親水作用液相色譜法測定板藍(lán)根顆粒中腺苷含量

李媛媛+馬玉龍+李嬌

摘要：采用自制的負(fù)載納米碳（CNPs）的親水色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm 粒徑，10 nm 孔徑），建立了親水作用液相色譜法（HILIC）測定板藍(lán)根配方顆粒中腺苷含量的方法。結(jié)果表明：腺苷濃度在 2.5～20.0 μg/mL時，腺苷濃度與親水作用液相色譜法測定的峰值線性關(guān)系良好，平均回收率97.63%，RSD=4.08%（n=9）。所建立的親水作用液相色譜法分離效果好、快速簡便、準(zhǔn)確，結(jié)果可靠，可為進(jìn)一步完善板藍(lán)根顆粒制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：親水作用液相色譜；板藍(lán)根顆粒；腺苷；方法學(xué)驗證

中圖分類號： O655；O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0284-03

收稿日期：2013-09-29

基金項目：寧夏大學(xué)科學(xué)研究基金（編號：ZR1207）。

作者簡介：李媛媛（1980—），女，寧夏中寧人，博士，講師，主要從事天然植物和藥物有效成分的分析與分離研究工作。E-mail：liyy@nxu.edu.cn。板藍(lán)根顆粒為板藍(lán)根單味藥材水提醇沉加工而成，具有清熱解毒、涼血利咽之功效[1]。板藍(lán)根配方顆粒作為防病治病的物質(zhì)載體，是一個極其復(fù)雜的混合物體系，其主要化學(xué)成分有：靛藍(lán)、靛玉紅、丁香酸、喹唑酮酸、精氨酸等[2]。目前，中國藥典對板藍(lán)根的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只檢測告依春。有報道采用測定靛藍(lán)或靛玉紅的含量來控制其質(zhì)量[3]，由于板藍(lán)根顆粒采用水提醇沉工藝，而靛藍(lán)或靛玉紅為脂溶性成分，因此靛藍(lán)或靛玉紅含量的多少難以客觀、準(zhǔn)確地表征該制劑的內(nèi)在質(zhì)量。已有研究結(jié)果表明，板藍(lán)根配方顆粒中水溶性核苷類成分——腺苷也是板藍(lán)根中抗病毒的活性成分之一，具有抗凝血、擴張冠狀動脈、松弛支氣管平滑肌、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)和抗心率不齊的作用，并且其含量能夠反映板藍(lán)根中核苷類的含量水平，可以作為評價板藍(lán)根配方顆粒的一種指標(biāo)[4]。

關(guān)于核苷類物質(zhì)含量測定的常用方法是RPLC法和CZE法，但是RPLC只是依靠單一的疏水作用力來實現(xiàn)物質(zhì)的分離，對極性物質(zhì)無法保留或者保留很弱。雖然可以使用正向色譜來分析，但是正相色譜通常使用非極性的溶劑做流動相，極性的分析物很難溶解于非極性的流動相，而且與質(zhì)譜也不兼容。因此，極大的限制了正相色譜的應(yīng)用。親水作用色譜（HILIC），是一種新型的色譜模式。類似于正相色譜，在親水色譜柱上，極性化合物有強保留。不同之處在于，正相色譜所使用的非極性流動相體系被水和有機溶劑的體系所代替。這樣就可以解決極性和親水性分析物在正相色譜體系中不溶解的問題，并且與質(zhì)譜也有好的兼容性[5-7]。親水作用色譜，作為對反相色譜的補充和正相色譜的替代，已經(jīng)顯示出巨大的優(yōu)越性和潛力，成為分析極性和親水性化合物的一種強有力的色譜技術(shù)[8-9]。

目前，使用親水作用色譜檢測板藍(lán)根中腺苷含量未見報道。本研究在自制的親水作用色譜柱上，固定相以硅膠為載體，負(fù)載納米碳（CNPs）作為固定相[10]，應(yīng)用HILIC法測定板藍(lán)根中腺苷含量，為完善板藍(lán)根的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

色譜分析在瓦里安高效液相色譜儀 （Varian，美國） 上完成。儀器由2臺 Prostar 210型高壓梯度泵、1個77251型進(jìn)樣閥（配備20 μL進(jìn)樣環(huán)）、1臺Prostar 325型紫外檢測器和1套色譜數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（Starws）組成。超聲清洗器購買于昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

試驗過程中使用的超純水均來自MILLI-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，Bedford，MA，美國）。高效液相色譜儀器的流動相為乙腈 （色譜級，迪馬科技，美國） 和超純水的混合物，流動相和測試化合物在使用前均使用0.45 μm的過濾膜過濾。對照品腺苷購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。板藍(lán)根顆粒1袋（10 g），市售。

1.2腺苷保留行為考察

在HILIC中，流動相的洗脫強度對極性和親水性化合物的保留有最大的影響，因為隨著流動相極性的減小，親水作用逐漸增強。如圖1所示，當(dāng)流動相中乙腈含量從50%增加到80%時，腺苷的保留值逐漸增加。當(dāng)乙腈含量增加至80%以上時，腺苷的保留值顯著增加，這主要受親水作用控制，是典型的HILIC 的特征。當(dāng)流動相中乙腈含量小于50%時，化合物的保留隨著流動相中乙腈含量的減少而增加，這主要受疏水作用控制。當(dāng)流動相中乙腈含量為50% 時，分析物在固定相上的保留是最弱的，這是RPLC和HILIC兩種色譜模式的分界線。因為當(dāng)乙腈含量為50% 時，水和乙腈都在固定相表面達(dá)到飽和，液液分配作用或者吸附作用都是最弱的。類似的“U”形保留曲線，在許多親水固定相上觀察到[11-12]，這是混合保留模式的典型特征。

