協(xié)助寄主緩解干旱脅迫的植物根圍細菌的分離及活性初探

楊威+閆海霞+李師默+等

摘要：根據(jù)菌株離體條件下產(chǎn)酶活性，從分離到的183株植物根圍細菌中篩選了5株具有顯著IAA（吲哚乙酸）和ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）脫氨酶活性的菌株進行溫室試驗，評價其協(xié)助寄主植物緩解干旱脅迫壓力的能力。其中菌株H4-1L相對于對照組能夠顯著緩解干旱對于植物的脅迫壓力，根長增加25%～31%，鮮重增加27%～44%，葉綠素含量增加21%～83%，根系活力增加50%～56%。通過形態(tài)學特征及16S rDNA序列比對，鑒定該菌株為Pseudomonas putida。

關鍵詞：植物根圍細菌；抗旱；IAA；ACC脫氨酶；惡臭假單胞

中圖分類號： S423+.4；Q939.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0349-03

收稿日期：2013-09-06

基金項目：江蘇省淮安市科技項目（編號：HASZ2012023）。

作者簡介：楊威（1983—），男，河北承德人，博士，講師，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：yangw107@126.com。

通信作者：羅玉明，教授，主要從事作物高效生產(chǎn)技術研究。E-mail：yumingluo@163.com。當植物蒸騰速率超過水分吸收速率或土壤缺乏植物可利用的水分時，植物發(fā)生干旱脅迫。干旱脅迫是田間條件下存在最廣泛的一種作物生長逆境。據(jù)統(tǒng)計，世界干旱、半干旱地區(qū)占地球陸地面積的1/3[1]，我國干旱、半干旱地區(qū)約占國土面積的1/2，同時其他半濕潤甚至濕潤地區(qū)也常會有周期性、季節(jié)性或臨時性的干旱[2]。2011年我國長江中下游五省大旱，據(jù)報道約造成農(nóng)作物受災面積370.51萬hm2，其中絕收面積16.68萬hm2，直接經(jīng)濟損失149.4億元。

目前，在干旱條件下，除了力所能及的調(diào)度灌溉水以外，人們主要依靠以下幾種途徑來緩解干旱對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的危害：（1）化學調(diào)控方法。一些能促進水分調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)、氣孔調(diào)節(jié)和光合調(diào)節(jié)等一系列生理生化機制的化學物質(zhì)能增強植物的代謝活性，提高其抗旱性[3-4]，但是無論哪一種化學調(diào)節(jié)劑都存在經(jīng)濟成本問題以及對于環(huán)境、土壤的副作用；（2）基因工程。近年來利用基因工程技術改進植物體內(nèi)干旱應答基因產(chǎn)物水平已成為培育抗逆性新品種的一種手段，至今已有不少植物已成功導入相關抗旱基因且抗旱程度也有所提高，如水稻、煙草、棉花等[5-6]。但是，利用基因工程培育抗旱品種在蔬菜方面的研究較少，另外在長期的進化過程中，植物自身也建立起了在面對干旱脅迫時的應答反應，并且植物自身調(diào)節(jié)抗旱能力有限，不足以應對持續(xù)干旱帶來的脅迫壓力。

自20世紀70年代植物根圍促生細菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）這個概念提出以來[7]，已經(jīng)在不同寄主植物上、不同的生態(tài)環(huán)境中分離得到多種促生菌。這些微生物在促進植物生長、抑制病害發(fā)生、調(diào)節(jié)根圍微生態(tài)結(jié)構各個方面得到了廣泛的應用[8]，也為人類挽回了巨大的經(jīng)濟損失，其中一些品種已經(jīng)進行商業(yè)化生產(chǎn)。近幾年，有越來越多的學者開始不只是關注 PGPR 促生抗病方面的能力，而是將注意力轉(zhuǎn)移到這些有益微生物在協(xié)助植物抗逆的作用上來，包括耐鹽脅迫、耐干旱脅迫等[9]。Glick等報道，具有ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸）脫氨酶活性的菌株能夠降低植物根部乙烯含量，促進植物根部伸長[10]。Barea等也證明根部接種產(chǎn)IAA（吲哚乙酸）的菌株能夠顯著增加植物的干重和根長[11]。

