彗星試驗(yàn)檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷樣品制備方法

王楠+薛永來+杜道林

摘要：彗星試驗(yàn)（comet assay）是近年來逐步發(fā)展起來的1種檢測單細(xì)胞水平DNA損傷的新技術(shù)，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)、，輻射生物學(xué)、環(huán)境生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域。在堿性SCGE基礎(chǔ)上，對哺乳動(dòng)物細(xì)胞SCGE檢測樣品制備的方法進(jìn)行了改進(jìn)與優(yōu)化，使改進(jìn)后的方法更加快速簡便、易于推廣。

關(guān)鍵詞：彗星實(shí)驗(yàn)（單細(xì)胞凝膠電泳）；DNA損傷；HepG2細(xì)胞；電泳圖像質(zhì)量

中圖分類號(hào)： Q291；X503.22文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0041-02

收稿日期：2013-10-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31100379）；江蘇省高校自然科學(xué)基金（編號(hào)：11KJB610001）；中國博士后科學(xué)基金（編號(hào)：20100470062）；江蘇省博士后基金（編號(hào)：1001024C）。

作者簡介：王楠（1984—），男，山西大同人，碩士，從事環(huán)境毒理學(xué)研究。E-mail：nan.wuhan.2006@163.com

通信作者：杜道林，博士，教授，從事生態(tài)學(xué)研究。E-mail：ddl@ujs.edu.cn。DNA存儲(chǔ)著生物體賴以生存繁衍的遺傳信息，細(xì)胞DNA損傷是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，其DNA雙鏈會(huì)發(fā)生斷裂，斷裂過程中會(huì)發(fā)生特異性級(jí)聯(lián)生化反應(yīng)，依賴Ca2+、Mg2+的核酸內(nèi)切酶被激活，優(yōu)先作用于連接DNA的核小體間區(qū)域，將DNA鏈切割成180～200 bp或其倍數(shù)的片段，在彗星電泳中發(fā)生斷裂的DNA遷移速度與遷移距離均數(shù)倍于正常細(xì)胞的核DNA，呈現(xiàn)脫離細(xì)胞核的“彗星”狀，據(jù)此可將DNA受損細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)分開[1]。彗星試驗(yàn)（comet assay）也被稱作單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE），是1種在單細(xì)胞水平上檢測真核細(xì)胞DNA損傷的方法。通過測定細(xì)胞電泳時(shí)彗星出現(xiàn)率、彗尾DNA含量百分比、彗尾長度等指標(biāo)，即可對細(xì)胞藥物引起細(xì)胞DNA損傷進(jìn)行全面評(píng)價(jià)[2]。1993年，Olive等首次將彗星試驗(yàn)應(yīng)用于細(xì)胞凋亡檢測[3]。真核細(xì)胞的DNA分子量較大，DNA呈負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)附著在核基質(zhì)中，采用瓊脂糖凝膠將細(xì)胞包埋在細(xì)胞裂解液下，細(xì)胞膜、核膜等被破壞，細(xì)胞內(nèi)的RNA、蛋白質(zhì)等其他成分進(jìn)入凝膠，繼而擴(kuò)散到裂解液中，核DNA仍然保持纏繞狀，附著在剩余的核骨架上，并留在原位。在強(qiáng)堿（pH值為13）電泳液中電泳時(shí)，若細(xì)胞未受到損傷，核DNA分子量大且未發(fā)生斷裂，仍停留在核基質(zhì)中，經(jīng)熒光染料染色后，核在原位形成1個(gè)明亮的頭部，無拖尾現(xiàn)象；若細(xì)胞受損，會(huì)出現(xiàn)DNA單鏈或雙鏈斷裂，強(qiáng)堿環(huán)境下DNA解旋為單鏈，DNA斷裂片段進(jìn)入凝膠中，在電場力作用下，斷裂的DNA片段因攜帶負(fù)電荷脫離核DNA向陽極移動(dòng)，DNA碎片形成彗星狀尾部，即可形成彗星圖像。彗星電泳檢測技術(shù)具有所需樣品量少、適用于任何真核細(xì)胞、靈敏度高、細(xì)胞不需處于有絲分裂期、無需放射性標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞DNA損傷及修復(fù)、藥物篩選、腫瘤發(fā)病機(jī)制與治療等研究。目前，用于彗星電泳檢測分析的樣品制備過程主要包括樣品凝膠制備、細(xì)胞裂解、解旋與電泳、中和洗滌、熒光染色、采用彗星凝膠電泳攝像系統(tǒng)拍攝熒光照片等步驟。通常，熒光染色步驟中所使用的熒光染料為溴化乙錠（ethidium bromide，EB），EB是1種強(qiáng)誘變劑，容易揮發(fā)，對操作人員的健康造成威脅。使用后的染色玻片直接扔進(jìn)垃圾箱可能會(huì)對周圍環(huán)境造成潛在危害。此外，目前用于彗星電泳分析所制備的凝膠玻片通常要鋪3層凝膠，且在后續(xù)裂解、電泳及漂洗過程中，凝膠極易脫離載玻片，造成制膠失敗，影響彗星電泳技術(shù)的推廣與應(yīng)用。咪唑類離子液體因具有不揮發(fā)、不易燃、導(dǎo)電性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、對許多無機(jī)鹽及有機(jī)物有良好的溶解性等物化性質(zhì)，使得其在化學(xué)合成、催化、電化學(xué)、分析化學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[4]。然而，研究表明，咪唑類離子液體不僅對細(xì)菌及真菌的生長具有很強(qiáng)的抑制作用，對人類上皮細(xì)胞也具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，且細(xì)胞毒性隨著離子液體烷基側(cè)鏈長度的增加而增加[5-8]。本研究采用基于人肝臟腫瘤細(xì)胞系HepG2的彗星試驗(yàn)檢測了離子液體1-丁基-3-甲基溴代鹽（[C8mim]Br）的DNA損傷作用，旨在為評(píng)價(jià)咪唑類離子液體的遺傳毒性提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

