月桂揮發(fā)油體外抗病原微生物活性研究

王城城,蒲靜,金家貴,胡杰,代娟,代敏(.成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院,成都 60500；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,成都 60500)

·論 著·

月桂揮發(fā)油體外抗病原微生物活性研究

王城城1,蒲靜2*,金家貴1,胡杰1,代娟1,代敏1
(1.成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院,成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,成都 610500)

目的 探討月桂揮發(fā)油對臨床分離細(xì)菌和真菌的體外抗菌活性,為月桂在治療感染性疾病中的開發(fā)與運用奠定基礎(chǔ)。方法 采用瓊脂平板二倍稀釋法測定了月桂揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌共16種65株臨床分離細(xì)菌、14株白假絲酵母和1株非白假絲酵母臨床分離真菌的最低抑菌濃度。用SPSS 17.0軟件中單因素方差分析法比較分析了月桂揮發(fā)油分別對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、洛菲不動桿菌和白假絲酵母菌共5個不同種屬細(xì)菌和真菌抑菌活性的強(qiáng)弱。結(jié)果 月桂揮發(fā)油除對銅綠假單胞菌無明顯抗菌活性外,對其余受試細(xì)菌均有較強(qiáng)的抗菌活性,MIC為0.27 mg/mL～2.15 mg/mL；月桂揮發(fā)油對白假絲酵母菌和非白假絲酵母菌均有較強(qiáng)的抗菌活性,MIC分別為0.07～0.54 mg/mL和0.03 mg/mL；月桂揮發(fā)油對白假絲酵母菌和洛菲不動桿菌的抑菌活性明顯強(qiáng)于對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌活性(P<0.01),對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的抑菌活性比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 月桂揮發(fā)油有較強(qiáng)的抗細(xì)菌和抗真菌活性,具有用于防治感染性疾病-新型抗菌藥物的開發(fā)和運用前景。

月桂；揮發(fā)油；抗細(xì)菌活性；抗真菌活性

抗生素的發(fā)展和運用曾使感染性疾病得到有效控制,但隨之而來的細(xì)菌耐藥性[1,2]給廣大國內(nèi)外科技工作者提出了更大挑戰(zhàn),積極開發(fā)新的抗菌藥物及從天然藥物中尋找“抗生素替代品”等研究成了目前國內(nèi)外的研究熱點和難點[3-5]。中藥作為祖國醫(yī)學(xué)的寶貴遺產(chǎn),具有獨特的資源優(yōu)勢,且毒副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性[6],更多學(xué)者將目標(biāo)投向了抗菌中藥的研究。月桂(LaurusnobilisL.)是一種芳香類植物,原產(chǎn)于地中海地區(qū),現(xiàn)我國山東、四川、陜西、江蘇、浙江、福建及云南等省均有栽培,其揮發(fā)油中主要含有α-乙酸松油酯、肉桂醛、1,8-桉葉素、β-桉葉油醇、β-石竹烯、丁香酚甲醚等成分,常用于調(diào)味品、醫(yī)藥、化妝品和化工等領(lǐng)域[7,8]。現(xiàn)代藥理研究[7,9-11]表明,月桂具有抗炎、抗氧化、降低血糖、抗菌等藥理活性,可治療頭痛、偏頭痛、胃潰瘍、感染性疾病等。

目前,對于月桂的研究相對較少,其抗菌活性研究主要集中于月桂揮發(fā)油在食品防腐保鮮中的運用,即對食品中食源性腐敗菌和致病菌的抑制作用[11-13]；鮮有月桂中分離單體成分的抗菌作用研究[14-15]。本研究以臨床分離細(xì)菌和真菌為研究對象,研究月桂揮發(fā)油體外抗臨床分離菌的活性,為月桂揮發(fā)油在治療細(xì)菌和真菌感染性疾病方面提供科學(xué)依據(jù),亦為抗感染性疾病傳統(tǒng)中藥的新藥研發(fā)和綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物

