白葉蒿提取物抗菌活性及抗菌增效作用

李維宏，彭 偉，任傳亮，李 斌

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 生殖健康與不孕癥?？?， 重慶 400016；2.第三軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)系 藥理學(xué)教研室，重慶 400038)

白葉蒿 Artemisia leucophylla (Turcz. Ex Bess.) Clarke 為菊科蒿屬多年生草本植物，主要生長于我國四川，新疆，西藏，甘肅，寧夏等海拔3000～4000米的地區(qū)，其全草部分具有驅(qū)寒、止血、消炎等作用[1-2]，白葉蒿揮發(fā)油具有鎮(zhèn)咳、祛痰和抗真菌作用[3]，但目前對于白葉蒿的抗細(xì)菌活性和是否具有抗菌增敏活性未見研究報道。本研究對白葉蒿全草的乙醇提取物及其極性部位進(jìn)行了抗菌和抗菌增敏活性評價，將為白葉蒿資源的深入開發(fā)利用，從中尋找新的具有抗菌活性的物質(zhì)或抗菌增敏劑奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實驗用金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌、腸球菌臨床分離株均由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科提供。為保證細(xì)菌實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性，實驗中采用國際標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC35218和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控對照菌株。

1.1.2 藥物 注射用氨芐西林鈉(華北制藥股份有限公司)、舒氨西林 (注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉，深圳市海濱制藥有限公司)、注射用苯唑西林鈉(西南藥業(yè)股份有限公司)、注射用頭孢呋辛鈉(深圳致君制藥股份有限公司)均4°C保存，使用前用無菌LB培養(yǎng)液稀釋成所需母液濃度。白葉蒿藥材采自四川茂縣，經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)生藥學(xué)教研室鑒定為菊科白葉蒿A. leucophylla (Turcz. Ex Bess.) Clarke全草。各分離部分采用DMSO溶解，使用前用無菌LB培養(yǎng)液稀釋成所需母液濃度。

1.2 方法

1.2.1 藥物提取與分離 白葉蒿全草藥材自然干燥后粉碎，200目篩過濾后，8倍量體積70%乙醇回流提取3次，每次2 h，減壓干燥后得到總提取物。總提取物以水混懸，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取并回收，依次得到白葉蒿石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水部分。

1.2.2 白葉蒿提取物各部分最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)的測定 采用二倍微孔稀釋法[4]。 調(diào)整細(xì)菌濃度為105CFU/mL，接種于96孔無菌培養(yǎng)板內(nèi)，所有待測藥物均以無菌LB培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，抗生素溶液均為無色透明液體，白葉蒿提取物溶解后呈淡黃色透明溶液。將4種β-內(nèi)酰胺類抗生素分別氨芐西林、苯唑西林、舒氨西林、頭胞呋辛鈉及白葉蒿提取物各部分分別加入至含細(xì)菌培養(yǎng)孔內(nèi)，使最高終濃度達(dá)到4096 μg/mL，然后依次倍比稀釋，使每孔中藥物的最終濃度依次2倍減小(4096、2048、1024～1μg/mL)。同時設(shè)立陽性對照(菌液)、陰性對照(無菌LB培養(yǎng)液)。每組3孔，每孔100 μL，置37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后，根據(jù)24 h后培養(yǎng)孔內(nèi)的液體清亮程度判斷每種藥物的MIC值，MIC值為觀察到培養(yǎng)孔內(nèi)液體清亮?xí)r的最低藥物濃度。質(zhì)控根據(jù)陰性對照和陽性對照進(jìn)行判斷，陰性對照孔應(yīng)為清亮，如陰性對照孔渾濁表面實驗過程發(fā)生污染；陽性對照孔應(yīng)為混濁，如陽性對照孔清亮則表明細(xì)菌培養(yǎng)中細(xì)菌活力出現(xiàn)問題。

