玉屏風(fēng)藥液對環(huán)磷酰胺抑制的C57BL/6小鼠免疫功能的影響

陳健明，陳殿慧，余秀雪，李 璐，吳 凡，梁 輝，黃 俊

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510182；2. 廣東省廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東 廣州 511400；3. 廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518109)

論 著

玉屏風(fēng)藥液對環(huán)磷酰胺抑制的C57BL/6小鼠免疫功能的影響

陳健明1，2，陳殿慧1，余秀雪1，李 璐1，吳 凡1，梁 輝3，黃 俊1

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510182；2. 廣東省廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東 廣州 511400；3. 廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518109)

目的 觀察玉屏風(fēng)(YPF)藥液對環(huán)磷酰胺(CY)抑制C57BL/6小鼠免疫功能的影響。方法 腹部皮下注射環(huán)磷酰胺制作免疫抑制小鼠模型，分別使用玉屏風(fēng)藥液50 mg/d和100 mg/d給C57BL/6小鼠灌胃，連續(xù)7 d。7 d以后,眼眶取血，血常規(guī)檢測血細(xì)胞含量；制備脾淋巴細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)；流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞亞群的含量；使用R848刺激細(xì)胞72 h，MTT法檢測細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果 玉屏風(fēng)藥液可以抑制環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠血液中白細(xì)胞減少，部分緩解環(huán)磷酰胺所致的脾淋巴細(xì)胞減少，增加脾細(xì)胞中B細(xì)胞、NK細(xì)胞的含量，部分提高環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力。結(jié)論 玉屏風(fēng)藥液能夠部分緩解環(huán)磷酰胺對C57BL/6小鼠免疫功能的抑制作用。

玉屏風(fēng)藥液；環(huán)磷酰胺；脾臟；淋巴細(xì)胞；增殖

玉屏風(fēng)(YPF)一方由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)3種藥物組成，具有標(biāo)本兼治、扶正祛邪的功能。近年來玉屏風(fēng)免疫調(diào)節(jié)作用得到重視，臨床主要用于防治反復(fù)呼吸道感染[1]，在許多免疫功能異常疾病的治療中發(fā)揮了積極的作用。近年來流感病毒的變異株不斷出現(xiàn)，變異機(jī)制變得越來越復(fù)雜，如H7N9、H5N1等新亞型流感病毒，但一般最初僅在小范圍內(nèi)流行，感染機(jī)體抵抗力較差者。因此，給予中藥方劑加強(qiáng)機(jī)體的免疫力，或許能夠達(dá)到防治新型流感的效果。研究玉屏風(fēng)對機(jī)體的免疫增強(qiáng)作用及其作用機(jī)制，對臨床治療，特別是對新型流感病毒的防治有積極意義。本實(shí)驗(yàn)首先使用環(huán)磷酰胺制作免疫抑制小鼠模型，并對免疫抑制小鼠進(jìn)行玉屏風(fēng)藥液灌胃，通過血常規(guī)、脾臟淋巴細(xì)胞亞群含量和細(xì)胞增殖情況的檢測等方法來評價(jià)小鼠的免疫功能。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雌性6～8周SPF級C57BL/6小鼠12只，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 PerCP標(biāo)記抗小鼠CD19單克隆抗體，PE標(biāo)記抗小鼠CD3單克隆抗體，APC標(biāo)記抗小鼠DX5α單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗小鼠γδTCR單克隆抗體，購自于BD公司；牛血清白蛋白(BSA)，二甲基亞砜(DMSO)，購自于北京鼎國生物公司；RPMI1640培養(yǎng)基，購自于Gibco公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)，購自于深圳達(dá)科為公司；玉屏風(fēng)顆粒，環(huán)磷酰胺注射液，購自于廣東環(huán)球制藥有限公司；R848，臺式冷凍離心機(jī)(3K15)，二級生物安全柜，二氧化碳培養(yǎng)箱(170-300)，流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)，Coulter-JT全自動檢測儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物模型的制作及分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)正常組(N組)、環(huán)磷酰胺組(CY組)、玉屏風(fēng)組(高濃度組)和玉屏風(fēng)低濃度組(低濃度組)小鼠各3只。N組不做處理。CY組給予生理鹽水灌胃，每天200 μL，連續(xù)7 d，在實(shí)驗(yàn)的第3—5天，腹部皮下注射環(huán)磷酰胺注射液50 mg/kg，每天1次。低濃度組給予200 μL玉屏風(fēng)藥液50 mg/d灌胃，每天1次，連續(xù)7 d，在實(shí)驗(yàn)的第3—5天，腹部皮下注射環(huán)磷酰胺注射液50 mg/kg，每天1次。高濃度組給予200 μL玉屏風(fēng)藥液100 mg/d灌胃，每天1次，連續(xù)7 d，在實(shí)驗(yàn)的第3—5天，腹部皮下注射環(huán)磷酰胺注射液按50 mg/kg，每天1次。

