HMGB1聯(lián)合MSCs移植對急性心肌梗死大鼠心臟血管生成影響

唐一鋒，馬 帥，石 蓓

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells ，MSCs)是治療心血管疾病常用的種子細(xì)胞。除了具備干細(xì)胞共性外，還具備免疫耐受性，能被外源基因轉(zhuǎn)染等特征。MSCs移植治療能夠促進(jìn)梗死交界區(qū)域微血管生成，改善心肌梗死后的心功能[1]。高遷移率族蛋白1(High Mobility Group Box-1，HMGB1)是全身和局部炎癥的一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)物，HMGB1可作用于人心臟成纖維細(xì)胞(cFbs)表面的RAGE受體促進(jìn)生長因子如VEGF等表達(dá)增加[2]。實驗擬在建立大鼠急性心肌梗死模型基礎(chǔ)上，通過HMGB1表達(dá)，同時聯(lián)合移植MSCs，觀察梗死心肌局部促進(jìn)血管生成因子表達(dá)變化，局部新生血管密度變化情況，證實增加外源性HMGB1是否能夠進(jìn)一步改善局部微環(huán)境，促進(jìn)干細(xì)胞的存活及血管生成效應(yīng)。以期為目前存在的移植歸巢至梗死區(qū)干細(xì)胞數(shù)量少且快速凋亡等問題提供解決方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體重為100～150g的SD大鼠細(xì)胞培養(yǎng)用；96只2～3月齡、體重為200～250g的SD雄性大鼠動物模型，分模型組、MSCs移植組、HMGB1注射組、HMGB1注射+MSCs移植組(n=24只)。由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，經(jīng)檢疫符合國家實驗動物標(biāo)準(zhǔn)，證書號：SCXK(渝)2012-0005。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MSCs體外培養(yǎng)、鑒定 取100～150g 3周齡SD大鼠，無菌條件下分離雙側(cè)股骨和脛骨。用貼壁離心法[5]取得原代細(xì)胞。后進(jìn)行細(xì)胞傳代。實驗用第3～4代細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀及APC anti-ratCD29、PE anti-ratCD45、PE anti-ratCD90抗體檢測鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物。

1.2.2 細(xì)胞免疫熒光檢測MSCs是否表達(dá)HMGB1的受體TLR4和RAGE。

1.2.3 HMGB1干預(yù)MSCs后VEGF分泌水平的檢測(酶聯(lián)免疫吸附測定法，ELISA) 取培養(yǎng)第3代MSCs細(xì)胞接種于24孔板，加入含HMGB1的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)HMGB1的濃度分別為0、12.5、25、50、100、200、400、800ng/mL，以0ng/mL HMGB1為對照分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24和48h后，檢測培養(yǎng)基上清液中VEGF的分泌水平。

1.2.4 大鼠心肌梗死模型的建立10%水合氯醛按3mL/kg體重腹腔麻醉。小動物呼吸機(jī)輔助正壓通氣，呼吸機(jī)潮氣量為3mL/100g體重，呼吸頻率為100次/min，呼吸比為1∶3。于胸骨左緣3～4肋間打開胸腔。以肺動脈圓錐和左心耳根部交叉點下方約2mm處作為縫扎點結(jié)扎左冠脈前降支，按照造模成功后心肌內(nèi)注射1.0 ×106個MSCs、結(jié)扎冠脈左前降支前后腹膜內(nèi)各注射1次100ng HMGB1(10μg/mL)、MSCs移植聯(lián)合HMGB1注射的給藥方法分別處理，關(guān)胸消毒完畢后將大鼠放入單獨清潔鼠籠，置于26℃左右的恒溫動物房普食飼養(yǎng)。

