分子標(biāo)記技術(shù)的產(chǎn)生與引物設(shè)計(jì)

摘要：基因組DNA堿基的轉(zhuǎn)換/顛換、插入/缺失及重排等變化會(huì)導(dǎo)致生物個(gè)體之間的差異，這種變化可能是發(fā)生在編碼區(qū)、非編碼區(qū)、內(nèi)切酶識(shí)別序列、啟動(dòng)子、調(diào)控序列等，由此產(chǎn)生了各類(lèi)分子標(biāo)記技術(shù)。筆者基于分子標(biāo)記研究，從基因組堿基序列變化角度對(duì)各類(lèi)分子標(biāo)記產(chǎn)生的根源及引物設(shè)計(jì)等方面內(nèi)容進(jìn)行綜述，以期為更好掌握和運(yùn)用分子標(biāo)記提供參考。

關(guān)鍵詞：核苷酸；序列；差異；分子標(biāo)記；引物設(shè)計(jì)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0047-05

收稿日期：2013-09-06

基金項(xiàng)目：陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：NKC01-01）。

作者簡(jiǎn)介：張羽（1968—），女，陜西漢中人，碩士，副教授，從事遺傳學(xué)理論與實(shí)踐等教學(xué)和科研工作。E-mail：zy68169@sina.com。生物的遺傳信息都蘊(yùn)藏在堿基序列中，基因組堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及插入、缺失等變化會(huì)導(dǎo)致個(gè)體與個(gè)體之間的差異，即表現(xiàn)出生物的遺傳多樣性，這種特性既能傳遞又能以多種形式表現(xiàn)出來(lái)，這就是通常所說(shuō)的遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記具有可遺傳性和可識(shí)別性，人們可以通過(guò)追蹤生物的性狀、染色體、染色體某一片段、蛋白質(zhì)或DNA序列在家系中傳遞的規(guī)律和變化來(lái)研究生物的遺傳變異。因此，這種遺傳特性可以通過(guò)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生化及分子水平上的差異來(lái)表現(xiàn)，也就是說(shuō)生物任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標(biāo)記。DNA 分子標(biāo)記是以DNA分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，它反映了生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA 片段。與其他標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性：直接以DNA形式表現(xiàn)，既不受環(huán)境影響，也不受生物組織、發(fā)育時(shí)期影響；標(biāo)記的數(shù)量多、多態(tài)性高；表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能區(qū)別純合體和雜合體；成本不太高等。目前主要有基于分子雜交的DNA標(biāo)記技術(shù)和基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)兩大類(lèi)，基于分子雜交的DNA標(biāo)記技術(shù)主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）、可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeats，VNTR）、原位雜交（in situ hybridization，ISH）等；以PCR為核心的分子標(biāo)記技術(shù)主要有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSR）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）等。

1第1代分子標(biāo)記技術(shù)

1.1RFLP技術(shù)

1974年，RFLP技術(shù)第1次被用于遺傳分析[1-2]，它是一種以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)的第1代遺傳標(biāo)記，是最早的DNA標(biāo)記技術(shù)。RFLP技術(shù)的依據(jù)是限制性酶切位點(diǎn)上堿基的缺失/插入、重排和點(diǎn)突變而導(dǎo)致的基因型之間的限制性片段長(zhǎng)度差異，利用特定的限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割不同生物個(gè)體的基因組DNA。由于堿基組成不同，得到大小不等的酶切DNA片段，所產(chǎn)生的DNA數(shù)目和各個(gè)片段的長(zhǎng)度反映了DNA分子上不同酶切位點(diǎn)的分布情況，再通過(guò)凝膠電泳形成不同帶型，最后用經(jīng)標(biāo)記的相應(yīng)DNA探針與這些片段進(jìn)行雜交，通過(guò)放射自顯影而顯示出的圖譜就可以反映出不同個(gè)體基因組DNA序列之間的差異。如圖1所示，個(gè)體a1、個(gè)體a2的基因組序列中有EcoRⅠ位點(diǎn)，但是由于堿基的插入/缺失，導(dǎo)致各自的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的位置不同。通過(guò)EcoRⅠ酶切后，個(gè)體a2除了形成與個(gè)體a1相同長(zhǎng)度的片段外，還有一個(gè)長(zhǎng)度不一的片段（比個(gè)體a1長(zhǎng)約15 bp的片段）；由于個(gè)體a3在EcoRⅠ位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變，EcoRⅠ的酶切序列GAATTC變成了BamHⅠ的酶切序列GGATCC，因此用EcoRⅠ酶切，則產(chǎn)生不了片段，但用BamHⅠ酶切，個(gè)體a3出現(xiàn)條帶，而個(gè)體a1和個(gè)體a2不出現(xiàn)條帶。RFLP具有數(shù)目多、共顯性、不受環(huán)境影響、多態(tài)性高等特點(diǎn)，但RFLP技術(shù)對(duì)樣品要求高，DNA 必需是大分子，因此在抽提DNA過(guò)程中要避免DNA斷裂，限制性內(nèi)切酶酶切消化要徹底；此外，制作雜交探針較困難，試驗(yàn)操作較繁鎖，檢測(cè)周期長(zhǎng)，成本費(fèi)用高。

