橡膠樹多倍體誘導(dǎo)機(jī)制和途徑

張?jiān)丛础】迪蜿枴±罹S國(guó)

摘 要 多倍體育種作為橡膠樹育種的重要手段，曾引起育種工作者的廣泛關(guān)注并進(jìn)行了大量研究。本文從獲得橡膠樹多倍體的機(jī)制和途徑方面總結(jié)前人的研究成果；討論橡膠樹多倍體育種面臨的問題；提出橡膠樹多倍體育種的研究方向，為橡膠樹多倍體育種工作提供理論幫助。

關(guān)鍵詞 橡膠樹 ；多倍體 ；機(jī)制 ；途徑

分類號(hào) S335.1

橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）在植物分類學(xué)上屬于大戟科（Euphorbiaceae）橡膠樹屬（Hevea），被認(rèn)為是一種雙二倍體（2n=4x=36）植物[1]。橡膠樹的次生代謝物質(zhì)橡膠是制造輪胎等制品的重要原料，通過選育橡膠樹新品種提高橡膠產(chǎn)量的重要性不言而喻。然而，當(dāng)前橡膠樹育種由于種種原因[2-3]而出現(xiàn)了停滯不前的局面。在云南廣泛種植的橡膠樹優(yōu)良品種云研77-2和77-4被證明為三倍體[4]，表明多倍體橡膠樹品種具有大幅度提高產(chǎn)量和抗性的潛力，為打破橡膠樹育種的困境提供了一種新的思路。

多倍體育種作為林木育種的一種重要理論和方法，自20世紀(jì)70年代在橡膠樹育種中有過短暫熱潮后，一直處于低谷。本文通過討論獲得橡膠樹多倍體的機(jī)制和途徑，總結(jié)前人在橡膠樹多倍體育種方面的研究成果，探討橡膠樹多倍體育種面臨的問題和解決途徑，希望能夠引起橡膠樹育種工作者對(duì)多倍體育種這一領(lǐng)域的重新關(guān)注，開辟橡膠樹多倍體育種的新天地。

1 植物多倍體的特點(diǎn)

多倍體是指具有三套或三套以上完整染色體組的生物個(gè)體。多倍體植物存在廣泛。據(jù)估計(jì)，大約30%～80%植物種中存在多倍體[5]。多倍體化在基因表達(dá)和發(fā)育過程中具有重要影響，可直接改變物種的形態(tài)、繁殖系統(tǒng)和生態(tài)適應(yīng)性，是形成新物種的重要途徑之一，是推動(dòng)進(jìn)化的重要力量[6]。

多倍體植物具有細(xì)胞體積大、個(gè)體高大、葉片寬厚、分枝數(shù)少、花果少、種子大、生長(zhǎng)速度快、代謝速率高、次生代謝物質(zhì)產(chǎn)量高、抗逆性和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[7-10]。在以獲得生物產(chǎn)量為目標(biāo)的生產(chǎn)應(yīng)用中具有二倍體無可比擬的優(yōu)勢(shì)。多倍體育種具有產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)、獲得基因冗余、打破自交不親和壁壘、改變生殖系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，是植物遺傳育種的重要手段之一[11]。

多倍體有諸多的優(yōu)點(diǎn)，但是多倍化導(dǎo)致的細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變、有絲分裂和減數(shù)分裂不穩(wěn)定、易產(chǎn)生非整倍體、育性降低、改變基因表達(dá)調(diào)控、表觀遺傳不穩(wěn)定等[11]，同樣會(huì)影響到多倍體的利用。

2 植物產(chǎn)生多倍體的機(jī)制

開花植物產(chǎn)生多倍體的機(jī)制主要有體細(xì)胞染色體加倍和未減數(shù)配子（2n）發(fā)生2種[12-14]，這些機(jī)制同樣適用于橡膠樹。

2.1 體細(xì)胞染色體加倍

體細(xì)胞染色體加倍是在體細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的過程中，通過物理（機(jī)械損傷、高低溫、射線等）或化學(xué)（秋水仙堿、紫杉醇等）刺激，抑制紡錘絲活動(dòng)，阻止染色體分向兩極，從而獲得染色體加倍的細(xì)胞或組織。植物孢子體的分生組織由于各種刺激常會(huì)產(chǎn)生染色體加倍的細(xì)胞，常發(fā)生于生長(zhǎng)點(diǎn)、傷口或腫瘤部位，是新多倍體芽的來源。體細(xì)胞染色體加倍獲得的均是偶數(shù)倍的多倍體，但是因?yàn)椴皇撬械慕M織或細(xì)胞均會(huì)產(chǎn)生加倍作用，因而常形成混倍體。體細(xì)胞染色體加倍還發(fā)生于合子細(xì)胞或者幼胚組織，形成整倍體。