1.2.5 ELISA法檢測術(shù)后3、7、28d血清VEGF濃度水平根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測新生微血管取出28d處死各組大鼠石蠟切片，行免疫組織化學(xué)檢測CD31陽性細(xì)胞，并以此計數(shù)微血管。一抗：兔抗大鼠CD31(1∶50；1∶100；1∶200), 二抗：生物素化羊抗兔IgG, 根據(jù)Weidner微血管方法計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 MSCs的培養(yǎng)、鑒定 原代培養(yǎng)過程中觀察可見密集圓形細(xì)胞，含各種骨髓原始細(xì)胞。第3天換液，可見部分細(xì)胞貼壁，可見有少量細(xì)胞由圓形變?yōu)槎嘟切位蚨贪魻睿始錉罘植?；?d左右，全部細(xì)胞均為梭形，且呈渦流狀，排列細(xì)胞部分融合，可鋪滿瓶底達(dá)80%～90%。細(xì)胞傳至第3代時，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)逐漸均勻生長成為梭形，形態(tài)趨于一致，且分布均勻。細(xì)胞的增殖速度較原代明顯增快，當(dāng)細(xì)胞傳代至4代以后，細(xì)胞生長趨于緩慢，形態(tài)有衰老趨勢(見圖1)。

A：原代第1天細(xì)胞(×200)；B：原代培養(yǎng)5d MSC(×40)；C：第2代培養(yǎng)10d MSC(×100)；D：第3代培養(yǎng)25d MSC(×200)。圖1 MSCs培養(yǎng)結(jié)果

MSCs培養(yǎng)至第3～4代，選取生長狀態(tài)較好的細(xì)胞(6.0 ×106)，用流式細(xì)胞儀做細(xì)胞表面標(biāo)記的鑒定，結(jié)果顯示：CD45、CD29、CD90的陽性率分別是2.7%、99.1%、91.6%,提示培養(yǎng)細(xì)胞為MSCs(見圖2)。

2.2 MSCs內(nèi)HMGB1受體表達(dá)測定 取狀態(tài)良好的P3MSCs接種至6孔板中，細(xì)胞免疫熒光檢測，結(jié)果TLR4主要表達(dá)于MSCs胞漿內(nèi)，而RAGE主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)(見圖3)。

流式細(xì)胞儀分析顯示多數(shù)MSCs細(xì)胞表達(dá)CD29和CD90，極少數(shù)細(xì)胞表達(dá)CD45。圖2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定MSCs

圖A、B、C箭頭所指綠色熒光為TLR4；圖D、E、F箭頭所指綠色熒光為RAGE受體；PAPI復(fù)染細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光。圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測MSCs內(nèi)HMGB1受體的表達(dá)

2.3 HMGB1干預(yù)MSCs后對VEGF分泌水平的影響 ELISA檢測不同濃度梯度HMGB1干預(yù)的MSCs后不同時間點(12、24、48h)培養(yǎng)基上清中VEGF的分泌，結(jié)果(表1，圖4)顯示：同一時間點,其中12.5至200ng/mL HMGB1干預(yù)MSCs后，VEGF的分泌量較對照組顯著增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05或P<0.01)，在25ng/mL時達(dá)高峰，而隨著HMGB1濃度增大，當(dāng)濃度為400、800ng/mL時，對其分泌有抑制作用，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。

濃度12hVEGF 濃度24h VEGF 濃度48h VEGF濃度0255.85±6.89564.69±19.92757.92±21.5712.5391.63±6.8**713.68±12.31**849.21±25.77**25408.88±10.67**772.45±15.47**886.07±27.31**50354.94±13.98**728.98±19.23**848.28±19.73**100305.60±8.76**668.11±12.04**790.65±12.47**200295.98±14.82*570.14±15.32*778.17±23.99*400233.37±9.57*526.87±17,35*734.01±19.29*800208.86±9.99*487.76±13,45*716.10±18.98*

**P﹤0.01對比0ng/mL HMGB1，*P﹤0.05對比0ng/mL HMGB1。

圖4 HMGB1干預(yù)MSCs后不同時間點VEGF的分泌水平

2.4 大鼠急性心肌梗死模型評估 麻醉生效后迅速打開胸腔剝離心包后觀察大鼠心肌紅潤，搏動有力(見圖5A)，心率300bmp/min左右(見圖6A)，結(jié)扎后數(shù)秒鐘后因靜脈回流障礙，可見結(jié)扎點平面下心肌組織顏色迅速加深，轉(zhuǎn)為深褐色，隨著左前降支缺血隨時間逐漸加重，結(jié)扎數(shù)分鐘后可以發(fā)現(xiàn)左心室壁運動度顯著下降，自心尖部至結(jié)扎點平面以下心肌顏色逐漸轉(zhuǎn)為蒼白，非梗死區(qū)則顏色紅潤，分界清楚(見圖5B)，II導(dǎo)聯(lián)心電圖提示QRS波后J點明顯抬高，呈典型弓背樣抬高改變(見圖6B)，提示心肌梗死模型建立成功。