[C8mim]Br（上海成捷化學(xué)有限公司），純度>99%，[C8mim]Br用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（PBS）溶解，貯存液濃度為10 mol/L，4 ℃保存，臨用時(shí)用10%胎牛血清培養(yǎng)液稀釋至所需濃度；DMEM培養(yǎng)基、正常熔點(diǎn)瓊脂糖（NMA）、低熔點(diǎn)瓊脂糖（LMA）、Gel Red核酸凝膠染料均為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），-20 ℃ 保存，臨用時(shí)經(jīng)56 ℃水浴滅活 30 min；胰蛋白酶（美國Amresco公司）；其他試劑均為分析純。

1.2主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國Heal Force公司）、TE601-L電子天平、BS124S分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、JM250水平電泳儀（大連捷邁科技發(fā)展有限公司）、Ti-E2000型倒置熒光顯微鏡（Nikon公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州市新區(qū)楓橋凈化設(shè)備廠）。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞來源于American Type Culture Collection（ATCC HB-8065），購自江蘇大學(xué)藥學(xué)院。細(xì)胞貼壁生長于DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，每隔2～3 d傳代。

1.3.2細(xì)胞處理取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化液收獲，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h至80%融合度，分別加入[C8mim]Br至終濃度為1、2 mmol/L，37 ℃下作用24 h，以0.1 mmol/L H2O2作為陽性對照，作用1 h。以PBS為陰性對照。細(xì)胞染毒后，用PBS洗滌2次，800 r/min離心5 min收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于1 mL預(yù)冷PBS中，用臺(tái)盼藍(lán)法測定細(xì)胞存活率>95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105～5×105個(gè)/mL備用。