本研究旨在通過離體條件下產(chǎn)酶活性篩選，選擇具有IAA和ACC脫氨酶活性的植物根圍細菌，并且在溫室條件下評價其協(xié)助寄主植物緩解干旱脅迫的能力。

1材料與方法

1.1土壤采集及菌株分離

在江蘇省淮安市武墩鎮(zhèn)蔬菜大棚采集黃瓜與辣椒根圍土壤樣品。采集方法如下：每個溫室5點取樣，每點之間間隔大于10 m，另外取同一溫室內(nèi)非種植土壤1份作為對照。首先用鐵鍬挖開植物根基部深10 cm的土壤，然后用小刷子收集附著在植物根表層的土壤，收集后裝入小號自封袋，標記編號迅速帶回實驗室進行下一步處理。

本研究采用LB和KB 2種培養(yǎng)基利用稀釋涂平板法進行菌株的分離：每份土壤樣品取1 g分別溶于9 mL無菌水，然后每組稀釋到10-3、10-4、10-5。用移液器分別吸取 100 mL 到相應培養(yǎng)基上，涂布，每個梯度3次重復。標記后置于28 ℃溫室培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌落長出后，根據(jù)形態(tài)特征挑取進行純化，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2菌株代謝產(chǎn)物活性檢測

IAA活性檢測：將分離純化后的細菌接種于含有L-色氨酸（100 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)1 d。取50μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加50 μL Salkowski比色液（50 mL φ=35%的HClO4 +1 mL 0.5 mol/L FeCl3），將加入50 μL IAA（50 mg/L）的比色液作為陽性對照。白色陶瓷板于室溫、避光條件下放置30 min后觀察，顏色變紅者表示能夠產(chǎn)IAA[12]。

ACC脫氨酶活性檢測：將菌種接種到DFa培養(yǎng)液（KH2PO4 4 g/L、Na2HPO4 6 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L，葡萄糖2 g，葡萄糖酸2 g，檸檬酸2 g，ACC終濃度為3 mmol/L，pH值7.2）于30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)1 d。以不接菌株的培養(yǎng)液做對照，檢測培養(yǎng)液在600 nm下的吸光值，根據(jù)吸光值判斷菌株是否能夠在以ACC為唯一氮源的培養(yǎng)液中生長。

1.3溫室試驗

溫室試驗中所選用的黃瓜、辣椒品種分別為新津優(yōu)1號、大禹牛角王，所用基質(zhì)購自淮安市柴米河農(nóng)業(yè)科技有限公司。首先用穴盤育苗，待苗長出3～4片真葉后移栽到盆缽中，溫室條件為30 ℃，光照時間16 h，黑暗時間8 h。

根據(jù)菌株產(chǎn)酶活性篩選結(jié)果選擇5株菌株進行溫室試驗。每批溫室試驗分別設5個處理組和2個對照組，每個處理組3次重復，每個重復24株植株。對照組1不接種菌株，每隔3 d澆水20 mL/盆，對照組2不接種菌株，移栽1周內(nèi)正常澆水2次，1周后開始進行干旱處理。5個處理組處理方式如下：移栽時用109 CFU/mL 的菌懸液灌根處理，20 mL/盆，移栽1周內(nèi)正常澆水2次，1周后開始進行干旱處理。

1.4植株生理指標檢測

溫室試驗植株移栽后第21天分別檢測各處理組根長、鮮重、葉綠素含量、根系活力以及葉片相對電導勢。檢測方法參照《植物生理學試驗指導》。

1.5菌株鑒定

菌株基因組DNA提取采用樹脂型基因組試劑盒（上海賽百盛基因技術有限公司），以提取的基因組DNA為模板，利用16S通用引物擴增其16S rDNA片段并測序（南京金斯瑞生物科技有限公司）。結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫比對。