1.2VNTR技術(shù)

VNTR別稱(chēng)小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA），真核生物基因組中有2類(lèi)可變的串聯(lián)重復(fù)序列，根據(jù)核心序列（重復(fù)序列）的長(zhǎng)度分為小衛(wèi)星和微衛(wèi)星，其中小衛(wèi)星重復(fù)單位的核心序列為15到幾十甚至幾百個(gè)核苷酸，一般位于基因組高變區(qū)，是基因組中的重組熱點(diǎn)，拷貝數(shù)達(dá)數(shù)百次不等，呈現(xiàn)出豐富的長(zhǎng)度多態(tài)性[3-4]。VNTR技術(shù)的原理與RFLP技術(shù)大致相同，首先選擇在VNTR特異序列上的無(wú)酶切位點(diǎn)（保證小衛(wèi)星序列的完整性）的限制性內(nèi)切酶將總基因組DNA切成不同長(zhǎng)度的片段，然后以VNTR中的特異序列為探針進(jìn)行Southern雜交，放射自顯影后就可檢測(cè)到很多小衛(wèi)星位點(diǎn)。如圖2所示，小衛(wèi)星重復(fù)單位的核心序列為GGAGGTGGGCAGGAGG，在個(gè)體b1中核心序列重復(fù)了8次，記為（GGAGGTGGGCAGGAGG）8；個(gè)體b2中重復(fù)了7次，記為（GGAGGTGGGCAGGAGG）7；個(gè)體b3中核心序列重復(fù)了10次，記為（GGAGGTGGGCAGGAGG）10。因此，用VNTR標(biāo)記就會(huì)形成3個(gè)不同長(zhǎng)度的多態(tài)性，其中個(gè)體b2的擴(kuò)增片段最短，個(gè)體b1比個(gè)體b2擴(kuò)增片段長(zhǎng)約16 bp的片段，個(gè)體b3比個(gè)體b2擴(kuò)增出長(zhǎng)約48 bp的片段。由此可以看出，VNTR數(shù)量有限，在基因組上分布不均勻；同時(shí)，VNTR技術(shù)具有試驗(yàn)操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn)。

2第2代DNA分子標(biāo)記技術(shù)

2.1RAPD技術(shù)