1.3.3凝膠制備第1層膠制備：將100 μL 1%正常熔點(diǎn)的瓊脂糖滴至磨砂邊載玻片上，用另一塊玻片均勻推開，蓋上蓋玻片后迅速置于4 ℃冰箱中固化10 min。第2層膠制備：將 60 μL 待測細(xì)胞懸液與0.78%低熔點(diǎn)瓊脂糖在42 ℃水浴中按1 ∶2（體積比）混合，滴80 μL上述混合液至第1層膠上，蓋上蓋玻片置于4 ℃冰箱中固化10 min。得到鋪有2層凝膠的玻片。

1.3.4細(xì)胞裂解用彎頭鑷子小心平移走蓋玻片，將鋪有2層凝膠的玻片浸入裝有預(yù)冷細(xì)胞裂解液（2.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L pH值為10的Tris緩沖液、1%肌氨酸鈉、1% Triton X-100、10% DMSO）的平皿中，4 ℃避光裂解1 h。取出載玻片，用蒸餾水輕輕漂洗2次。

1.3.5DNA解鏈與電泳將上述細(xì)胞裂解后的玻片置于水平電泳槽正極端，緩緩倒入新配制的電泳緩沖液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 值為13），約覆蓋過玻片膠面0.3 cm左右，避光靜置30 min，電泳電壓為25 V，電流 300 mA 電泳20 min。

1.3.6中和脫水將電泳后的玻片浸入0.4 mmol/L pH值為7.5 的Tris-HCl中和緩沖液中浸洗3遍，用0.01 mol/L PBS洗凈，玻片依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為50%、75%、100%的乙醇梯度脫水，每次2 min，室溫下晾干。

1.3.7熒光染色在脫水后的玻片上滴20 μL Gel Red核酸凝膠染料，用蓋玻片輕輕推開Gel Red染料，使Gel Red在瓊脂糖表面均勻鋪開，蓋上蓋玻片，避光染色10 min。

1.3.8 鏡檢拍照將制得的樣品玻片與空白對照玻片置于倒置熒光顯微鏡下，激發(fā)波長為515～560 nm，用100倍物鏡觀察，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇10～20個(gè)細(xì)胞拍照攝取圖像。每個(gè)樣品玻片隨機(jī)選取10個(gè)拖尾細(xì)胞，采用CASP彗星分析軟件測量彗星尾長（tail length）、彗星尾力矩（tail moment）、彗星尾DNA百分含量。

1.3.9數(shù)據(jù)分析采用Origin7.5軟件分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

，[C8mim]Br與HepG2細(xì)胞接觸24 h，在熒光顯微鏡下，經(jīng)Gel Red 染色的細(xì)胞DNA呈橘紅色，未發(fā)生斷裂的DNA只有1個(gè)完整的頭部，斷裂的DNA形成拖尾，HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)“彗星”樣細(xì)胞，，隨著[C8mim]Br劑量的增加，拖尾現(xiàn)象更加明顯，表明細(xì)胞DNA損傷程度加重。由表1可知，咪唑類離子液體[C8mim]Br可誘發(fā)HepG2細(xì)胞DNA原始損傷。

表1不同濃度[C8mim]Br 下HepG2細(xì)胞DNA損傷程度

受試物濃度（mmol/L）彗尾DNA含量（%）彗星尾長（μm）彗星尾力矩（μm）PBS 2.2±0.313.1±4.90.4±0.1H2O20.163.0±9.3**145.2±20.0**81.6±11.9**[C8mim]Br1.022.7±3.8**79.0±12.5**25.4±3.9**2.038.2±1.8**105.3±14.8**47.3±3.8**注：同列數(shù)據(jù)后“**”表示差異極顯著。