月桂揮發(fā)油,購自上海香匯生物科技有限公司,密度為1.03 g/mL。

1.2 菌種

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)株 1)細(xì)菌：大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923,四川抗菌素工業(yè)研究所贈送；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43300,購自美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)；大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(B)44102和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(B)26003,購自四川省藥檢所。2)白假絲酵母菌：CICC1284購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2.2 臨床分離株 1)細(xì)菌：革蘭陽性菌4種18株(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸球菌、類白喉桿菌),革蘭陰性菌12種47株(大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌、沙門菌、支氣管敗血鮑特菌、洛菲不動桿菌、卡他莫拉菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、黏質(zhì)沙雷菌、陰溝腸桿菌和弗勞地枸櫞酸桿菌),分離于四川省婦幼保健院婦科門診患者,并經(jīng)SIMENS公司的MICROSCAN鑒定板條鑒定,菌株種類和株數(shù)(見表1)。2)真菌：14株白假絲酵母菌和1株非白假絲酵母菌,分離于四川省婦幼保健院婦科門診患者的上呼吸道和陰道等部位,并經(jīng)BIO-KONT公司的KC-16鑒定板條與藥敏紙片鑒定。

1.3 培養(yǎng)基、試劑及耗材

Mueller-Hinton agar(OXOID)、沙氏瓊脂培養(yǎng)基(含氯霉素0.1 g/L,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司),營養(yǎng)瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司),一次性無菌培養(yǎng)皿(江蘇康健生物有限公司)等。

1.4 主要儀器

多點接種儀(SAKUMA MIT-P型),VITEK DENSICHEK,上海申安立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(LDZX-40SBI),CO2INCUBATOR(MOC-15A),節(jié)能凈化工作臺(成都新光非蘭特凈化工程有限公司)。

1.5 實驗方法

采用瓊脂平板二倍稀釋法分別測定了藥物對細(xì)菌和真菌的體外抑菌活性。具體方法參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.1 含藥平板制備 采用倍比稀釋法用1%吐溫-80溶液對藥物進(jìn)行稀釋,分別將藥物稀釋成1︰2,1︰4,1︰8,1︰16,1︰32,1︰64,1︰128,1︰256,1︰512,1︰1 024共10個梯度,在一次性無菌培養(yǎng)皿中分別加入不同濃度梯度的稀釋藥液1 mL和14 mL滅菌的MH培養(yǎng)基,充分混勻,使藥物在平板中的濃度為1/30,1/60,1/120,1/240,1/480,1/960,1/1 920,1/3 840,1/7 680,1/15 360,平板自然干燥后備用。以平板內(nèi)分別用無菌蒸餾水和1%吐溫-80溶液1 mL代替藥物制備陽性對照和溶劑對照平板。

1.5.2 菌液配置 將各標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株用無菌生理鹽水調(diào)至菌液濃度1.5×106CFU/mL。

1.5.3 最低抑菌濃度(MIC)測定及結(jié)果判定 采用多點接種儀將菌液加入不同濃度梯度的含藥平板和陽性對照平板,并以生理鹽水代替菌液作陰性對照。37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h,觀察各菌株在含不同濃度梯度藥物平板中的生長情況。以無細(xì)菌生長平板內(nèi)藥物的最小濃度為揮發(fā)油對該菌株的MIC。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

對含4株以上的同種屬菌株,分別統(tǒng)計其抑制50%和90%菌株的MIC,即MIC50和MIC90；用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析法比較分析月桂揮發(fā)油對不同種屬菌株抑菌活性的強(qiáng)弱,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 月桂揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性

本實驗采用瓊脂平板二倍稀釋法測定了月桂揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等16種細(xì)菌的MIC。月桂揮發(fā)油除對銅綠假單胞菌無明顯抗菌活性外,對其余受試菌株均有較強(qiáng)的抗菌活性,對耐藥菌株和敏感株有相同的抑菌活性,MIC為0.27 mg/mL～2.15 mg/mL,其中對腸球菌和嗜麥芽假單胞菌的抑菌活性相對較強(qiáng),MIC為0.27 mg/mL(見表1)。