1990 年，Welsh等第1次提出RAPD[5-6]。RAPD技術(shù)是以基因組DNA為模板，以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列為引物而進(jìn)行的PCR 擴(kuò)增技術(shù)。RAPD技術(shù)通常使用10個(gè)左右堿基的隨機(jī)單鏈引物，由于基因組中存在很多反向序列，因此RAPD擴(kuò)增的是正向序列和反向序列之間的片段，引物在DNA模板上有很多結(jié)合位點(diǎn)，只有當(dāng)2個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)較近且方向相反時(shí)，擴(kuò)增才能進(jìn)行。如果2個(gè)引物結(jié)合點(diǎn)彼此背離，擴(kuò)增不會(huì)發(fā)生；引物結(jié)合點(diǎn)在相同的方向，擴(kuò)增也不會(huì)發(fā)生；引物之間彼此相隔太遠(yuǎn)（>2 000 bp），擴(kuò)增也不會(huì)發(fā)生。引物結(jié)合位點(diǎn)DNA序列的改變可能導(dǎo)致引物無(wú)法與模板結(jié)合，從而擴(kuò)增無(wú)法進(jìn)行或擴(kuò)增片段數(shù)目改變。2個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)之間DNA堿基的缺失、插入等導(dǎo)致擴(kuò)增片段數(shù)目和長(zhǎng)度的差異。如圖3所示，用10 bp的隨機(jī)引物GCTGCTATCT進(jìn)行擴(kuò)增，個(gè)體c1將得到擴(kuò)增長(zhǎng)度約111 bp的片段，個(gè)體c2將得到擴(kuò)增長(zhǎng)度約74 bp的片段，個(gè)體c3由于發(fā)生點(diǎn)突變，引物無(wú)法與模板配對(duì)，因此擴(kuò)增不出片段。RAPD 技術(shù)由于不涉及分子雜交和放射性自顯影技術(shù)，引物為完全隨機(jī)引物，因此設(shè)計(jì)引物時(shí)無(wú)須知道模板序列信息。RAPD 技術(shù)具有引物成本較低、DNA需要量少、技術(shù)簡(jiǎn)便、操作方便、快速、引物通用等特點(diǎn)。但RAPD大多為顯性遺傳，不能鑒別顯性純合子和雜合子；RAPD技術(shù)的試驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。

2.2AFLP技術(shù)

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）由Zabeau等在1995年創(chuàng)立，是基于PCR技術(shù)選擇性擴(kuò)增基因組DNA限制性片段的技術(shù)[7]。AFLP技術(shù)先用限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，一般采用雙酶切，雙酶切中一種為低頻剪切酶，另一種為高頻剪切酶，目前常用的是MseⅠ、EcoRⅠ和PstⅠ酶組合，其中EcoRⅠ為6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的低頻剪切酶，MseⅠ為4個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的高頻剪切酶。雙酶切后得到大小不等的酶切DNA片段，產(chǎn)生的DNA片段長(zhǎng)度一般小于500 bp，然后在其兩端接上雙鏈人工接頭，接頭由1個(gè)核心序列和1個(gè)酶切序列組成，一般為14～18 bp。如圖4所示，連上接頭的酶切片段就是DNA模板，引物由與人工接頭互補(bǔ)的5′端核心序列（GACTGCGTA）、對(duì)應(yīng)于限制性酶切片段限制性末端的特異性酶切序列（CCAATT）及3′端選擇性堿基（CCACCT）三部分構(gòu)成，引物的3′端選擇性堿基識(shí)別接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列，擴(kuò)增片段的特異性由選擇性堿基的種類(lèi)、數(shù)目和順序決定，只有那些限制性位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才能被擴(kuò)增出來(lái)。擴(kuò)增產(chǎn)物可以用放射性同位素標(biāo)記或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離來(lái)檢測(cè)個(gè)體之間的差異。AFLP技術(shù)預(yù)先不需要知道被測(cè)基因組DNA信息，是在RAPD技術(shù)和RFLP技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種半隨機(jī)PCR技術(shù)，但是操作中通常要利用同位素標(biāo)記，對(duì)樣品DNA質(zhì)量要求高。

2.3SSR技術(shù)