3結(jié)論與討論

彗星試驗(yàn)是一種靈敏、可靠的檢測細(xì)胞核DNA損傷的技術(shù)，可以檢測DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂、堿基不穩(wěn)定位點(diǎn)等多種類型損傷，是評(píng)價(jià)外來化合物遺傳毒性的有效手段。近年來，研究人員采用HepG2細(xì)胞彗星試驗(yàn)對消毒劑處理飲用水的有機(jī)提取物以及農(nóng)藥等的遺傳毒性進(jìn)行了研究[9-10]。本研究所涉及的凝膠制片步驟只要鋪2層膠，與傳統(tǒng)的彗星試驗(yàn)樣品玻片要鋪3層膠的“三明治”鋪膠工藝相比，具有可操作性強(qiáng)、不易脫膠、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，采用梯度乙醇對樣本進(jìn)行脫水，可使樣本脫水更加徹底，分析彗星電泳圖像時(shí)，可減弱熒光衰減程度，提高圖像質(zhì)量。此外，與傳統(tǒng)熒光染料相比，Gel Red核酸凝膠染料低毒、穩(wěn)定，對哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性小，且廢棄物不會(huì)造成環(huán)境污染。

參考文獻(xiàn)：

[1]Dizdaroglu M，Jaruga P，Birincioglu M，et al. Free radical-induced damage to DNA：mechanisms and measurement[J]. Free Radical Biology and Medicine，2002，32（11）：1102-1115.

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[10]周炯林，連勇，彭雙清，等. 敵敵畏、樂果和馬拉硫磷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞DNA損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 癌變·畸變·突變，2010，22（2）：126-129.趙瀟. 不同水稻受體材料對潔凈DNA轉(zhuǎn)化效率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：43-47.

1.3.3凝膠制備第1層膠制備：將100 μL 1%正常熔點(diǎn)的瓊脂糖滴至磨砂邊載玻片上，用另一塊玻片均勻推開，蓋上蓋玻片后迅速置于4 ℃冰箱中固化10 min。第2層膠制備：將 60 μL 待測細(xì)胞懸液與0.78%低熔點(diǎn)瓊脂糖在42 ℃水浴中按1 ∶2（體積比）混合，滴80 μL上述混合液至第1層膠上，蓋上蓋玻片置于4 ℃冰箱中固化10 min。得到鋪有2層凝膠的玻片。

1.3.4細(xì)胞裂解用彎頭鑷子小心平移走蓋玻片，將鋪有2層凝膠的玻片浸入裝有預(yù)冷細(xì)胞裂解液（2.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L pH值為10的Tris緩沖液、1%肌氨酸鈉、1% Triton X-100、10% DMSO）的平皿中，4 ℃避光裂解1 h。取出載玻片，用蒸餾水輕輕漂洗2次。

1.3.5DNA解鏈與電泳將上述細(xì)胞裂解后的玻片置于水平電泳槽正極端，緩緩倒入新配制的電泳緩沖液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 值為13），約覆蓋過玻片膠面0.3 cm左右，避光靜置30 min，電泳電壓為25 V，電流 300 mA 電泳20 min。

1.3.6中和脫水將電泳后的玻片浸入0.4 mmol/L pH值為7.5 的Tris-HCl中和緩沖液中浸洗3遍，用0.01 mol/L PBS洗凈，玻片依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為50%、75%、100%的乙醇梯度脫水，每次2 min，室溫下晾干。

1.3.7熒光染色在脫水后的玻片上滴20 μL Gel Red核酸凝膠染料，用蓋玻片輕輕推開Gel Red染料，使Gel Red在瓊脂糖表面均勻鋪開，蓋上蓋玻片，避光染色10 min。

1.3.8 鏡檢拍照將制得的樣品玻片與空白對照玻片置于倒置熒光顯微鏡下，激發(fā)波長為515～560 nm，用100倍物鏡觀察，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇10～20個(gè)細(xì)胞拍照攝取圖像。每個(gè)樣品玻片隨機(jī)選取10個(gè)拖尾細(xì)胞，采用CASP彗星分析軟件測量彗星尾長（tail length）、彗星尾力矩（tail moment）、彗星尾DNA百分含量。

1.3.9數(shù)據(jù)分析采用Origin7.5軟件分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

