)。

A：Streptomyces sp.CSDX201;B:Streptomyces sp.CSDX1;C:Streptomyces sp.CSDX258;D：Streptomyces sp.CSDX26。圖2 部分抗白色念珠菌鏈霉菌分離菌株菌落形態(tài)特征

A、B、C、D為抗白色念株菌測(cè)活圖。A1 ：Streptomyces sp.CSDX1；A2：Streptomyces sp.CSDX26；A3：Streptomyces sp.CSDX155；B1：Streptomyces sp.CSDX201；B2：Streptomyces sp.CSDX097；B3：Streptomyces sp.CSDX253；C1： Streptomyces sp.CSDX225；C2： Streptomyces sp.CSDX155；C3：甲醇對(duì)照；D1：Streptomyces sp.CSDX258；D2：Amycolatopsis sp.CSDX220；D3： Streptomyces sp.CSDX349。圖3 抗白色念珠菌抗菌活性測(cè)試

3 討論

為了開發(fā)新型的抗白色念珠菌藥物，很多研究者開始嘗試從蟲草、放線菌等藥用微生物中開發(fā)活性化合物，如李義勇等[13]從蟲草中找到多個(gè)抗白色念珠菌的活性部位，王玉梅等[14]從大連小平島和星海灣等海域來(lái)源的海洋鏈霉菌中分選得到抗白色念珠菌的L131鏈霉菌菌株，得到了初步純化的鹵化活性物質(zhì)，矯文策等[15]首次報(bào)道了大連海域來(lái)源的摩洛哥鏈霉菌近緣菌株抗白色念珠菌活性物質(zhì)的分離純化,這兩種活性物質(zhì)可能是不飽和酮酯類和不飽和苯衍生物。

我們通過(guò)選擇培養(yǎng)基從赤水丹霞山的土壤中初步形態(tài)分離，選取其中28株菌株進(jìn)行抗白色念珠菌活性測(cè)試，獲得7株抗白色念珠菌活性放線菌，分子分類結(jié)果表明其中6株為鏈霉菌，1株為地中海擬無(wú)枝酸菌。與鏈霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比對(duì)，Streptomycessp.CSDX51相似性為99%，Streptomycessp.CSDX 201，Streptomycessp.CSDX258，Streptomycessp.CSDX312，Streptomycessp.CSDX253，Streptomycessp.CSDX472，Streptomycessp.CSDX365，Streptomycessp.CSDX095，Streptomycessp.CSDX349，Streptomycessp.CSDX097，Streptomycessp.CSDX155相似性為98%。Streptomycessp.CSDX26，Streptomycessp.CSDX084，Streptomycessp.CSDX140，Streptomycessp.CSDX191，Streptomycessp.CSDX192，Streptomycessp.CSDX331，Streptomycessp.CSDX532，Streptomycessp.CSDX341，Streptomycessp.CSDX453，Streptomycessp.CSDX249，Streptomycessp.CSDX1相似性為97%，Streptomycessp.CSDX 152，Streptomycessp.CSDX 225相似性為96%。Streptomycessp.CSDX177相似性為95%，Streptomycessp.CSDX52相似性為94%，Streptomycessp.CSDX099相似性為93%。2株屬于地中海擬無(wú)枝酸菌，與地中海擬無(wú)枝酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比對(duì)，Amycolatopsissp.CSDX220相似性為84%，Amycolatopsissp.CSDX477相似性為82%(見圖1)。提示這里面可能存在著較新的分類單元。

研究結(jié)果表明貴州赤水山地區(qū)的土壤樣本中分離出來(lái)的鏈霉菌菌株，具有很好的抗白色念珠菌活性，下一步將對(duì)這些菌株進(jìn)行大量發(fā)酵，獲得更多的活性產(chǎn)物，同時(shí)把此次獲得的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，初步確定其抗白色念珠菌機(jī)制，可為開發(fā)研究抗白色念珠菌提供一定的資源基礎(chǔ)。

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