李楠+許文鳳+葉振南+等
摘要:為了研究9種植物粗提總黃酮的體外降脂及抑制非酶糖基化的活性,分別將9種植物樣品經(jīng)粉碎、脫脂、脫色處理后,用超聲輔助70%乙醇浸提,真空過(guò)濾濃縮后得粗黃酮。以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)樣品,用紫外分光光度法測(cè)其在 510 nm 處吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中黃酮含量。隨后進(jìn)行體外降脂試驗(yàn),通過(guò)比較有無(wú)抑制劑(提取液)加入的情況下,脂肪酶的活性差異、所得各提取物對(duì)脂肪酶的抑制率,比較降脂活性大小。之后進(jìn)行體外非酶糖基化試驗(yàn),1 mL 提取液(加氨基胍做陽(yáng)性對(duì)照,加水做陰性對(duì)照)與 1 mL 磷酸緩沖液混合,90 ℃水浴 40 min;然后與乙二醛和牛血清白蛋白混合,反應(yīng)液于 37 ℃條件下孵育 15 d,用熒光法在發(fā)射波長(zhǎng) 440 nm 激發(fā)波長(zhǎng) 365 nm 處測(cè)定糖基化產(chǎn)物的自發(fā)熒光值,計(jì)算9種植物粗提黃酮對(duì)體外非酶糖基化反應(yīng)的抑制率,結(jié)果表明9種植物黃酮粗提物對(duì)脂肪酶均有較強(qiáng)的抑制作用,其中蛇接骨草抑制活性最強(qiáng)。在體外非酶糖基化試驗(yàn)中,9 種植物對(duì)非酶糖基化終產(chǎn)物的生成均有較強(qiáng)的抑制作用,其中蘆薈黃酮非酶糖基化抑制活性最強(qiáng)。
關(guān)鍵詞:黃酮;降脂活性;抑制;非酶糖基化
中圖分類號(hào): R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2014)06-0291-03
收稿日期:2013-09-24
基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):31160319);江西省高等學(xué)??萍悸涞赜?jì)劃(編號(hào):KJLD13027);江西省教育廳科技計(jì)劃(編號(hào):GJJ13281)。
作者簡(jiǎn)介:李楠(1989—),女,內(nèi)蒙古滿洲里人,碩士研究生,研究方向?yàn)榉肿訝I(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail:296875131@qq.com。
通信作者:王文君,博士,教授,研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail:wwjun9999@sina.com。黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物體內(nèi)具有C6—C3—C6 基本骨架的化合物,已發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物有9 000多種[1]。它是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸以外的一類重要生物分子,尤其是一類重要的信息分子,具有多種多樣的生物功能?,F(xiàn)代研究證明黃酮類化合物具有擴(kuò)血管、降血脂、抗凝血、抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛以及非酶糖基化等廣泛的藥理活性[2],因此成為目前重點(diǎn)研究的植物化學(xué)成分之一。
糖尿病是一種慢性代謝性疾病,是由于胰島素缺乏或相對(duì)缺乏而形成持續(xù)性高血糖癥。這種持續(xù)性的高血糖癥可以導(dǎo)致一些組織器官的代謝異常,產(chǎn)生功能障礙及形態(tài)的異常,從而引發(fā)眾多慢性并發(fā)癥。目前認(rèn)為在高血糖的情況下,機(jī)體組織的許多重要蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)是糖尿病慢性并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)制之一[3-4]。非酶糖化反應(yīng)是蛋白質(zhì)和葡萄糖在體內(nèi)發(fā)生酶促反應(yīng)形成 Schiff 堿和Amadori產(chǎn)物等早期產(chǎn)物,進(jìn)而經(jīng)過(guò)氧化、重排、交聯(lián)等過(guò)程,形成不可逆的非酶糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)的一系列復(fù)雜反應(yīng)。有效控制高血糖,尋找干預(yù)非酶糖基化過(guò)程的措施,減少糖基化終末產(chǎn)物的形成是防治糖尿病慢性并發(fā)癥和其他老年性疾病的一個(gè)可行且有效的方法。抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化已成為藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要靶點(diǎn)[5-7]。醫(yī)學(xué)藥物學(xué)研究證實(shí)氨基胍可以有效抑制蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)[7]。黃酮類化合物對(duì)人體具有多種潛在的生物活性,如抗癌、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、防治心腦血管系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)疾病等,且對(duì) AGEs 的生成也有一定抑制作用。