1.2.3 白葉蒿正丁醇部分與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用時對不同細(xì)菌MIC的影響 采用棋盤式微孔稀釋法[5]，調(diào)整細(xì)菌濃度為105CFU/mL，接種于96孔無菌培養(yǎng)板內(nèi)，加入不同的抗生素(氨芐西林：簡稱“AMP”； 苯唑西林：簡稱“OXA”；舒氨西林：簡稱“SAM”；頭孢呋辛鈉：簡稱“CEF”)，依次倍比稀釋，使其終濃度自2048 μg/mL至2 μg/mL。再依次加入相應(yīng)濃度的白葉蒿正丁醇部分(BUE)，使培養(yǎng)體系中的BUE濃度范圍為1024 μg/mL至32 μg/mL；置37℃培養(yǎng)箱孵育24 h，記錄BUE和抗生素聯(lián)合使用時藥物對細(xì)菌的MIC，并計算部分抑菌濃度指數(shù)(Fractional inhibitory concentration index, FICI)。FICI計算公式如下。判斷標(biāo)準(zhǔn)：FICI ≤0.5，協(xié)同作用；0.5～ 4.0，無關(guān)作用；> 4.0，拮抗作用[6]。

1.2.4 白葉蒿正丁醇部分與1/2MIC濃度的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)菌生長的影響 參照文獻(xiàn)方法[7]，調(diào)整細(xì)菌濃度為106CFU/mL，測定菌液OD600值為0.002 (1 OD=5×108CFU/mL)，參照單獨MIC實驗結(jié)果，分別單獨加入終濃度為16 μg/mL或 的32 μg/mL BUE(1/4 MIC)或低于MIC濃度的抗菌藥物，以及同時加BUE和抗菌藥物后，置于37°C恒溫?fù)u床150 rpm振搖24 h，分別測定1、3、5、7、9、12、18、24 h時菌液的OD600值，并繪制時間-細(xì)菌濃度曲線。

1.2.5 結(jié)果判斷 藥物對細(xì)菌的MIC為24h后抑制細(xì)菌肉眼可見生長的最低藥物濃度；統(tǒng)計BUE單獨及與抗菌藥物聯(lián)合使用時不同時相點時細(xì)菌計數(shù)情況。

2 結(jié)果

2.1 白葉蒿提取物和不同抗菌藥物單獨使用時對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌、腸球菌臨床分離株的MIC 實驗結(jié)果顯示，白葉蒿總提物及各極性回收部分對5種臨床分離株細(xì)菌均顯示出一定的抗菌活性，其中乙酸乙酯和正丁醇部分顯示出較強的抗菌活性，正丁醇部分對大腸埃希菌的MIC為64 μg/mL，對肺炎桿菌的MIC為64 μg/mL，對金黃色葡萄球菌和腸球菌的MIC為128 μg/mL；乙酸乙酯部位對大腸埃希菌和肺炎桿菌的MIC為128 μg/mL，對金黃色葡萄球菌和腸球菌的MIC為256 μg/mL，正丁醇部分和乙酸乙酯部分對綠膿桿菌的MIC分別為256 μg/mL和512 μg/mL。

雖然上述白葉蒿提取物對5種細(xì)菌的MIC值均大于64 μg/mL，未呈現(xiàn)出非常強的抗菌活性，但5種β內(nèi)酰胺類抗生素對上述5種細(xì)菌的MIC也大于16 μg/mL，根據(jù)2013美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的判定標(biāo)準(zhǔn)，腸桿菌科對頭孢呋辛的MIC≥4，葡萄球菌屬對苯唑西林的MIC≥4，腸球菌屬及綠膿桿菌對氨芐西林的MIC≥8均判斷為耐藥，上述臨床分離株細(xì)菌均為耐β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥菌株 (見表1)。

表1白葉蒿提取物和抗生素對5種細(xì)菌的MIC值(μg/mL)

MIC金黃色葡萄球菌大腸埃希菌肺炎桿菌腸球菌綠膿桿菌總提物102425651210242048石油醚部位5122562565121024乙酸乙酯部位256128128256512正丁醇部位1286464128256水部位51212851210242048氨芐西林5125122565121024苯唑西林512256256512256舒氨西林163264128512頭胞呋辛鈉16163264128

