中藥訶子的抑菌作用及超微構(gòu)

劉偉+唐金花+周麗威+等

摘要：采用牛津杯法對14種中草藥進行抑菌活性篩選，利用液體稀釋法考察中藥訶子（Fructus chebulae）對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度，觀察中藥訶子作用下3種菌株的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明：訶子、黃芩、大蒜、蒼術(shù)、青蒿、石榴皮、百部、茵陳、干姜等9種中草藥對3種細(xì)菌都有抑制作用；連翹、夏枯草、白頭翁、大黃、附子等5種中草藥對3細(xì)菌則未見抑制作用。透射電鏡下觀察表明，經(jīng)中藥訶子作用4.5 h后，大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯分離，細(xì)胞質(zhì)固縮，細(xì)胞中間出現(xiàn)腔隙。

關(guān)鍵詞：訶子；抑菌作用；超微結(jié)構(gòu)；最低抑菌濃度

中圖分類號： R285文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0281-03

收稿日期：2013-09-24

基金項目：吉林省財政專項。

作者簡介：劉偉（1980—），吉林大安人，講師，從事植物病理學(xué)研究。E-mail：lwtong@163.com。

通信作者：唐金花，講師，從事植物病理學(xué)研究。E-mail：hit1102tjh@aliyun.com。隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問題日益突出，開發(fā)新的抗菌藥物成為新的研究熱點[1]。由于中藥具有特殊的抗菌機理及活性成分，細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性，因此，關(guān)于中藥抗菌活性研究也越來越引起人們的關(guān)注。苦參、蒲公英、黃芩等多種中藥都具有抗菌作用[2-4]。中藥訶子（Fructus chebulae）別稱訶梨或隨風(fēng)子，為雙子葉植物綱使君子科植物訶子的干燥果實，具有抗氧化、抗癌、降血糖、抗病毒、澀腸、斂肺、降火利咽等功效[5]。本研究通過牛津杯法、液體稀釋法，研究訶子的抑菌作用及超微結(jié)構(gòu)，旨在為開發(fā)利用訶子資源提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料訶子、黃芩、大蒜、蒼術(shù)、青蒿、石榴皮、百部、茵陳、干姜、連翹、夏枯草、白頭翁、大黃、附子等14種中草藥飲片均購于吉林省通化市老百姓大藥房。

1.1.2試驗菌株大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginos）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供。

1.1.3培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基配方：酵母浸膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，水1 000 mL，pH值7.2。

1.2方法

1.2.1中藥水提物將14種中草藥飲片共500 g粉碎，過200目篩，用5倍量蒸餾水冷浸3次，每次24 h，合并提取液并減壓濃縮成浸膏狀，經(jīng)細(xì)菌過濾器除菌，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2菌懸液制備將各菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 130 r/min搖床擴大培養(yǎng)至對數(shù)生長期，利用血球計數(shù)板法將各菌株用培養(yǎng)基配制成濃度為100萬CFU/mL的菌懸液。

1.2.314種中草藥抑菌活性篩選將各種中草藥水提物稀釋成5 g/mL備用。取濃度為100萬CFU/mL的各菌液1 mL分別加入25 mL LB瓊脂培養(yǎng)基，混勻倒入平皿中，然后將滅菌的牛津杯置于培養(yǎng)基上。再將各種中草藥溶液加入牛津小杯中，每個牛津小杯中加入200 μL，陰性對照為LB液體培養(yǎng)基。將平皿置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h后取出。測量抑菌圈半徑，重復(fù)3次，計算平均值，考察不同中草藥的抑菌活性[6]。

1.2.4中藥訶子對3種菌株的敏感性試驗將中藥訶子分別稀釋成5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 g/mL濃度后加入濃度為100萬CFU/mL的各菌液牛津小杯中，以LB液體培養(yǎng)基為陰性對照，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察，測量抑菌圈半徑，重復(fù)3次，計算平均值，確定最低抑菌濃度（MIC）[7]。最低抑菌濃度（MIC）是指藥物完全抑制某種微生物生長的最低濃度。

1.2.5掃描電鏡觀察將100萬CFU/mL大腸桿菌懸液加入0.625 g/mL訶子藥液中，37 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng) 4.5 h 后離心棄上清，用磷酸緩沖液洗滌沉淀3次，用戊二醛將沉淀固定2 h，按照掃描電鏡生物樣品制備方法[8]將沉淀制成標(biāo)本，于KYKY-1000B掃描電鏡下觀察。正常未加藥液的大腸桿菌同上制備作為對照。

1.2.6透射電鏡觀察將0.625 g/mL訶子藥液作用的大腸桿菌培養(yǎng)4.5 h后離心取樣，用磷酸緩沖液洗滌沉淀3次，將沉淀用戊二醛固定2 h，按照透射電鏡樣品制備方法制備樣品[9]，在JEM-2000EX透射電鏡下觀察。正常未加藥液的大腸桿菌同上制備作為對照。