2.2 未減數(shù)配子

未減數(shù)配子（2n）融合獲得多倍體被認(rèn)為是形成多倍體的最主要的途徑[15]。2n配子主要通過大、小孢子發(fā)生時(shí)的“不減數(shù)”或者“減數(shù)分裂重組”產(chǎn)生。2n配子的產(chǎn)生機(jī)制主要有[16-17]：（1）孢原細(xì)胞有絲分裂失敗，如發(fā)生內(nèi)有絲分裂或雙二倍化等；（2）染色體聯(lián)會(huì)異常；（3）減數(shù)分裂缺失；（4）胞質(zhì)提前分離；（5）胞質(zhì)分離失??；（6）第二次減數(shù)分裂時(shí)形成平行染色體；（7）胞質(zhì)分離異常形成多微核后融合等。所有機(jī)制按照其遺傳效應(yīng)可以分為第一次減數(shù)分裂復(fù)原（FDR，first division restitution）、第二次減數(shù)分裂復(fù)原（SDR，second division restitution）2種，分別可以遺傳親本約70%～80%、30%～40%的雜合性[18]。

3 獲得橡膠樹多倍體的途徑

橡膠樹作為世界范圍內(nèi)的重要經(jīng)濟(jì)樹種，國(guó)外在20世紀(jì)40年代就開始了多倍體誘導(dǎo)研究[19]，國(guó)內(nèi)在20世紀(jì)70年代也隨之開始了相關(guān)研究。通過幾十年的研究，已經(jīng)可以通過不同途徑獲得多倍體植株。總結(jié)起來，可以分為自然選擇和人工誘導(dǎo)兩大途徑。

3.1 直接選擇和分離多倍體

直接從自然界選擇和分離多倍體是獲得多倍體植株最便捷的方法。目前，已經(jīng)從自然界直接分離出了歐洲山楊[20]、桑樹[21]、漆樹[22]等三倍體植株，有的還應(yīng)用到了生產(chǎn)中。

天然多倍體橡膠樹同樣存在，通過形態(tài)篩選和細(xì)胞學(xué)鑒定以及流式細(xì)胞檢測(cè)等手段，是獲得橡膠樹多倍體的重要手段之一。胡東瓊等[23]從橡膠樹GT1的人工授粉苗、無性系種子實(shí)生苗和種子園實(shí)生苗中首次分離出了三倍體植株。緊接著，劉陽平[24]報(bào)道稱于1970年發(fā)現(xiàn)了一株天然三倍體橡膠樹。此后，鮮有天然多倍體橡膠樹發(fā)現(xiàn)的報(bào)道。直到2009年，敖碩昌等[25]利用GT1×PR107自然雜交后代選育出的云研77-2和云研77-4被證實(shí)為多倍體，成為首例大面積應(yīng)用于生產(chǎn)的橡膠樹天然多倍體[4]。張?jiān)丛碵26]從橡膠樹GT1的自然授粉種子中檢測(cè)出3株天然三倍體，首次分析天然三倍體檢出率為0.72%。

3.2 人工誘導(dǎo)獲得多倍體

人工誘導(dǎo)獲得多倍體是指通過物理方法（輻射、機(jī)械刺激、高低溫等）和化學(xué)方法（秋水仙堿、紫杉醇、N2O[27]等）誘導(dǎo)體細(xì)胞染色體加倍或者生殖細(xì)胞不減數(shù)分裂，從而獲得多倍體。人工誘導(dǎo)的對(duì)象多種多樣，根據(jù)處理材料可以分為活體細(xì)胞、離體細(xì)胞和生殖細(xì)胞誘導(dǎo)等。此外，通過原生質(zhì)體融合和胚乳培養(yǎng)同樣可以獲得多倍體。endprint

3.2.1 活體誘導(dǎo)

活體誘導(dǎo)主要是通過輻射、秋水仙堿等處理種子、生長(zhǎng)點(diǎn)等，然后經(jīng)過多代分離和芽接獲得較為純合的多倍體植株。這種途徑方法簡(jiǎn)單，技術(shù)要求低，處理批量大，可直接從優(yōu)良植株上獲得多倍體。

橡膠樹中主要通過種子、幼苗、頂芽誘導(dǎo)獲得多倍體植株。國(guó)外研究方面，Luiz等[28]用秋水仙堿溶液處理橡膠樹實(shí)生苗，獲得了四倍體植株。馬來西亞橡膠研究院（RRIM）普蘭沙伯研究站于20世紀(jì)60年代用秋水仙堿處理橡膠樹實(shí)生苗，獲得了多倍體植株[29]。70年代，巴西農(nóng)業(yè)研究所通過秋水仙堿處理誘導(dǎo)出了IAN870的多倍體植株[30]。印度橡膠研究所用秋水仙堿處理從GT1芽條的一個(gè)芽和無性系Tjir1的種子誘導(dǎo)出了多倍體植株[1，31-33]。