2.2 白葉蒿正丁醇部分(BUE)與不同抗菌藥物聯(lián)合使用后對5種細(xì)菌的MIC值的影響 結(jié)果顯示，采用1/4 MIC的白葉蒿正丁醇部分(BUE)與不同β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用時對幾種臨床分離株細(xì)菌均呈現(xiàn)出一定的抗菌增敏作用，可使細(xì)菌對幾種β內(nèi)酰胺類抗生素的MIC降低4～16倍，其中BUE與舒氨西林或頭孢呋辛鈉聯(lián)合使用時對金黃色葡萄球菌的協(xié)同作用最強，32 μg/mL BUE(1/4 MIC)即可使舒氨西林、頭孢呋辛鈉的MIC降低至原先的1/16 (1 μg/mL)，其FICI為0.3125；16 μg/mL BUE(1/4 MIC)可使頭孢呋辛鈉對大腸埃希菌的MIC降低至單獨使用時的1/16 (1 μg/mL)，其FICI為0.3125；還可使其他幾種細(xì)菌對抗生素的MIC明顯降低，F(xiàn)IC均≤0.5，表明BUE與β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用時均可呈現(xiàn)出一定的抗菌增敏作用 (見表 2)。

表2白葉蒿提取物正丁醇部分與抗菌藥物聯(lián)合使用后對5種細(xì)菌MIC的影響

細(xì)菌種類氨芐西林+BUE苯唑西林+BUE舒氨西林+BUE頭胞呋辛鈉+BUE金黃色葡萄球菌MIC1/8 MIC+32 μg/mLBUE1/8 MIC+32 μg/mLBUE1/16 MIC+32 μg/mLBUE1/16 MIC+32 μg/mLBUEFICI0.3750.3750.31250.3125大腸埃希菌MIC1/4 MIC+16 μg/mLBUE1/8 MIC+16 μg/mLBUE1/8 MIC+16 μg/mLBUE1/16 MIC+16 μg/mLBUEFICI0.50.3750.3750.3125肺炎桿菌MIC1/4 MIC+16 μg/mLBUE1/4 MIC+16 μg/mLBUE1/4 MIC+16 μg/mLBUE1/4 MIC+16 μg/mLBUEFICI0.50.50.50.5腸球菌MIC1/4 MIC+32 μg/mLBUE1/2 MIC+32 μg/mLBUE1/4 MIC+32 μg/mLBUE1/8 MIC+32 μg/mLBUEFICI0. 50.750.50.375綠膿桿菌MIC1/2 MIC+64 μg/mLBUE1/4 MIC+64 μg/mLBUE1/4 MIC+64 μg/mLBUE1/4 MIC+64 μg/mLBUEFICI0.750.50.50.5

2.3 白葉蒿正丁醇部分與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)菌生長的動態(tài)影響 結(jié)果顯示，在金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎桿菌、腸球菌、綠膿桿菌5株細(xì)菌培養(yǎng)體系中加入低于MIC濃度的白葉蒿正丁醇部分(BUE)或/和抗菌藥物，對照組(Broth組)細(xì)菌均生長迅速；單純BUE組生長速度均較Broth組減慢，24 h時細(xì)菌數(shù)量較Broth組一定程度降低；低于MIC濃度的單純抗菌藥物處理組細(xì)菌生長速度同樣較Broth組減慢，但24 h才能基本達(dá)到Broth組水平；而BUE與抗菌藥物聯(lián)合使用后5株細(xì)菌生長受到明顯抑制，細(xì)菌生長速度較單純抗菌藥物處理組均明顯減慢，提示BUE和抗菌藥物聯(lián)合使用后能明顯增強抗菌藥物對細(xì)菌生長的抑制作用(見圖1～5)。