A：心臟前降支結(jié)扎前；B：心臟前降支結(jié)扎后。圖5 建立大鼠心肌梗死模型

A：大鼠正常心電圖 ；B：心臟前降支結(jié)扎后大鼠心電圖。圖6 大鼠心肌梗死前后心電圖

2.5 血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平變化 結(jié)果顯示，模型組、MSCs移植組、HMGB1注射組、HMGB1注射+MSCs移植組血清濃度則在術(shù)后3、7 d均呈升高趨勢，第7天血清VEGF濃度水平達(dá)峰值，28 d血清VEGF濃度水平降至接近正常對照組水平。其中，第3、7天時間點HMGB1注射+MSCs移植組VEGF水平顯著高于MSCs移植組、HMGB1注射組及模型組(P<0.05)；第28天各組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2、圖7)。

組別3 d7 d28 d模型對照組604.48±27.54*639.15±27.34*514.59±23.78**MSCs 移植組705.39±25.58*786.82±21.74*524.34±31.32**HMGB1注射組678.67±23.03*722.16±26.21*540.26±25.57**HMGB1注射+MSCs移植組728.95±24.27890.04±22.67528.35±30.04

A：模型對照組；B：MSCs移植組；C：HMGBI注射組；D：HMGBI注射+MSCs移植組；與HMGB1注射+MSCs移植組相比，3d、7d時間點，*P<0.05；28d時間點，**P>0.05。 圖7 各組不同時間點VEGF水平變化

2.6 心肌梗死區(qū)新生血管檢測 結(jié)果顯示，HMGB1注射+MSCs移植組梗死區(qū)及梗死周圍區(qū)新生微血管密度(18.95±1.80)比較模型對照組 (6.38±0.25)、HMGB1注射組(9.16±1.10)、MSCs移植組(12.54±1.50)增加，(P<0.05)(見圖8、圖9)。

A：模型組(×200)；B：MSCs移植組(×200)；C：HMGB1注射組(×200)；D：HMGB1注射+MSCs移植組(×200)。 圖8 各組新生微血管密度心肌組織免疫組織化學(xué)CD31檢測

A:模型對照組;B:MSCs移植組;C:HMGB1注射組;D:HMGB1注射+MSCs移植組,各組與HMGB1注射+MSCs移植組相比P<0.05。 圖9 新生微血管密度心肌組織免疫組織化學(xué)CD31定量比較

3 討論

3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死 本實驗仍然采用傳統(tǒng)模式MSCs培養(yǎng)方法，細(xì)胞增殖分化穩(wěn)定，細(xì)胞免疫表型特征維持較好。根據(jù)目前國內(nèi)外根據(jù)MSCs表面抗原特征的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[3]，本實驗中培養(yǎng)出的MSC通過流式細(xì)胞鑒定，大部分細(xì)胞表達(dá)CD29和CD90，極少量細(xì)胞表達(dá)CD45，提示培養(yǎng)細(xì)胞為高純度的MSCs。研究表明，MSCs可能通過以下幾個方面參與梗死心臟的組織修復(fù)：①直接分化為心肌樣細(xì)胞。體內(nèi)外研究表明[4]，在激活或移植的MSCs中表達(dá)多種心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物，其表型及活性與發(fā)育中的胎兒心肌細(xì)胞相同。②血管分化、細(xì)胞融合作用。在缺血缺氧、炎癥反應(yīng)的微環(huán)境中，生長因子和細(xì)胞因子刺激下，MSCs能夠逐步獲得內(nèi)皮細(xì)胞表型，在細(xì)胞外基質(zhì)中形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)，并表達(dá)和分泌血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子[5]。③MSCs旁分泌作用。MSCs可以分泌多種生長因子和細(xì)胞因子、血管生成素、趨化因子等[6]。本實驗中MSCs移植組與模型對照組相比，梗死交界區(qū)可見新生血管數(shù)量明顯增多，ELISA法檢測VEGF濃度水平增高；結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果[7]，MSCs移植入兔心肌梗死模型后能通過增加促修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子水平，促進(jìn)梗死區(qū)心肌毛細(xì)血管生長而改善心功能。充分說明了MSCs在急性心肌梗死后梗死區(qū)及梗死交界區(qū)發(fā)揮促血管分化、改善心室重塑的積極作用。