在國(guó)內(nèi)，陸永林[34]從1974年開始用秋水仙堿溶液處理發(fā)芽的種子、種子幼芽和無性系頂芽，獲得了一批多倍體植株。鄭學(xué)勤等[35-36]于1980年首次報(bào)道用細(xì)胞學(xué)方法鑒定出了橡膠樹多倍體植株。劉陽平[24]用不同濃度秋水仙堿溶液處理實(shí)生苗和無性系苗，獲得了倍性穩(wěn)定的多倍體植株。凌緒柏等[37]用秋水仙堿溶液處理無性系萌動(dòng)芽，獲得了穩(wěn)定的多倍體。張樹珍等[38]用濃度為1%的秋水仙堿溶液處理橡膠樹無性系芽，誘導(dǎo)分理出了多倍體細(xì)胞達(dá)85%以上的多倍體無性系。從種子、幼苗和頂芽獲得的多倍體大多是混倍體或嵌合體，經(jīng)過多代分離后仍然難以獲得完全純合的多倍體，倍性優(yōu)勢(shì)難以發(fā)揮。因此，目前尚沒有通過人工誘導(dǎo)得到的多倍體應(yīng)用于生產(chǎn)的例子[39]。

3.2.2 離體誘導(dǎo)

離體誘導(dǎo)是相對(duì)于活體誘導(dǎo)的又一種體細(xì)胞誘導(dǎo)獲得多倍體的方法。離體誘導(dǎo)可以直接獲得純合四倍體或者更高倍性體，克服了活體誘導(dǎo)產(chǎn)生混倍體的缺點(diǎn)，同時(shí)試驗(yàn)條件易于控制，結(jié)果重復(fù)性高，對(duì)于已經(jīng)建立組織培養(yǎng)體系的植物，能夠在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)出大量多倍體植株。當(dāng)前，橡膠樹的組織培養(yǎng)技術(shù)尚不成熟，影響多倍體誘導(dǎo)的成功率，因而研究成果較少，只有曾憲松等[40]用0.5%的秋水仙堿處理二倍體植株的花藥體細(xì)胞愈傷組織，誘導(dǎo)出了4株純合四倍體植株。

3.2.3 未減數(shù)配子

未減數(shù)配子融合獲得多倍體是形成多倍體的主要途徑[15]?；铙w或離體細(xì)胞誘導(dǎo)獲得主要是同源四倍體，而未減數(shù)配子雜交途徑獲得的是異源多倍體，同時(shí)具有倍性效應(yīng)和雜合效應(yīng)，具有更大的育種價(jià)值。

橡膠樹育種工作者在人工誘導(dǎo)未減數(shù)配子方面做了初步的研究和嘗試，獲得了少量三倍體植株。鄭學(xué)勤等[34]用秋水仙堿溶液處理橡膠樹單核期雄花，然后采集成熟花粉用于授粉，獲得了純合三倍體。賴杭桂等[41-42]用秋水仙堿溶液處理橡膠樹性器官，分別獲得了未減數(shù)大小孢子，分別同二倍體植株授粉，初步認(rèn)定獲得了2株三倍體植株。其后，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)確認(rèn)獲得的疑似植株為三倍體，并通過分子標(biāo)記方法鑒定出了父母本[43]。

3.2.4 原生質(zhì)體融合和胚乳培養(yǎng)

原生質(zhì)體融合和胚乳培養(yǎng)是獲得植物多倍體的兩個(gè)重要途徑。原生質(zhì)體融合又稱體細(xì)胞雜交，該技術(shù)的發(fā)展是建立在原生質(zhì)體培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上的。首先，用纖維素酶和果膠酶處理植物細(xì)胞，得到無壁的原生質(zhì)體，再通過化學(xué)或物理方法誘導(dǎo)異核體，進(jìn)一步融合后成為共核體，經(jīng)培養(yǎng)后誘導(dǎo)分化出同源或異源多倍體植株[44]。目前，通過原生質(zhì)體培養(yǎng)已經(jīng)得到橡膠樹的愈傷組織[45]，獲得再生植株[46-47]，為進(jìn)行橡膠樹原生質(zhì)體融合獲得多倍體打下了基礎(chǔ)。