**P<0.01，與單獨CEF組比較；## P<0.01，與單獨SAM組比較；△△P<0.01，與單獨AMP組比較；※※P<0.01，與單獨OXA組比較；n=3。圖1 BUE協(xié)同抗菌藥物對金黃色葡萄球菌生長的動態(tài)影響

**P<0.01，與單獨CEF組比較；## P<0.01，與單獨SAM組比較；△△P<0.01，與單獨AMP組比較；※※ P<0.01，與單獨OXA組比較；n=3。圖2 BUE協(xié)同抗菌藥物對大腸埃希菌生長的動態(tài)影響

** P<0.01，與單獨CEF組比較；## P<0.01，與單獨SAM組比較；△△P<0.01，與單獨AMP組比較；※※ P<0.01，與單獨OXA組比較；n=3。圖3 BUE協(xié)同抗菌藥物對肺炎桿菌生長的動態(tài)影響

**P<0.01，與單獨CEF組比較；## P<0.01，與單獨SAM組比較；△△ P<0.01，與單獨AMP組比較；※※P<0.01，與單獨OXA組比較；n=3。圖4 BUE協(xié)同抗菌藥物對腸球菌生長的動態(tài)影響

**P<0.01，與單獨CEF組比較；## P<0.01，與單獨SAM組比較；△△P<0.01，與單獨AMP組比較；※※ P<0.01，與單獨OXA組比較；n=3。圖5 BUE協(xié)同抗菌藥物對綠膿桿菌生長的動態(tài)影響

3 討論

白葉蒿別名白毛蒿(東北植物檢索表)，苦蒿(四川)，野艾蒿(河北)，茭蒿(內(nèi)蒙古)，朝鮮艾(吉林)，白蒿(俗稱)，為多年生草本植物，可作“家艾”的代用品全草藥用，有溫氣血、逐寒濕、止血、消炎的作用[1-2]。目前關(guān)于白葉蒿化學(xué)成分及藥理學(xué)作用鮮有文獻(xiàn)報道，僅有研究發(fā)現(xiàn)白葉蒿脂肪酸成分具有降血脂功能[8]；白葉蒿揮發(fā)油可能具有鎮(zhèn)咳、祛痰和抗真菌作用[3]，目前尚無其抗菌和抗菌增敏作用的研究。

我們通過對采自四川茂縣的白葉蒿全草進(jìn)行了分離純化，已從白葉蒿中分離得到11個化合物，所有化合物均為首次從該植物中分離得到[9]。由于分離得到的化合物成分含量較少，無法進(jìn)行單體化合物系統(tǒng)的活性評價，但對白葉蒿總提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位進(jìn)行體外抗菌評價實驗后顯示，總提取物、乙酸乙酯部位和正丁醇部位對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎桿菌、腸球菌、綠膿桿菌5種臨床分離株的細(xì)菌均顯示一定的抗菌活性，其中以正丁醇部分的抗菌作用最強，但對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等5種臨床分離株細(xì)菌的MIC值均≥64 μg/mL，鑒于上述臨床分離株細(xì)菌均為耐β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥菌株，因此該抗菌作用活性強度仍具有一定的開發(fā)研究價值。更有意義的是，我們將低于MIC濃度的白葉蒿正丁醇部分與5種β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用，棋盤法MIC實驗結(jié)果顯示該正丁醇部分可明顯降低幾種β內(nèi)酰胺類抗生素對5種細(xì)菌的MIC值，其中正丁醇部分與舒氨西林或頭孢呋辛鈉聯(lián)合使用時對金黃色葡萄球菌的FICI為0.3125；正丁醇部分與頭孢呋辛鈉聯(lián)合使用時對大腸埃希菌的FICI也為0.3125；正丁醇部分與其他幾種β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用時對肝炎桿菌、腸球菌、綠膿桿菌的FICI也均≤0.5。結(jié)合部分抑菌濃度指數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)：FICI ≤0.5，協(xié)同作用；0.5 ～ 4.0，無關(guān)作用；> 4.0，拮抗作用[6]，上述結(jié)果表明白葉蒿正丁醇部分與β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用時可呈現(xiàn)出一定的抗菌增敏作用。由于藥物對細(xì)菌的MIC實驗是通過肉眼觀察細(xì)菌培養(yǎng)孔內(nèi)清亮程度來判斷結(jié)果，且只能觀察到24 h時細(xì)菌生長的受抑制情況，不能觀察到準(zhǔn)確的細(xì)菌數(shù)量的動態(tài)變化，而我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，正丁醇部分與抗菌藥物聯(lián)合使用后細(xì)菌培養(yǎng)孔內(nèi)菌液濃度較未聯(lián)合組明顯減少。因此，我們進(jìn)一步采用動態(tài)生長曲線法觀察了正丁醇部分與幾種抗菌藥物聯(lián)合使用后不同時間點時細(xì)菌生長的動態(tài)情況。結(jié)果證實，白葉蒿正丁醇部分單獨使用時即可一定程度減慢細(xì)菌的生長速度，與抗菌藥物聯(lián)合使用后可以明顯提高抗菌藥物的抗菌效力，該結(jié)果同棋盤式稀釋法結(jié)果一致。綜合上述結(jié)果，我們認(rèn)為白葉蒿不僅具有一定抗菌作用，還可對β內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生抗菌增效作用，尤其是正丁醇部分有作為一種新型的抗菌增敏劑進(jìn)一步開發(fā)利用的潛能。

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