1.3色譜條件

色譜柱為自制的固載CNPs的硅膠柱（150 mm×4.6 mm，5 μm 粒徑，10 nm 孔徑）；流動相為乙腈-水（90 ∶10，體積比）；流速1.0 mL/min；室溫；檢測波長 254 nm。在此條件下，樣品中腺苷與其他組分獲得了滿意的分離效果，分離結(jié)果見圖2。

2結(jié)果與分析

2.1腺苷濃度與色譜峰面積的線性關(guān)系

精確稱取腺苷對照品10 mg，置10 mL容量瓶中，以乙腈-水（50 ∶50，體積比）溶解，定容，搖勻即得腺苷對照品貯備液。再分別精確量取對照品貯備液 25、50、75、100、125、150、175、200 μL置10 mL量瓶中，用 50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，分別吸取10 μL 注入液相色譜儀，測定峰面積值，并以對照品的濃度 X（μg/mL）與峰面積Y（mAU）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=2.643×105X-1.454×105，r=0.999 1。說明腺苷濃度在 2.5～20.0 μg/mL時，液相色譜測定的峰面積值與腺苷濃度線性關(guān)系良好。endprint

2.2腺苷提取方法

分別精確稱取同一批號的板藍(lán)根顆粒3份各1.0 g，分別加超純水、50%乙腈、20% 乙腈適量，超聲溶解，再分別加入上述溶劑至刻度，搖勻，用微孔濾膜過濾，進(jìn)樣。結(jié)果表明超純水提取最完全，含腺苷最高。然后再分別精確稱取同一批號的板藍(lán)根顆粒3份各1.0 g，加入超純水10 mL，分別超聲提取40、60、80 min，提取結(jié)束后，加超純水補足，過濾，取濾液檢測。腺苷的提取量隨超聲提取時間增加而增多，但到60 min后提取效率不再增加，因此，板藍(lán)根顆粒采用超純水超聲處理 60 min 提取腺苷。

2.3精密度

取腺苷對照品溶液10 μL，進(jìn)行親水作用液相色譜法測定，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果表明，RSD為1.69%。表明儀器精密度良好。

2.4穩(wěn)定性

取板藍(lán)根顆粒樣品，研細(xì)，精確稱取適量（約1.0 g）置 10 mL 量瓶中，加適量水，超聲處理60 min，搖勻，加水至刻度，0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。精確吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，結(jié)果顯示，RSD為1.24%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5重現(xiàn)性

精確稱取同一批號的板藍(lán)根顆粒5份，約每份1.0 g，制備供試品溶液，測定腺苷含量，RSD為3.94%（n=5），表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6回收率

精確稱取已知腺苷含量的供試樣品9份，每份約0.5 g，分別精確加入腺苷對照品溶液。由表1可知，腺苷平均回收率為97.63%。表1腺苷回收率測定結(jié)果

編號板藍(lán)根顆粒

（g）板藍(lán)根顆粒中腺苷量

（μg/mL）加入腺苷對照品量

（μg/mL）測得量

（μg/mL）回收率

（%）RSD

（%）10.499 96.6695.00011.82103.0020.500 86.6815.00011.70100.4030.500 06.6705.00011.72100.9040.501 26.68610.00015.7690.7150.502 06.69710.00016.1694.6660.499 66.66510.00016.6499.8170.501 66.69116.00022.4298.2880.500 46.67516.00021.6293.3990.501 66.69116.00022.2897.42平均97.634.08

2.7樣品含量測定結(jié)果

分別對不同廠家生產(chǎn)的板藍(lán)根顆粒進(jìn)行親水作用液相色譜法測定，結(jié)果（表2）表明，不同廠家生產(chǎn)的板藍(lán)根顆粒中腺苷含量差異很大，即使是同一廠家生產(chǎn)的不同批次的板藍(lán)根顆粒之間也存在較大差異。因此，板藍(lán)根制劑的批次間穩(wěn)定性有待提高，以保障板藍(lán)根臨床用藥的療效。

表2親水作用液相色譜法測定的板藍(lán)根顆粒中腺苷含量

廠家板藍(lán)根取樣量

（g）腺苷測得量

（μg）腺苷含量

（μg/g）A0.999 3289.030289.23B0.999 1220.630220.83C1.000 6133.490133.41D（Ⅰ）1.006 3105.750105.09D（Ⅱ）1.000 925.46125.438D（Ⅲ）0.999 575.13175.168

3結(jié)論

腺苷為板藍(lán)根配方顆粒中的活性成分之一，由于板藍(lán)根顆粒大部分是水溶性，常用的RPLC法對于一些強極性和水溶性物質(zhì)無法保留，或者需要使用高的緩沖濃度。本試驗首次使用親水作用色譜法，在低的緩沖濃度體系中，對板藍(lán)根顆粒中腺苷含量進(jìn)行了測定。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，采用自制的固載 CNPs 的硅膠固定相，對其中水溶性成分腺苷作為含量測定的指標(biāo)成分。結(jié)果表明：HILIC法是一種適用于強極性和強親水性樣品定性定量分析的可靠手段，該方法方便快捷，測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，可為進(jìn)一步完善該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

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