2結(jié)果與分析

2.1菌株分離結(jié)果

如圖1所示，本試驗所采集的土壤樣品中，黃瓜根圍細菌數(shù)量明顯多于辣椒，10-3稀釋液在LB培養(yǎng)基上得到的菌落數(shù)最多為231，而辣椒根圍土壤中分離到的最多菌落數(shù)為24。從采集位點來看，不同位點之間根圍細菌的數(shù)量差別較大，另外根圍土壤中細菌數(shù)量明顯多于非根圍土壤。

2.2菌株代謝產(chǎn)物活性檢測結(jié)果

本研究將分離得到的182株根圍細菌分別檢測其產(chǎn)IAA和ACC脫氨酶活性，其中產(chǎn)IAA的菌株48株，具有ACC脫氨酶活性的菌株37株，二者兼具的菌株13株。選擇其中5株菌株進行溫室試驗（表1），評價其協(xié)助寄主植物緩解干旱脅迫的能力。

2.3溫室試驗結(jié)果

本研究中將篩選出來的5株菌株分別進行了2批次溫室試驗，所用植株分別為黃瓜和辣椒。從表2可以看出，與對照組2相比，菌液處理組能夠在干旱處理條件下增加黃瓜植株的根長、鮮重、葉綠素含量以及根系活力。其中菌株H4-1L、

溫室試驗菌株信息

菌株編號來源產(chǎn)IAA

活性吸光值

（ACC培養(yǎng)液）*H2-10K黃瓜根圍土，KB培養(yǎng)基+1.74HCK-17L黃瓜非根圍土，LB培養(yǎng)基+1.67H4-1L黃瓜根圍土，LB培養(yǎng)基+1.83L4-8L辣椒根圍土，LB培養(yǎng)基+1.52L5-10L辣椒根圍土，LB培養(yǎng)基+1.62注：“+”代表參試菌株培養(yǎng)后與對照相比產(chǎn)生明顯紅色；“*”菌株接種到ACC作為唯一氮源的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后以未接種的培養(yǎng)液為對照檢測吸光值，表中數(shù)值為3次重復試驗的平均值。表2第1批次溫室試驗結(jié)果（黃瓜）

電導率L4-8L14.5±2.6a4.84.69±0.55b42.631.22±0.56c19.01.78±0.03c38.014.33±3.82aH4-1L17.33±2.52a25.34.75±0.19b44.431.67±0.28bc20.71.93±0.03b49.64.16±0.48bL5-10L14±1.73a1.23.78±0.52b14.932.66±1.1ab24.51.43±0.03e10.914.16±1.75aH2-10K14.67±0.76a6.13.3±0.55b0.329.71±0.39d13.21.28±0.06f-0.813.51±0.3aHCK-17L15.33±0.76a10.84.03±0.58b22.531.97±0.79bc21.82.42±0.07a87.614.87±4.7aCK213.83±4.37a3.29±1.36b26.24±0.38e1.29±0.06f13.25±1.79aCK114.17±1.26a2.56.91±2.08a110.033.3±0.16a26.91.56±0.08d20.912.23±0.91a注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

HCK-17L增加效果比較明顯，特別是對根長和根系活力2項指標，菌株H4-1L、HCK-17L處理組高于正常澆水的對照組1。從相對電導率來看，菌株H4-1L處理組明顯降低植株葉片的相對電導率，而其他處理組之間沒有明顯差異。

與黃瓜相比，各個處理組在辣椒植株上也體現(xiàn)相似的趨勢，其中H4-1L和HCK-17L能夠明顯增加辣椒植株的根長、鮮重、葉綠素含量以及根系活力，特別是對于根長和根系活力2個指標，H4-1L和HCK-17L處理組的促進效果高于正常澆水的對照組1。另外H4-1L還能夠顯著降低辣椒葉片的相對電導率（表3）。