SSR別微衛(wèi)星DNA（micro satellite）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)多態(tài)性（simple sequence repeat polymorphisms，SSRP）或短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）。簡(jiǎn)單序列重復(fù)是一類(lèi)由 2～6 bp 堿基組成的基序（核心序列）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，重復(fù)幾十次，基因位點(diǎn)長(zhǎng)度一般在100～300 bp，其中最常見(jiàn)是2種堿基重復(fù)，如（AT）n、（AC）n等[8]。SSR在真核生物基因組中呈隨機(jī)分布，大約每隔10～50 kb就存在1個(gè)，但不同物種中的重復(fù)序列及重復(fù)單位頻率不同。同一物種內(nèi)堿基種類(lèi)不同的SSR，其豐度差別也很大。微衛(wèi)星DNA兩端的序列一般都很保守，可以根據(jù)其兩端的保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，再利用PCR技術(shù)擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星DNA序列，通過(guò)電泳分析核心序列的長(zhǎng)度多態(tài)性[9]。SSR變異產(chǎn)生的原理如圖5所示，在個(gè)體d1中的基序?yàn)椋℅A）21，個(gè)體d2中為（GA）16，根據(jù)其兩端的保守序列設(shè)計(jì)的引物為5′-TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC-3′和3′-ACTTTACCCTTTCCTAGTGG-5′，其中個(gè)體d1預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為184 bp，個(gè)體d2預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為174 bp。

SSR具有呈共顯性遺傳的特點(diǎn)，可鑒別雜合子和純合子，并且SSR技術(shù)所需DNA量少。但是缺點(diǎn)是SSR具有相對(duì)的物種專(zhuān)一性，引物不能通用；以已知微衛(wèi)星序列兩端的單拷貝序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，需建立基因文庫(kù)、克隆識(shí)別與篩選、測(cè)序等過(guò)程；不同引物退火溫度不同，需要進(jìn)行試驗(yàn)探索。

3第3代DNA分子標(biāo)記技術(shù)

3.1SNP標(biāo)記技術(shù)

1996年，Vos等提出SNP技術(shù)，主要是指由基因組核苷酸水平上的單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換變異引起的DNA序列多態(tài)性[10-11]。如圖6所示，對(duì)2個(gè)個(gè)體的部分核苷酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，其中個(gè)體e1中的堿基G顛換成個(gè)體e2中的堿基T，出現(xiàn)了1個(gè)SNP。SNP是許多物種基因組中最常見(jiàn)的變異形式，在基因組中的分布頻率很高，近年來(lái)，SNPs在人類(lèi)[12-17]、老鼠[18]、擬南芥[19]、大麥[20-21]、大豆[22]、甜瓜[23]、玉米[24]和水稻[25-28]等多個(gè)物種中的高密度分布已有報(bào)道。作為第3代分子標(biāo)記，SNP具有在基因組中數(shù)量多、分布密度高等特點(diǎn)，而且在基因分型過(guò)程中不需要根據(jù)片段大小將DNA分帶，可以大規(guī)模高度自動(dòng)化地完成，比以SSR標(biāo)記為代表的第2代分子標(biāo)記密度高。SNP標(biāo)記技術(shù)高效率的工作特點(diǎn)，更適于大量樣本的檢測(cè)分析。目前檢測(cè)SNP的最佳方法是 DNA芯片技術(shù)，SNP標(biāo)記則被認(rèn)為是很有應(yīng)用前景的分子標(biāo)記技術(shù)[29-30]。

SNP不是長(zhǎng)度多態(tài)性，在設(shè)計(jì)引物時(shí)須將突變堿基落在突變引物的3′端，根據(jù)Taq酶缺乏3′→5′外切酶活性的特點(diǎn)，3′末端錯(cuò)配堿基的引物，其延伸速度低于正常末端堿基配對(duì)的引物的延伸速度，因此特異性擴(kuò)增條帶就不會(huì)出現(xiàn)，從而就表明模板DNA與引物3′末端沒(méi)有相應(yīng)的突變；反之則表明模板DNA 上存在與引物3′末端相應(yīng)的突變堿基。以圖6為例，個(gè)體e1的引物為5′-CACCGAAGATAGAAATGGAC-3′、