，[C8mim]Br與HepG2細(xì)胞接觸24 h，在熒光顯微鏡下，經(jīng)Gel Red 染色的細(xì)胞DNA呈橘紅色，未發(fā)生斷裂的DNA只有1個(gè)完整的頭部，斷裂的DNA形成拖尾，HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)“彗星”樣細(xì)胞，，隨著[C8mim]Br劑量的增加，拖尾現(xiàn)象更加明顯，表明細(xì)胞DNA損傷程度加重。由表1可知，咪唑類離子液體[C8mim]Br可誘發(fā)HepG2細(xì)胞DNA原始損傷。

表1不同濃度[C8mim]Br 下HepG2細(xì)胞DNA損傷程度

受試物濃度（mmol/L）彗尾DNA含量（%）彗星尾長（μm）彗星尾力矩（μm）PBS 2.2±0.313.1±4.90.4±0.1H2O20.163.0±9.3**145.2±20.0**81.6±11.9**[C8mim]Br1.022.7±3.8**79.0±12.5**25.4±3.9**2.038.2±1.8**105.3±14.8**47.3±3.8**注：同列數(shù)據(jù)后“**”表示差異極顯著。

3結(jié)論與討論

彗星試驗(yàn)是一種靈敏、可靠的檢測細(xì)胞核DNA損傷的技術(shù)，可以檢測DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂、堿基不穩(wěn)定位點(diǎn)等多種類型損傷，是評(píng)價(jià)外來化合物遺傳毒性的有效手段。近年來，研究人員采用HepG2細(xì)胞彗星試驗(yàn)對消毒劑處理飲用水的有機(jī)提取物以及農(nóng)藥等的遺傳毒性進(jìn)行了研究[9-10]。本研究所涉及的凝膠制片步驟只要鋪2層膠，與傳統(tǒng)的彗星試驗(yàn)樣品玻片要鋪3層膠的“三明治”鋪膠工藝相比，具有可操作性強(qiáng)、不易脫膠、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，采用梯度乙醇對樣本進(jìn)行脫水，可使樣本脫水更加徹底，分析彗星電泳圖像時(shí)，可減弱熒光衰減程度，提高圖像質(zhì)量。此外，與傳統(tǒng)熒光染料相比，Gel Red核酸凝膠染料低毒、穩(wěn)定，對哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性小，且廢棄物不會(huì)造成環(huán)境污染。

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[4]肖小華，劉淑娟，劉霞，等. 離子液體及其在分離分析中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 分析化學(xué)，2005，33（4）：569-574.

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[7]Kelman D，Kashman Y，Rosenberg E，et al. Antimicrobial activity of the reef sponge Amphimedon viridis from the Red Sea：evidence for selective toxicity[J]. Aquatic Microbial Ecology，2001，24（1）：9-16.

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[10]周炯林，連勇，彭雙清，等. 敵敵畏、樂果和馬拉硫磷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞DNA損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 癌變·畸變·突變，2010，22（2）：126-129.趙瀟. 不同水稻受體材料對潔凈DNA轉(zhuǎn)化效率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：43-47.

1.3.3凝膠制備第1層膠制備：將100 μL 1%正常熔點(diǎn)的瓊脂糖滴至磨砂邊載玻片上，用另一塊玻片均勻推開，蓋上蓋玻片后迅速置于4 ℃冰箱中固化10 min。第2層膠制備：將 60 μL 待測細(xì)胞懸液與0.78%低熔點(diǎn)瓊脂糖在42 ℃水浴中按1 ∶2（體積比）混合，滴80 μL上述混合液至第1層膠上，蓋上蓋玻片置于4 ℃冰箱中固化10 min。得到鋪有2層凝膠的玻片。

1.3.4細(xì)胞裂解用彎頭鑷子小心平移走蓋玻片，將鋪有2層凝膠的玻片浸入裝有預(yù)冷細(xì)胞裂解液（2.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L pH值為10的Tris緩沖液、1%肌氨酸鈉、1% Triton X-100、10% DMSO）的平皿中，4 ℃避光裂解1 h。取出載玻片，用蒸餾水輕輕漂洗2次。