從兩批次溫室試驗結(jié)果綜合來看，菌株H4-1L協(xié)助寄主植物緩解干旱脅迫的效果更穩(wěn)定。表3第2批次溫室試驗結(jié)果（辣椒）

處理根長

電導率L4-8L10.47±3.52a-5.10.8±0.18b25.022.37±0.57d21.71.61±0.03c28.844.23±7.38aH4-1L14.43±6.84a30.80.81±0.17b26.633.61±0.32a82.91.95±0b56.038.42±5.73aL5-10L11.13±0.85a0.90.72±0.16b12.521.52±0.05e17.11.4±0.01de12.044.39±7.85aH2-10K9.93±2.39a-10.00.73±0.12b14.119.91±0.15f8.31.3±0.18e4.045.12±6.69aHCK-17L11.83±4.74a7.30.86±0.13b34.424.12±0.26c31.23.27±0.01a161.642.57±2.1aCK211.03±3.8a0.64±0.02b18.38±0.33g1.25±0.05e48.57±4.42aCK111.47±0.87a4.01.88±0.69a193.826.51±0.18b44.21.51±0.2cd20.843.77±2.54a注同表2。

2.4菌株鑒定結(jié)果

通過16S rDNA序列比對，5株菌株鑒定結(jié)果如表4所示，其中H4-1L與惡臭假單胞菌株（GenBank登錄號CQ303714.1）序列相似性100%。另外菌株H4-1L革蘭氏染色反應陰性，在LB培養(yǎng)基上可形成1～3 mm菌落，呈圓形、邊緣不整齊，白色，表面光滑。與《常用細菌學鑒定手冊》中假單胞菌Pseudomonas的特性一致。故鑒定為惡臭假單胞菌Pseudomonas putida。

株測序比對結(jié)果

編號鑒定結(jié)果相似性

（%）L4-8LArthrobacter sp.（EF612294.1）99H4-1LPseudomonas putida（CQ303714.1）100L5-10LBacillus amyloliquefaciens（KF160918.1）99H2-10KAgrobacterium sp.（GU726172.1）100HCK-17LBacillus cereus（KF234451.1）100

3討論

植物根圍細菌作為植物根圍土壤中的一個特殊類群，號稱植物的“第二基因組”，與植物的健康生長息息相關[13]。除了防病促生相關特性研究，近年來許多學者開始關注植物根圍細菌在協(xié)助寄主植物抗逆中的作用，包括抗干旱、抗重金屬污染等。Jacobson等報道具有ACC脫氨酶活性的惡臭假單胞菌株能夠水解乙烯合成前體ACC，阻止乙烯合成從而促進根的伸長，并且討論了相關酶學性質(zhì)[14-15]。

本研究通過離體條件下菌株產(chǎn)IAA和ACC脫氨酶活性篩選出5株植物根圍細菌并且在溫室條件下評價其協(xié)助寄主植物緩解干旱脅迫能力。其中菌株H4-1L同時具有IAA和ACC脫氨酶活性，在溫室試驗中，該菌株能夠在干旱條件下促進黃瓜和辣椒根部伸長、增加植物鮮重、提高葉綠素含量以及根系活力，與對照組相比，能夠協(xié)助寄主緩解干旱帶來的脅迫壓力，提高植株對于干旱的耐受性。在環(huán)境不斷惡化的大背景下，具有一定的開發(fā)潛力。但是對于菌株的接種方式、多菌合劑的組合以及不同劑型的嘗試等本研究并未涉及，這些條件對于成功開發(fā)一種成熟的菌劑至關重要，也是本研究今后需要進一步探索的內(nèi)容。

參考文獻：

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2.4菌株鑒定結(jié)果

通過16S rDNA序列比對，5株菌株鑒定結(jié)果如表4所示，其中H4-1L與惡臭假單胞菌株（GenBank登錄號CQ303714.1）序列相似性100%。另外菌株H4-1L革蘭氏染色反應陰性，在LB培養(yǎng)基上可形成1～3 mm菌落，呈圓形、邊緣不整齊，白色，表面光滑。與《常用細菌學鑒定手冊》中假單胞菌Pseudomonas的特性一致。故鑒定為惡臭假單胞菌Pseudomonas putida。

株測序比對結(jié)果

編號鑒定結(jié)果相似性

（%）L4-8LArthrobacter sp.（EF612294.1）99H4-1LPseudomonas putida（CQ303714.1）100L5-10LBacillus amyloliquefaciens（KF160918.1）99H2-10KAgrobacterium sp.（GU726172.1）100HCK-17LBacillus cereus（KF234451.1）100