3′-CAGAGTAGAGGTAATTTTGT- 5′；個(gè)體e2的引物為5′-CACCGAAGATAGAAATGGAA 3′、3′- CAGAGTAGAGGTAATTTTGT - 5′。個(gè)體e1和個(gè)體e2的特異性引物只在3′端有1個(gè)堿基的差異，而它們的反向引物是相同的，反向引物的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，如圖6所示的擴(kuò)增片段大小約為157 bp。為了增加擴(kuò)增的特異性，可以在個(gè)體e1或個(gè)體e2的正向引物的3′端第3位上引入1個(gè)錯(cuò)配，如5′- CACCGAAGATA GAA A TGAAC -3′[31]。由酶切序列的改變產(chǎn)生的分子標(biāo)記如RFLP、CAPS等，由于涉及到分子雜交、放射性元素的利用及限制性內(nèi)切酶消化不完全帶來(lái)的基因型判讀錯(cuò)誤等問(wèn)題，可把這類(lèi)標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SNP標(biāo)記得以實(shí)現(xiàn)。

3.2InDels標(biāo)記技術(shù)

InDels（insert delete）標(biāo)記即插入/缺失標(biāo)記技術(shù)[32]，指幾個(gè)堿基的插入或缺失。很多研究人員把單堿基的插入/缺失也稱(chēng)為SNP。如圖7所示，個(gè)體f1和個(gè)體f2的核苷酸序列出現(xiàn)了1個(gè)InDels標(biāo)記，個(gè)體f1和個(gè)體f2之間只相差了2 bp，雖然從理論上講，聚丙烯酰胺凝膠可以區(qū)分1 bp的差異，但試驗(yàn)條件要求很高才能區(qū)分2 bp的差異：凝膠要很薄，電泳時(shí)間也要比常規(guī)時(shí)間長(zhǎng)。InDels標(biāo)記為長(zhǎng)度多態(tài)性，因此在此序列區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)InDels引物時(shí)，用長(zhǎng)度多態(tài)性來(lái)區(qū)分這2個(gè)個(gè)體的效果往往不理想。

如果2個(gè)個(gè)體的核苷酸序列相比較，插入/缺失堿基數(shù)目較多，則可以用長(zhǎng)度多態(tài)性區(qū)分。如圖8所示，個(gè)體g1與個(gè)體g2的核苷酸序列相比，不僅出現(xiàn)了3個(gè)SNPs，還有8 bp的InDels，這就使得在此堿基序列區(qū)域內(nèi)開(kāi)發(fā)的引物不僅容易區(qū)分2個(gè)個(gè)體，而且特異性更強(qiáng)[33]。

4分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展

分子標(biāo)記作為一種高通量、能自動(dòng)檢測(cè)基因組中核苷酸序列變化的標(biāo)記方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳研究中，主要集中在基因定位[34-36]、輔助育種選擇[37-39]、功能基因鑒定[40-42]、遺傳多樣性分析[43-45]、疾病診斷與治療[46-48]等方面。各類(lèi)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)都是基于基因組核苷酸序列的差異，這種差異可能是內(nèi)切酶識(shí)別序列的差異、編碼區(qū)的差異、非編碼區(qū)的差異、啟動(dòng)子的差異、調(diào)控序列的差異等。這些差異可以是錯(cuò)義突變、移碼突變，導(dǎo)致氨基酸變化引起表型變異，也可能是產(chǎn)生無(wú)義突變而導(dǎo)致多肽鏈的翻譯提前終止，從而產(chǎn)生無(wú)功能的蛋白質(zhì)。另外，由于氨基酸密碼子的兼并性，這種差異可以導(dǎo)致沉默突變而不影響氨基酸的翻譯，在表型上沒(méi)有變化。因此，分子標(biāo)記用在輔助育種進(jìn)行選擇及作為疾病診斷的特異標(biāo)記時(shí)，必須把基因型與表現(xiàn)型結(jié)合起來(lái)。隨著功能基因組時(shí)代的到來(lái)，開(kāi)發(fā)并應(yīng)用與功能基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，特別是利用基因本身序列開(kāi)發(fā)的功能分子標(biāo)記，已成為鑒定和選擇目的基因的有效途徑。理想的分子標(biāo)記要具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、開(kāi)發(fā)成本和使用成本盡量低廉、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好的特點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)等理論與技術(shù)的發(fā)展，必將研發(fā)出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子標(biāo)記技術(shù)。

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