青錢柳(Cyclocarya paliurus)、銀杏(Ginkgo biloba)、綠茶(Camellia sinensis)、蘆薈(Aloe vera var. chinensis)、荷葉(Folium nelumbinis)、蛇接骨草(Gynura procumbens)、菝葜(Smilax china)、魚腥草(Houttuynia cordata)、三葉草(Trifolium repens)等9種植物都屬于自然中常見(jiàn)的實(shí)用性較強(qiáng)的天然植物,有些還是藥食同源植物。本研究探討了9種植物粗黃酮的體外降脂活性和其對(duì)非酶糖基化的抑制作用,以期為其藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
青錢柳、銀杏、綠茶、蘆薈、魚腥草、荷葉、蛇接骨草、菝葜、三葉草,都來(lái)源于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園。
1.2主要試劑
氫氧化鋁、聚乙烯醇、三油酸甘油酯、乙二醛均購(gòu)自天津永大化學(xué)試劑,胰脂肪酶、氨基胍和標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白購(gòu)自 Sigma 公司。
1.3主要儀器
電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生物化儀器廠);SHE-III 型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠);SP-754PC 型分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);960 型熒光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);KQ3200DB 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH-6 電熱恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)。
1.4試驗(yàn)方法
1.4.1黃酮的提取植物烘干至恒重后粉碎過(guò) 70 目篩,稱取 100 g 用石油醚按料液比1 g ∶10 mL浸提過(guò)夜脫脂脫色,蒸干備用。準(zhǔn)確稱取處理后樣品50 g,超聲輔助70%乙醇浸提(料液比1 g ∶10 mL,70 ℃,60 min,100 W),真空過(guò)濾后,將濾液進(jìn)行真空濃縮至約20 mL,得總黃酮粗提取物。用70%乙醇將粗提黃酮定容至100 mL容量瓶得樣品總黃酮溶液,再?gòu)?00 mL中取5 mL溶液用70%乙醇定容至50 mL容量瓶中為備用液。
1.4.2體外降脂試驗(yàn)降脂試驗(yàn)根據(jù)霍世欣等的方法[8]稍有修改。脂肪酶催化脂肪分解,生成脂肪酸,以酚酞作指示劑,用 0.05 mol/L NaOH 溶液滴定。通過(guò)比較有無(wú)抑制劑(提取液)加入的情況下,脂肪酶活性的差異,可得提取物對(duì)脂肪酶的抑制率,體現(xiàn)降脂活性的大小,并與含量進(jìn)行相關(guān)性比較。endprint
抑制率=抑制脂肪酶活性/脂肪酶活性×100%(1)
脂肪酶活性測(cè)定法:取 100 mL 三角瓶,加入 5 mL 0.025 mol/L 磷酸緩沖液(pH值7.4)和 4 mL 聚乙烯醇三油酸甘油酯乳化液(0.22 g/mL 聚乙烯醇,油酸甘油酯 1 mL 混合,高速攪拌均勻,得乳白色乳化液)作為底物,置于 37 ℃水浴中反應(yīng) 10 min。加入 1 mL 脂肪酶(2 mg/mL),準(zhǔn)確反應(yīng) 15 min 后,加95%乙醇終止反應(yīng)。加酚酞 2 ~3 滴,用 0.05 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色,平行試驗(yàn)3次??瞻自囼?yàn)的酶液在反應(yīng)終止后加入。
1.4.3糖基化試驗(yàn)在蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)體系中加入粗提黃酮進(jìn)行藥物干預(yù)試驗(yàn),分別于1、3、6、9、12、15 d用熒光分光度計(jì)測(cè)定熒光值,繪制動(dòng)態(tài)曲線,加氨基胍作陽(yáng)性對(duì)照,加水作陰性對(duì)照,進(jìn)行抑制能力分析;以氨基胍作參比,計(jì)算粗提物對(duì)非酶糖基化終末產(chǎn)物的抑制率,并與含量進(jìn)行相關(guān)性分析。具體試驗(yàn)過(guò)程如下:
(1)反應(yīng)液配制:根據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法稍加修改,將乙二醛(GXL)12 mg/mL、牛血清白蛋白(BSA)20 mg/mL和EDTA 1 mol/L,在pH值7.4的磷酸緩沖液(PBS)0.2 mol/L中混合而成,備用。
(2)蛋白質(zhì)非酶糖基化的藥物干預(yù)試驗(yàn):根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法稍加修改,將提取液1 mL(濃度為1 mg/mL)與PBS 1 mL 在90 ℃下混合,40 min(以去除乙醇)后加入反應(yīng)液 1 mL,分別于37 ℃ 水浴避光孵育1、3、6、9、12、15 d,重復(fù)3次。氨基胍1 mL(0.1 mg/mL)與反應(yīng)液做陽(yáng)性對(duì)照,蒸餾水 1 mL 與反應(yīng)液作空白對(duì)照。
(3)抑制率的測(cè)定:根據(jù)糖基化終產(chǎn)物有自發(fā)熒光的特性,采用熒光法測(cè)定熒光值,將抑制率與含量進(jìn)行相關(guān)性分析。測(cè)定條件:激發(fā)波長(zhǎng)365 nm,發(fā)射波長(zhǎng)440 nm[11],狹縫10 nm,靈敏度1。
I=(B-A)/A×100%(2)
式中:I為抑制率,A為空白對(duì)照熒光強(qiáng)度,B為樣品熒光強(qiáng)度。
2結(jié)果與分析
2.1體外降脂試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果
蛇接骨草提取物的體外降脂效果最好,抑制率達(dá)到72.57%,最低的是荷葉,抑制率僅為 30.64%,兩者差異極顯著(P<0.01),其他植物的抑制率依次為蘆薈>綠茶>三葉草>銀杏>菝葜>青錢柳>魚腥草。
種植物粗黃酮降脂效果
樣品抑制率(%)青錢柳36.74±9.77Bbc銀杏47.51±6.85Bb蘆薈66.73±12.7Aa荷葉30.64±8.06Bc蛇接骨草72.57±4.68Aa菝葜41.10±14.06Bbc魚腥草32.39±3.24Bc三葉草64.75±4.10Aa綠茶66.51±1.61Aa注:同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
2.2非酶糖基化試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果
隨著時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度逐步增高,各提取物的抑制能力增強(qiáng)。在15 d時(shí),抑制糖基化反應(yīng)能力最強(qiáng)的是蘆薈黃酮提取物,其抑制率達(dá)到95.37%,另外銀杏黃酮達(dá)到80.46%、綠茶黃酮達(dá)到80.51%,與氨基胍抑制率相當(dāng)。表29種植物粗黃酮抑制糖基化結(jié)果
樣品抑制率(%)1 d3 d6 d9 d12 d15 d青錢柳16.42±4.06**41.39±2.54**53.31±3.24*62.92±2.9267.06±0.6972.72±0.62銀杏13.82±3.85**56.34±3.57*67.59±3.4265.96±4.9374.92±7.3280.46±6.94綠茶13.44±1.66**53.66±3.57*66.14±3.0778.06±4.8178.41±1.6780.51±3.87蘆薈78.43±1.4880.21±1.9686.79±4.3189.07±3.2794.89±1.9295.37±4.21*荷葉21.13±1.52**46.34±3.57**55.93±3.50*64.20±4.4365.87±1.3767.49±3.02蛇接骨草10.37±14.84**14.62±4.79**18.12±14.98**27.18±6.68**37.70±8.26**44.10±3.55**菝葜18.03±6.19**36.45±6.08**55.86±1.14*56.07±3.39*58.02±2.3462.31±2.77三葉草25.30±9.52**26.22±6.81**26.79±1.23**26.90±11.96**27.08±17.42**28.08±9.32**魚腥草20.15±3.45**39.16±2.15**42.56±3.54**50.86±8.06*53.45±9.81*63.15±5.68氨基胍71.72±3.8874.76±4.1280.28±2.4080.36±5.5982.22±6.9484.26±1.95注:與氨基胍相比,*表示P<0.05,** 表示P<0.01。
3討論
本研究黃酮對(duì)脂肪酶活性抑制作用測(cè)定的方法為滴定法,利用脂肪酶催化脂肪水解為脂肪酸和甘油,再使用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液結(jié)合指示劑對(duì)產(chǎn)物脂肪酸進(jìn)行酸堿滴定(或直接用pH酸度計(jì)代替指示劑),由耗堿量求出脂肪酶的活性。耗堿量少,說(shuō)明脂肪酸產(chǎn)生量少,推斷脂肪酶活性受到抑制。在本試驗(yàn)中,加入黃酮試驗(yàn)組消耗的NaOH少于未加植物黃酮試驗(yàn)組,9種不同植物中提取的黃酮均對(duì)脂肪酶活性有一定抑制作用,能減少體內(nèi)游離脂肪酸的產(chǎn)生,表明黃酮可能通過(guò)抑制脂肪酶活性降低血脂水平,從而在一定程度上能預(yù)防心血管等相關(guān)疾病。