3討論

植物根圍細菌作為植物根圍土壤中的一個特殊類群，號稱植物的“第二基因組”，與植物的健康生長息息相關[13]。除了防病促生相關特性研究，近年來許多學者開始關注植物根圍細菌在協(xié)助寄主植物抗逆中的作用，包括抗干旱、抗重金屬污染等。Jacobson等報道具有ACC脫氨酶活性的惡臭假單胞菌株能夠水解乙烯合成前體ACC，阻止乙烯合成從而促進根的伸長，并且討論了相關酶學性質(zhì)[14-15]。

本研究通過離體條件下菌株產(chǎn)IAA和ACC脫氨酶活性篩選出5株植物根圍細菌并且在溫室條件下評價其協(xié)助寄主植物緩解干旱脅迫能力。其中菌株H4-1L同時具有IAA和ACC脫氨酶活性，在溫室試驗中，該菌株能夠在干旱條件下促進黃瓜和辣椒根部伸長、增加植物鮮重、提高葉綠素含量以及根系活力，與對照組相比，能夠協(xié)助寄主緩解干旱帶來的脅迫壓力，提高植株對于干旱的耐受性。在環(huán)境不斷惡化的大背景下，具有一定的開發(fā)潛力。但是對于菌株的接種方式、多菌合劑的組合以及不同劑型的嘗試等本研究并未涉及，這些條件對于成功開發(fā)一種成熟的菌劑至關重要，也是本研究今后需要進一步探索的內(nèi)容。

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[15]Hontzeas N，Zoidakis J，Glick B R，et al. Expression and characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase from the rhizobacterium Pseudomonas putida UW4：a key enzyme in bacterial plant growth promotion[J]. Biochimica et Biophysica acta，2004，1703（1）：

2.4菌株鑒定結(jié)果

通過16S rDNA序列比對，5株菌株鑒定結(jié)果如表4所示，其中H4-1L與惡臭假單胞菌株（GenBank登錄號CQ303714.1）序列相似性100%。另外菌株H4-1L革蘭氏染色反應陰性，在LB培養(yǎng)基上可形成1～3 mm菌落，呈圓形、邊緣不整齊，白色，表面光滑。與《常用細菌學鑒定手冊》中假單胞菌Pseudomonas的特性一致。故鑒定為惡臭假單胞菌Pseudomonas putida。

株測序比對結(jié)果

編號鑒定結(jié)果相似性

（%）L4-8LArthrobacter sp.（EF612294.1）99H4-1LPseudomonas putida（CQ303714.1）100L5-10LBacillus amyloliquefaciens（KF160918.1）99H2-10KAgrobacterium sp.（GU726172.1）100HCK-17LBacillus cereus（KF234451.1）100

3討論

植物根圍細菌作為植物根圍土壤中的一個特殊類群，號稱植物的“第二基因組”，與植物的健康生長息息相關[13]。除了防病促生相關特性研究，近年來許多學者開始關注植物根圍細菌在協(xié)助寄主植物抗逆中的作用，包括抗干旱、抗重金屬污染等。Jacobson等報道具有ACC脫氨酶活性的惡臭假單胞菌株能夠水解乙烯合成前體ACC，阻止乙烯合成從而促進根的伸長，并且討論了相關酶學性質(zhì)[14-15]。

本研究通過離體條件下菌株產(chǎn)IAA和ACC脫氨酶活性篩選出5株植物根圍細菌并且在溫室條件下評價其協(xié)助寄主植物緩解干旱脅迫能力。其中菌株H4-1L同時具有IAA和ACC脫氨酶活性，在溫室試驗中，該菌株能夠在干旱條件下促進黃瓜和辣椒根部伸長、增加植物鮮重、提高葉綠素含量以及根系活力，與對照組相比，能夠協(xié)助寄主緩解干旱帶來的脅迫壓力，提高植株對于干旱的耐受性。在環(huán)境不斷惡化的大背景下，具有一定的開發(fā)潛力。但是對于菌株的接種方式、多菌合劑的組合以及不同劑型的嘗試等本研究并未涉及，這些條件對于成功開發(fā)一種成熟的菌劑至關重要，也是本研究今后需要進一步探索的內(nèi)容。

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