2結(jié)果與分析

2.114種中草藥的抑菌效果

訶子、黃芩、大蒜、蒼術(shù)、青蒿、石榴皮、百部、茵陳、干姜等9種中草藥對3種細(xì)菌都有抑制作用。連翹、夏枯草、白頭翁、大黃、附子等5種中草藥對3種細(xì)菌則未見抑制作用。訶子、黃芩、大蒜、蒼術(shù)對3種細(xì)菌的抑制作用明顯，其中訶子對所有菌株的抑制作用最為明顯，抑菌圈半徑均達到1.4 cm以上。因此，接下來試驗選用訶子作進一步研究。

4種中草藥水提物的抑菌作用

中草藥抑菌圈半徑（cm）大腸桿菌綠濃桿菌金黃色葡萄球菌訶子1.41.41.5黃芩1.01.00.9大蒜1.01.00.9蒼術(shù)1.01.0 0.8青蒿0.70.80.6石榴皮0.60.60.6百部0.60.60.5茵陳0.60.50.5干姜0.50.60.5連翹夏枯草白頭翁大黃附子注：空白表示沒有抑菌圈出現(xiàn)。

2.2訶子水提物對3種細(xì)菌的抑菌作用及最低抑菌濃度

訶子水提物對大腸桿菌、綠膿桿菌（革蘭氏陰性菌）、金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）都有明顯的抑菌作用，抑菌譜廣。圖1表明，訶子濃度與抑菌效果成正相關(guān)。采用液體倍比稀釋法得出，大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為0.625 g/mL，在此濃度下對大腸桿菌的抑菌圈半徑為0.55 cm。 表2不同濃度訶子水提物的抑菌作用endprint

菌株抑菌圈半徑（cm）5 g/mL2.5 g/mL 1.25 g/mL0.625 g/mL0.312 5 g/mL陰性對照大腸桿菌1.451.201.050.75綠膿桿菌1.551.351.150.80金黃色葡萄球菌1.501.250.650.55注：空白表示沒有抑菌圈出現(xiàn)。

2.3訶子水提物對大腸桿菌形態(tài)的影響

描電鏡下觀察表明，未受藥物作用的大腸桿菌菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，菌體形態(tài)光滑而規(guī)則。經(jīng)中藥訶子作用4.5 h后，大腸桿菌菌體的兩端向中間凹陷，同樣放大倍數(shù)下比未受藥物作用的菌體明顯縮短）。

2.4訶子水提物對大腸桿菌結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡下觀察表明，未受藥物作用的大腸桿菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整、緊密，細(xì)胞基質(zhì)均勻。經(jīng)中藥訶子作用4.5 h后，大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁明顯分離，部分細(xì)胞壁破損，菌體的細(xì)胞質(zhì)固縮。這與王關(guān)林等的研究結(jié)論[2]相似。可見不同中藥對不同菌體可能存在相同的作用機制。

3結(jié)論

本研究表明，訶子、黃芩、大蒜、蒼術(shù)等中草藥對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果均較好，以中藥訶子的抑菌效果最為明顯。訶子濃度與抑菌效果成正相關(guān)，對3種菌株的最低抑菌濃度均為0.625 g/mL。透射電鏡下觀察表明，經(jīng)中藥訶子作用4.5 h后，大腸埃希氏桿菌細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯分離，細(xì)胞質(zhì)固縮，細(xì)胞中間出現(xiàn)腔隙，這可能是因為經(jīng)訶子作用后，細(xì)胞質(zhì)中間的腔隙使得中間部位壓力比菌體兩端壓力小，造成菌體縊縮。訶子作為傳統(tǒng)的抗菌藥物，其毒副作用小、來源廣、價格低廉，較少出現(xiàn)耐藥性，對3種致病菌有很強的抑制作用。

參考文獻：

[1]劉華鋼，申慶榮，劉麗敏. 中藥抗菌作用研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21（2）：463-465.

[2]王關(guān)林，唐金花，蔣丹，等. 苦參對雞大腸桿菌的抑菌作用及其機理研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（5）：1018-1024.

[3]劉華，吳國榮，孫曉明，等. 不同生境下的蒲公英及其不同器官的分段提取物抑菌作用比較研究[J]. 中國野生植物資源，2001，20（3）：35-36.

[4]張秀娟，李津明，霍明，等. 黃芩水煎液黃芩甙去黃芩甙水煎液抑菌試驗比較[J]. 黑龍江商學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，1997，13（4）：6-9.

[5]張蕊. 訶子的提取工藝優(yōu)化與抑菌活性研究[J]. 畜牧與飼料科學(xué)，2013，34（5）：13-16.

[6]陳曙霞. 苦參生物堿的藥理研究進展[J]. 中成藥，2003，25（1）：75-77.