蛋白質(zhì)糖基化在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生中占有非常重要的地位。在非酶促條件下,蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類或核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基酸可以與還原糖的羰基經(jīng)過(guò)縮合、重排、裂解、氧化修飾后產(chǎn)生一組穩(wěn)定的糖基化終產(chǎn)物(AGEs)[12]。研究表明,滲出血管的可溶性蛋白與血管基質(zhì)成分通過(guò)AGEs互相交聯(lián),如血漿低密度脂蛋白(LDL)滲出與血管壁細(xì)胞交聯(lián)堆積,影響LDL彌散出內(nèi)膜而產(chǎn)生血管病變。血漿蛋白與腎小球底膜交聯(lián),引起毛細(xì)血管基底膜進(jìn)行性增厚和微血管阻塞[13]。endprint
以往人們對(duì)糖尿病的治療重點(diǎn)放在對(duì)血糖的控制上,但隨著研究的深入,蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)與糖尿病并發(fā)癥的關(guān)系日益受到人們的重視。體內(nèi)蛋白質(zhì)的非酶糖基化反應(yīng)與很多并發(fā)癥的病理機(jī)制有關(guān),如糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病眼病、糖尿病性腎病等。蛋白質(zhì)非酶糖基化并不會(huì)因?yàn)檠堑玫娇刂贫V?,依然?huì)造成糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展,即所謂的“高血糖記憶”狀態(tài)。通過(guò)阻斷非酶糖化反應(yīng)從而防治上述疾病的發(fā)生發(fā)展是近年來(lái)藥物治療學(xué)領(lǐng)域研究的新方向[14]。
黃酮具有多種生物活性,如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等。本研究對(duì) 9 種天然植物的黃酮提取物進(jìn)行了體外降脂和非酶糖基化的研究。發(fā)現(xiàn)蛇接骨草、綠茶、三葉草的體外降脂作用比較明顯;而非酶糖基化的研究表明蘆薈對(duì)非酶糖基化的抑制率較高,且各種植物黃酮提取物對(duì)非酶糖基化的抑制率都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng),與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致。盡管體外試驗(yàn)表明 9 種植物的黃酮具有體外降脂和對(duì)非酶糖基化抑制作用,但黃酮對(duì) AGEs 的抑制作用機(jī)制目前研究的不是很清楚,還有待進(jìn)一步研究。
4結(jié)論
試驗(yàn)中9種植物的黃酮提取物均對(duì)脂肪酶有一定的抑制作用,綠茶、蛇接骨草、三葉草對(duì)脂肪酶抑制率均在60%以上,其余的多在30%~50%之間。這些植物提取物的抗氧化作用機(jī)制可能是因?yàn)辄S酮類化合物能減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基,從而抑制脂質(zhì)氧化。
從非酶糖基化試驗(yàn)中可以看到,觀察1~15 d的抑制率記錄可發(fā)現(xiàn),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),各樣品的熒光強(qiáng)度逐步增高,提示各提取物的抑制能力增強(qiáng)。且觀察15 d時(shí)的最終抑制率可發(fā)現(xiàn),除了三葉草,其他植物的黃酮提取物均對(duì)蛋白非酶糖基化反應(yīng)具有一定的抑制作用,其中以蘆薈的抑制作用最強(qiáng),抑制率均達(dá)到95%以上。
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以往人們對(duì)糖尿病的治療重點(diǎn)放在對(duì)血糖的控制上,但隨著研究的深入,蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)與糖尿病并發(fā)癥的關(guān)系日益受到人們的重視。體內(nèi)蛋白質(zhì)的非酶糖基化反應(yīng)與很多并發(fā)癥的病理機(jī)制有關(guān),如糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病眼病、糖尿病性腎病等。蛋白質(zhì)非酶糖基化并不會(huì)因?yàn)檠堑玫娇刂贫V梗廊粫?huì)造成糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展,即所謂的“高血糖記憶”狀態(tài)。通過(guò)阻斷非酶糖化反應(yīng)從而防治上述疾病的發(fā)生發(fā)展是近年來(lái)藥物治療學(xué)領(lǐng)域研究的新方向[14]。