3.2 大鼠心肌梗死模型的影響因素及評估 本實驗采用經(jīng)頸氣管切開插管[8]、冠狀動脈結(jié)扎法，以肺動脈圓錐、左心耳根部交界處沿左冠狀靜脈下行約2mm為冠狀動脈結(jié)扎點[9]，結(jié)扎深度約1～1.5 mm。以結(jié)扎心肌顏色由紅潤轉(zhuǎn)為蒼白、心室壁運動度下降證明低灌注及組織壞死的發(fā)生。II導(dǎo)聯(lián)心電圖提示QRS波后J點明顯抬高>0.2mV，呈弓背樣抬高改變，R波振幅降低，提示模型建立成功[10]。以此作為心肌梗死模型研判標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 HMGB1對MSCs旁分泌的影響 有研究證實：MSCs有HMGB1受體TLR4和RAGEmRNA的表達(dá)[11]，HMGB1的受體存在MSCs的什么具體部位還不清楚。本實驗利用免疫細(xì)胞熒光檢測證實TLR4存在于MSCs胞漿中；而RAGE存在于MSCs的細(xì)胞核里。

組織損傷和(或)炎癥時釋放較高濃度的HMGB1可能誘導(dǎo)MSCs的趨化，從而參與干細(xì)胞的修復(fù)[3]。Meng等證明HMGB1可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移，其可能的機(jī)制是TLR4在HMGB1信號通路中起作用，TLR4及其配體可調(diào)節(jié)MSCs的增殖和分化遷移，并影響MSCs多向潛能的維持。體外實驗結(jié)果證實：HMGB1可促進(jìn)MSCs的旁分泌，且呈雙向調(diào)節(jié)，濃度為12.5ng/mL至200ng/mL的HMGB1可以促進(jìn)MSCs分泌VEGF，且25～50ng/mL時達(dá)峰值，相反，隨著濃度的增大，400～800ng/mL時抑制MSCs分泌VEGF。其中VEGF隨時間的延長而增多。本實驗證實了MSCs本身具備較強(qiáng)的內(nèi)分泌功能，可分泌VEGF等細(xì)胞生長因子；同時證實了一定濃度范圍內(nèi)的HMGB1可以促進(jìn)MSCs旁分泌作用。

體內(nèi)實驗中HMGB1注射+MSCs移植組梗死區(qū)免疫組化法檢測的新生血管密度及ELISA法檢測的血清VEGF濃度水平較模型組、MSCs移植組及HMGB1注射組均增加。在堿誘導(dǎo)角膜新生血管(CNV)的鼠模型中, HMGB1受體TLR4缺乏導(dǎo)致促血管生成因子生成減少，對受傷角膜局部使用HMGB1能通過增加巨噬細(xì)胞而促進(jìn)角膜新生血管形成。結(jié)果表明,HMGB1的釋放啟動TLR4的依賴性應(yīng)答有助于新血管形成[12]。

HMGB1聯(lián)合MSCs移植治療對比單獨mscs移植、HMGB1注射治療對梗死心肌局部VEGF的表達(dá)增加，可能對大鼠急性心肌梗死后局部新生血管生成、心功能改善等更為有益。然而MSCs移植后，TLRs通路如何調(diào)節(jié)MSCs趨化作用和旁分泌誘導(dǎo)作用,以及是否能長時間維持等機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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