胚乳是由3個(gè)單倍體核融合而成的，1個(gè)單倍體核來自雄配子體，2個(gè)來自雌配子體，因此胚乳是天然的三倍體組織，具有雙親的遺傳成分，對(duì)育種后代性狀有一定的預(yù)見性。橡膠樹種子具有豐富的胚乳，通過胚乳培養(yǎng)獲得橡膠樹三倍體植株是極有可能實(shí)現(xiàn)的[48]。目前尚沒有進(jìn)行橡膠樹胚乳培養(yǎng)的相關(guān)研究。

3.2.5 倍性間雜交

在獲得天然多倍體或者人工誘導(dǎo)多倍體后，通過不同倍性個(gè)體間雜交，可直接得到不同倍性的后代。例如四倍體同二倍體雜交獲得三倍體，三倍體（極少數(shù)的）同二倍體雜交獲得四倍體或三倍體，更高倍性間雜交獲得更多倍性的后代。

人工誘導(dǎo)（主要是體細(xì)胞誘導(dǎo)）獲得的多倍體橡膠樹大多倍性不穩(wěn)定，在生長(zhǎng)過程中多倍性逐漸消失[49]。此外，橡膠樹生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，開花結(jié)實(shí)需要較長(zhǎng)時(shí)間，在進(jìn)行雜交時(shí)需要親本具有較強(qiáng)的配合力，種種因素限制了橡膠樹的倍性間雜交的研究。只有印度于1980年報(bào)道，用秋水仙堿誘導(dǎo)獲得的四倍體植株同常規(guī)二倍體植株雜交，育成若干三倍體植株[19]。

4 橡膠樹多倍體育種現(xiàn)狀和前景展望

橡膠樹多倍體育種自20世紀(jì)40年代開始以來，進(jìn)行了大量的研究工作，在多倍體誘導(dǎo)技術(shù)方面取得了重要的研究進(jìn)展。這些研究主要集中在體細(xì)胞染色體加倍方面，目前已經(jīng)可以通過誘導(dǎo)枝條變異，然后截頂分離并且經(jīng)過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)鑒定快速獲得多倍體植株。盡管通過不同途徑獲得了大量多倍體植株，但是只有從自然授粉后代中直接選擇出的三倍體云研77-2和云研77-4得到大面積生產(chǎn)應(yīng)用。人工誘導(dǎo)橡膠樹體細(xì)胞染色體加倍獲得多倍體的研究工作最多，卻至今沒有成功應(yīng)用于生產(chǎn)的報(bào)道，其原因可能是多倍體中基因雜合效應(yīng)較倍性效應(yīng)更為重要[50]，體細(xì)胞染色體加倍得到的多倍體在獲得基因劑量效應(yīng)的同時(shí)，減弱了基因雜合效應(yīng)。

通過未減數(shù)配子雜交獲得的多倍體可以獲得基因劑量效應(yīng)的同時(shí)不減弱基因雜合效應(yīng)，是橡膠樹多倍體育種最為行之有效的途徑，但是此方面的研究較少。在進(jìn)行人工誘導(dǎo)配子染色體加倍時(shí)，掌握樹種的相關(guān)細(xì)胞遺傳學(xué)知識(shí)可以取得事半功倍的效果[8]。橡膠樹的大、小孢子發(fā)育過程等相關(guān)細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)匱乏，影響了橡膠樹未減數(shù)配子雜交進(jìn)行多倍體育種研究的效果。另外，盡管獲得大量橡膠樹多倍體植株，卻鮮有對(duì)其進(jìn)行篩選和生產(chǎn)鑒定的后續(xù)報(bào)道。橡膠樹在加倍后，由于基因重組、染色體重排，以及基因表達(dá)、表觀遺傳等變化的影響，不是所有多倍體的表現(xiàn)都優(yōu)于二倍體，需要進(jìn)一步進(jìn)行選擇和鑒定。后期需要的大量時(shí)間、人力物力投入，影響了橡膠樹多倍體育種的發(fā)展。endprint

綜上所述，人工誘導(dǎo)未減數(shù)配子應(yīng)該是未來橡膠樹多倍體育種研究的一條有效途徑。立足于橡膠樹生殖生物學(xué)研究[51-60]，突破人工誘導(dǎo)未減數(shù)配子的有效方法和處理時(shí)期等關(guān)鍵技術(shù)，在獲得大量基因型不同的多倍體植株的基礎(chǔ)上，根據(jù)“大群體、強(qiáng)選擇”的育種策略，從中選擇表現(xiàn)優(yōu)良的多倍體植株進(jìn)行無性系鑒定，從而選育出符合當(dāng)前和未來橡膠樹生產(chǎn)需要的新品種，豐富橡膠樹種質(zhì)資源，為我國(guó)橡膠生產(chǎn)提供品種支撐。

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（下轉(zhuǎn)第58頁）endprint