黃酮具有多種生物活性,如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等。本研究對(duì) 9 種天然植物的黃酮提取物進(jìn)行了體外降脂和非酶糖基化的研究。發(fā)現(xiàn)蛇接骨草、綠茶、三葉草的體外降脂作用比較明顯;而非酶糖基化的研究表明蘆薈對(duì)非酶糖基化的抑制率較高,且各種植物黃酮提取物對(duì)非酶糖基化的抑制率都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng),與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致。盡管體外試驗(yàn)表明 9 種植物的黃酮具有體外降脂和對(duì)非酶糖基化抑制作用,但黃酮對(duì) AGEs 的抑制作用機(jī)制目前研究的不是很清楚,還有待進(jìn)一步研究。
4結(jié)論
試驗(yàn)中9種植物的黃酮提取物均對(duì)脂肪酶有一定的抑制作用,綠茶、蛇接骨草、三葉草對(duì)脂肪酶抑制率均在60%以上,其余的多在30%~50%之間。這些植物提取物的抗氧化作用機(jī)制可能是因?yàn)辄S酮類化合物能減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基,從而抑制脂質(zhì)氧化。
從非酶糖基化試驗(yàn)中可以看到,觀察1~15 d的抑制率記錄可發(fā)現(xiàn),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),各樣品的熒光強(qiáng)度逐步增高,提示各提取物的抑制能力增強(qiáng)。且觀察15 d時(shí)的最終抑制率可發(fā)現(xiàn),除了三葉草,其他植物的黃酮提取物均對(duì)蛋白非酶糖基化反應(yīng)具有一定的抑制作用,其中以蘆薈的抑制作用最強(qiáng),抑制率均達(dá)到95%以上。
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以往人們對(duì)糖尿病的治療重點(diǎn)放在對(duì)血糖的控制上,但隨著研究的深入,蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)與糖尿病并發(fā)癥的關(guān)系日益受到人們的重視。體內(nèi)蛋白質(zhì)的非酶糖基化反應(yīng)與很多并發(fā)癥的病理機(jī)制有關(guān),如糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病眼病、糖尿病性腎病等。蛋白質(zhì)非酶糖基化并不會(huì)因?yàn)檠堑玫娇刂贫V?,依然?huì)造成糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展,即所謂的“高血糖記憶”狀態(tài)。通過(guò)阻斷非酶糖化反應(yīng)從而防治上述疾病的發(fā)生發(fā)展是近年來(lái)藥物治療學(xué)領(lǐng)域研究的新方向[14]。
黃酮具有多種生物活性,如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等。本研究對(duì) 9 種天然植物的黃酮提取物進(jìn)行了體外降脂和非酶糖基化的研究。發(fā)現(xiàn)蛇接骨草、綠茶、三葉草的體外降脂作用比較明顯;而非酶糖基化的研究表明蘆薈對(duì)非酶糖基化的抑制率較高,且各種植物黃酮提取物對(duì)非酶糖基化的抑制率都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng),與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致。盡管體外試驗(yàn)表明 9 種植物的黃酮具有體外降脂和對(duì)非酶糖基化抑制作用,但黃酮對(duì) AGEs 的抑制作用機(jī)制目前研究的不是很清楚,還有待進(jìn)一步研究。
4結(jié)論
試驗(yàn)中9種植物的黃酮提取物均對(duì)脂肪酶有一定的抑制作用,綠茶、蛇接骨草、三葉草對(duì)脂肪酶抑制率均在60%以上,其余的多在30%~50%之間。這些植物提取物的抗氧化作用機(jī)制可能是因?yàn)辄S酮類化合物能減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基,從而抑制脂質(zhì)氧化。
從非酶糖基化試驗(yàn)中可以看到,觀察1~15 d的抑制率記錄可發(fā)現(xiàn),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),各樣品的熒光強(qiáng)度逐步增高,提示各提取物的抑制能力增強(qiáng)。且觀察15 d時(shí)的最終抑制率可發(fā)現(xiàn),除了三葉草,其他植物的黃酮提取物均對(duì)蛋白非酶糖基化反應(yīng)具有一定的抑制作用,其中以蘆薈的抑制作用最強(qiáng),抑制率均達(dá)到95%以上。
參考文獻(xiàn):
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