1.3.5DNA解鏈與電泳將上述細(xì)胞裂解后的玻片置于水平電泳槽正極端，緩緩倒入新配制的電泳緩沖液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 值為13），約覆蓋過玻片膠面0.3 cm左右，避光靜置30 min，電泳電壓為25 V，電流 300 mA 電泳20 min。

1.3.6中和脫水將電泳后的玻片浸入0.4 mmol/L pH值為7.5 的Tris-HCl中和緩沖液中浸洗3遍，用0.01 mol/L PBS洗凈，玻片依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為50%、75%、100%的乙醇梯度脫水，每次2 min，室溫下晾干。

1.3.7熒光染色在脫水后的玻片上滴20 μL Gel Red核酸凝膠染料，用蓋玻片輕輕推開Gel Red染料，使Gel Red在瓊脂糖表面均勻鋪開，蓋上蓋玻片，避光染色10 min。

1.3.8 鏡檢拍照將制得的樣品玻片與空白對照玻片置于倒置熒光顯微鏡下，激發(fā)波長為515～560 nm，用100倍物鏡觀察，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇10～20個(gè)細(xì)胞拍照攝取圖像。每個(gè)樣品玻片隨機(jī)選取10個(gè)拖尾細(xì)胞，采用CASP彗星分析軟件測量彗星尾長（tail length）、彗星尾力矩（tail moment）、彗星尾DNA百分含量。

1.3.9數(shù)據(jù)分析采用Origin7.5軟件分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

，[C8mim]Br與HepG2細(xì)胞接觸24 h，在熒光顯微鏡下，經(jīng)Gel Red 染色的細(xì)胞DNA呈橘紅色，未發(fā)生斷裂的DNA只有1個(gè)完整的頭部，斷裂的DNA形成拖尾，HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)“彗星”樣細(xì)胞，，隨著[C8mim]Br劑量的增加，拖尾現(xiàn)象更加明顯，表明細(xì)胞DNA損傷程度加重。由表1可知，咪唑類離子液體[C8mim]Br可誘發(fā)HepG2細(xì)胞DNA原始損傷。

表1不同濃度[C8mim]Br 下HepG2細(xì)胞DNA損傷程度

受試物濃度（mmol/L）彗尾DNA含量（%）彗星尾長（μm）彗星尾力矩（μm）PBS 2.2±0.313.1±4.90.4±0.1H2O20.163.0±9.3**145.2±20.0**81.6±11.9**[C8mim]Br1.022.7±3.8**79.0±12.5**25.4±3.9**2.038.2±1.8**105.3±14.8**47.3±3.8**注：同列數(shù)據(jù)后“**”表示差異極顯著。

3結(jié)論與討論

彗星試驗(yàn)是一種靈敏、可靠的檢測細(xì)胞核DNA損傷的技術(shù)，可以檢測DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂、堿基不穩(wěn)定位點(diǎn)等多種類型損傷，是評(píng)價(jià)外來化合物遺傳毒性的有效手段。近年來，研究人員采用HepG2細(xì)胞彗星試驗(yàn)對消毒劑處理飲用水的有機(jī)提取物以及農(nóng)藥等的遺傳毒性進(jìn)行了研究[9-10]。本研究所涉及的凝膠制片步驟只要鋪2層膠，與傳統(tǒng)的彗星試驗(yàn)樣品玻片要鋪3層膠的“三明治”鋪膠工藝相比，具有可操作性強(qiáng)、不易脫膠、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，采用梯度乙醇對樣本進(jìn)行脫水，可使樣本脫水更加徹底，分析彗星電泳圖像時(shí)，可減弱熒光衰減程度，提高圖像質(zhì)量。此外，與傳統(tǒng)熒光染料相比，Gel Red核酸凝膠染料低毒、穩(wěn)定，對哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性小，且廢棄物不會(huì)造成環(huán)境污染。

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