表1 月桂揮發(fā)油的MIC

n指受試菌株數(shù),“-”表示月桂揮發(fā)油在平板中最大濃度(34.33 mg/mL)時無抗菌活性。臨床分離菌株中,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌2株,產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌2株,產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)大腸埃希菌5株

2.2 月桂揮發(fā)油的體外抗真菌活性

采用瓊脂平板2倍稀釋法測定了月桂揮發(fā)油對白假絲酵母菌和非白假絲酵母菌2種真菌的MIC。月桂揮發(fā)油對白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株與14株臨床分離株均有較強(qiáng)抗菌活性,MIC分別為0.27 mg/mL和0.07～0.54 mg/mL；對非白假絲酵母菌臨床分離株亦有較強(qiáng)的抗菌活性,MIC為0.03 mg/mL(見表2)。

表2 月桂揮發(fā)油體外抗真菌活性

n指受試菌株數(shù),2株白假絲酵母菌臨床分離株對克霉唑耐藥

2.3 月桂揮發(fā)油對不同種類病原微生物的抑菌活性比較分析

采用SPSS軟件的單因素方差分析法比較分析了月桂揮發(fā)油對含有4株以上受試菌種的抑菌活性強(qiáng)弱,并分析其MIC50和MIC90。月桂揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌的抑菌活性比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對白假絲酵母菌和洛菲不動桿菌的抑菌活性明顯強(qiáng)于對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌活性(P<0.01)(見表3)。

與月桂揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的MIC比較,﹡﹡P<0.01,與月桂揮發(fā)油對大腸埃希菌的MIC比較,★★P<0.01

3 討論

植物香料不僅具有調(diào)味作用,還具有一定的抗菌活性。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),芳香類植物精油具有明顯抗菌活性,具有潛在的天然食品防腐劑開發(fā)和利用價值。月桂為中國常見樹種,具有很好的觀賞價值,同時也作為香料廣泛運用于食品、化妝品和化工等領(lǐng)域。

目前關(guān)于月桂的研究主要集中于月桂揮發(fā)油化學(xué)成分和抗菌活性的研究,因地理環(huán)境和提取方法的差異,化學(xué)成分亦不盡相同。對于其抗菌活性的研究,國外主要側(cè)重于月桂揮發(fā)油在食品防腐保鮮的作用,如月桂揮發(fā)油對面包、胡蘿卜肉湯等食品儲藏過程中蠟樣芽胞桿菌、李斯特氏菌、大腸埃希菌、惡臭假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、空腸彎曲菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉、啤酒酵母、檸檬形克勒克酵母、白假絲酵母菌等食源性腐敗菌和致病菌的抑制作用[7,13,16]。此外,對于月桂提取物和單體鮮有報道,Ramos等[7]報道,月桂水提物和醇提物無明顯抗菌作用,有明顯抗氧化作用；富饒等[14]報道,月桂酸對番茄葉霉菌菌絲均具有不同程度的抑制作用；徐雨[15]報道,從月桂葉提取物分離的2種類黃酮活性成分,即山奈酚-3-O-α-L-(2″,4″-di-E-p-香豆?；?-鼠李糖苷和山奈酚-3-O-α-L-(2″-di-E-p-香豆?；?4″-Z-p-香豆?；?-鼠李糖苷對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌都表現(xiàn)出抗菌活性。