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[8]湯雪明，戴書文. 生物樣品的環(huán)境掃描電鏡觀察[J]. 電子顯微學(xué)報，2001，20（3）：217-223.

[9]朱麗霞. 生物學(xué)中的電子顯微鏡技術(shù)[M].endprint

菌株抑菌圈半徑（cm）5 g/mL2.5 g/mL 1.25 g/mL0.625 g/mL0.312 5 g/mL陰性對照大腸桿菌1.451.201.050.75綠膿桿菌1.551.351.150.80金黃色葡萄球菌1.501.250.650.55注：空白表示沒有抑菌圈出現(xiàn)。

2.3訶子水提物對大腸桿菌形態(tài)的影響

描電鏡下觀察表明，未受藥物作用的大腸桿菌菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，菌體形態(tài)光滑而規(guī)則。經(jīng)中藥訶子作用4.5 h后，大腸桿菌菌體的兩端向中間凹陷，同樣放大倍數(shù)下比未受藥物作用的菌體明顯縮短）。

2.4訶子水提物對大腸桿菌結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡下觀察表明，未受藥物作用的大腸桿菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整、緊密，細(xì)胞基質(zhì)均勻。經(jīng)中藥訶子作用4.5 h后，大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁明顯分離，部分細(xì)胞壁破損，菌體的細(xì)胞質(zhì)固縮。這與王關(guān)林等的研究結(jié)論[2]相似?？梢姴煌兴帉Σ煌w可能存在相同的作用機制。

3結(jié)論

本研究表明，訶子、黃芩、大蒜、蒼術(shù)等中草藥對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果均較好，以中藥訶子的抑菌效果最為明顯。訶子濃度與抑菌效果成正相關(guān)，對3種菌株的最低抑菌濃度均為0.625 g/mL。透射電鏡下觀察表明，經(jīng)中藥訶子作用4.5 h后，大腸埃希氏桿菌細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯分離，細(xì)胞質(zhì)固縮，細(xì)胞中間出現(xiàn)腔隙，這可能是因為經(jīng)訶子作用后，細(xì)胞質(zhì)中間的腔隙使得中間部位壓力比菌體兩端壓力小，造成菌體縊縮。訶子作為傳統(tǒng)的抗菌藥物，其毒副作用小、來源廣、價格低廉，較少出現(xiàn)耐藥性，對3種致病菌有很強的抑制作用。

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[9]朱麗霞. 生物學(xué)中的電子顯微鏡技術(shù)[M].endprint

菌株抑菌圈半徑（cm）5 g/mL2.5 g/mL 1.25 g/mL0.625 g/mL0.312 5 g/mL陰性對照大腸桿菌1.451.201.050.75綠膿桿菌1.551.351.150.80金黃色葡萄球菌1.501.250.650.55注：空白表示沒有抑菌圈出現(xiàn)。

2.3訶子水提物對大腸桿菌形態(tài)的影響

描電鏡下觀察表明，未受藥物作用的大腸桿菌菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，菌體形態(tài)光滑而規(guī)則。經(jīng)中藥訶子作用4.5 h后，大腸桿菌菌體的兩端向中間凹陷，同樣放大倍數(shù)下比未受藥物作用的菌體明顯縮短）。

2.4訶子水提物對大腸桿菌結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡下觀察表明，未受藥物作用的大腸桿菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整、緊密，細(xì)胞基質(zhì)均勻。經(jīng)中藥訶子作用4.5 h后，大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁明顯分離，部分細(xì)胞壁破損，菌體的細(xì)胞質(zhì)固縮。這與王關(guān)林等的研究結(jié)論[2]相似?？梢姴煌兴帉Σ煌w可能存在相同的作用機制。

3結(jié)論

本研究表明，訶子、黃芩、大蒜、蒼術(shù)等中草藥對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果均較好，以中藥訶子的抑菌效果最為明顯。訶子濃度與抑菌效果成正相關(guān)，對3種菌株的最低抑菌濃度均為0.625 g/mL。透射電鏡下觀察表明，經(jīng)中藥訶子作用4.5 h后，大腸埃希氏桿菌細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯分離，細(xì)胞質(zhì)固縮，細(xì)胞中間出現(xiàn)腔隙，這可能是因為經(jīng)訶子作用后，細(xì)胞質(zhì)中間的腔隙使得中間部位壓力比菌體兩端壓力小，造成菌體縊縮。訶子作為傳統(tǒng)的抗菌藥物，其毒副作用小、來源廣、價格低廉，較少出現(xiàn)耐藥性，對3種致病菌有很強的抑制作用。

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[8]湯雪明，戴書文. 生物樣品的環(huán)境掃描電鏡觀察[J]. 電子顯微學(xué)報，2001，20（3）：217-223.

[9]朱麗霞. 生物學(xué)中的電子顯微鏡技術(shù)[M].endprint