目前尚未見有關(guān)月桂揮發(fā)油抗臨床病原微生物的活性研究報道,本研究分析了月桂揮發(fā)油對臨床分離病原性細(xì)菌和真菌的抗菌活性。結(jié)果表明,月桂揮發(fā)油除對臨床分離的銅綠假單胞菌無明顯抗菌活性外,對臨床分離4種革蘭陽性菌和11種革蘭陰性菌均有明顯抗菌活性,MIC為0.27 mg/mL～2.15 mg/mL；對臨床分離的白假絲酵母菌以及非白假絲酵母真菌具有較強(qiáng)的抗菌活性,MIC為0.03～0.54 mg/mL。此外,本研究首次將單因素方差分析運用于月桂揮發(fā)油對不同種類病原微生物抗菌活性強(qiáng)弱的比較,分析了月桂揮發(fā)油對19株金黃色葡萄球菌、27株大腸埃希菌、6株肺炎克雷伯菌、4株洛菲不動桿菌和15株白假絲酵母真菌的抗菌活性強(qiáng)弱。結(jié)果表明,月桂揮發(fā)油對白假絲酵母真菌MIC (0.19±0.12)mg/mL的抗菌活性強(qiáng)于對細(xì)菌的抗菌活性,其中與革蘭陰性大腸埃希菌MIC(1.25±0.68)mg/mL和革蘭陽性金黃色葡萄球菌MIC(1.14±0.74)mg/mL的抑菌活性比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。比較月桂揮發(fā)油對不同種類細(xì)菌抑菌活性時發(fā)現(xiàn),月桂揮發(fā)油除對洛菲不動桿菌的抑菌活性明顯強(qiáng)于對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌外(P<0.01),對其它革蘭陽性菌與革蘭陰性菌的抑菌活性比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。比較分析月桂揮發(fā)油對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的MIC均值、MIC50和MIC90時發(fā)現(xiàn),月桂揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑菌活性相對強(qiáng)于對大腸埃希菌的抑菌活性。由此提示,月桂揮發(fā)油具有廣譜的抗病原微生物活性,具有運用于細(xì)菌和真菌所致感染性疾病的開發(fā)和運用前景。

面對愈演愈烈的全球細(xì)菌性耐藥難題,加強(qiáng)天然抗菌藥物的開發(fā)與利用成為目前科技工作者的重大攻關(guān)課題之一。為探討月桂揮發(fā)油對耐藥菌株和敏感菌株抑菌活性的差異,本研究受試菌中的標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株既包含了敏感株,也包含了耐藥株,如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)株ATCC43300和臨床分離株,以及產(chǎn)氨芐青酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌等多重耐藥菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn),月桂揮發(fā)油對敏感株和耐藥株的抗菌活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明月桂揮發(fā)油在治療各類感染性疾病,尤其是多重耐藥菌株引起的感染性疾病具有明顯優(yōu)勢,這在控制細(xì)菌耐藥性難題方面亦具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

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Antimicrobial Activity of the Essential Oil from Laurel

WANGCheng-cheng1,PUJing2*,JINJia-gui1,HUJie1,DAIJuan1,DAIMin1

(1.SchoolofLaboratoryMedicine,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China;2.TheFirstAffiliatedHospital,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China)

Objective To investigate the antimicrobial activity of the essential oil from laurel, to lay the foundations for development and application of laurel in treating infectious diseases. Methods Minimum inhibitory concentrations (MICs) of the essential oil of laurel against 65 strains of bacteria, 14 strains of Candida albicans and 1 strain of non-Candida albicans were determined by agar dilution method. The data were analyzed using statistical software SPSS 17.0, and multifactor analysis of variance (ANOVA) was used to compare the differences between different microorganisms. Results The essential oil from laurel had no effect on Pseudomonas aeruginosa, and the laurel oil showed different antibacterial activity to different species of other experimental bacteria, with MICs ranging from 0.27 mg/mL to 2.15 mg/mL. The laurel oil had strong activity against Candida albicans and non-Candida albicans, with MICs 0.07-0.54 mg/mL, 0.03 mg/mL, respectively. The laurel oil had higher activity against Candida albicans than S. aureus and E. coli (P<0.01), and the oil had higher activity against Acinetobacter lwoffii than S. aureus and E. coli (P<0.01). Conclusion The essential oil from laurel showed broad-spectrum antimicrobial activity so to make it a potential candidate as antimicrobial agent to treat infectious diseases.

Laurel; Essential Oil; In Vitro Antibacterial Activity; In Vitro Antifungal Activity

四川省衛(wèi)生廳項目(NO：130307)；四川省教育廳項目(NO：11ZB206)；成都醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新性實驗項目(NO：CX201209)；成都醫(yī)學(xué)院?；?NO:CYZ11-002)。

蒲靜,E-mail:yabaobaolin2012@163.com

10.3969/j.issn.1674-2257.2014.02.005

R285.5

A