1.4 標(biāo)本采集 末次給藥后1 h，經(jīng)1%戊巴比妥鈉0.1 mL麻醉后，取一側(cè)眼球，使用抗凝管收集血液，混勻，至4 ℃冰箱保存。在無菌操作下暴露小鼠腹腔，取脾臟。

1.5 血液中白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋折(Hb)、紅細(xì)胞壓積(HCT)的檢測 采血0.5～1 mL，注入肝素鈉抗凝管中送檢。Coulter-JT全自動檢測儀(美國庫爾特儀器公司生產(chǎn))檢測血WBC、RBC、Hb、HCT等，使用庫爾特儀器公司原配試劑，阻抗法測定。

1.6 脾臟淋巴細(xì)胞分離 將脾臟分離，置于200目的篩網(wǎng)中央，加少量D-Hanks液，用注射器針芯研磨。使用15 mL離心管收集過濾的細(xì)胞懸液，4 ℃、1 000 r/min、離心8 min。去上清，D-Hanks液重懸細(xì)胞，在新的15 mL離心管中加入5 mL小鼠淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)，將脾細(xì)胞懸液緩緩加入含用Ficoll的離心管中，并以較低的加速度和較低的減速度18 ℃、2 000 r/min離心20 min。取淋巴細(xì)胞，加Hanks液離心，洗滌細(xì)胞2次。后加入2 mL RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，0.4%臺盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度至2×109L-1。使用流式細(xì)胞儀觀察CD19+B細(xì)胞、DX5+NK細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞、DX5+CD3+NKT細(xì)胞以及γδTCR+γδT細(xì)胞的百分比含量。

1.7 細(xì)胞表面染色 將分離的淋巴細(xì)胞終濃度調(diào)至2×109L-1，取1 mL加入流式管中。每管加入2 mL PBS，混勻，2 000 r/min離心5 min，去上清，重復(fù)2次。將細(xì)胞懸液分裝到流式管中，每管100 μL。加入相應(yīng)熒光標(biāo)記抗體，室溫避光靜置30 min。每管加入細(xì)胞洗滌液2 mL，2 000 r/min離心10 min，重復(fù)2次。棄上清液，再加入染色液300 μL/管，重懸細(xì)胞。使用流式細(xì)胞儀(BD Calibur)進(jìn)行檢測，每管收集250 000個(gè)細(xì)胞，并用Cell Quest軟件分析檢測結(jié)果。

1.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 制備單個(gè)細(xì)胞懸液2×109L-1，細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μL。加入R848，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，共同培養(yǎng)68 h，每孔加MTT(噻唑藍(lán))溶液(5 g/L用PBS配制，pH=7.4)20 μL。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，離心10 min。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血細(xì)胞數(shù)量比較 CY組血白細(xì)胞數(shù)明顯低于N組(P<0.01)，表明免疫抑制模型成功。高濃度組白細(xì)胞比低濃度組有明顯上升(P<0.05)，2組均高于CY組(P均<0.05)。各組間紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白水平和紅細(xì)胞壓積比較均無顯著性差異(P均>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血細(xì)胞檢測結(jié)果比較±s)

注：①與N組比較，P<0.01；②與CY組比較，P<0.05；③與低濃度組比較，P<0.05。

2.2 各組小鼠脾細(xì)胞數(shù)量比較 CY組脾淋巴細(xì)胞數(shù)為(10.2±3.7)×109L-1，N組為(48.5±6.2)×109L-1，高濃度組脾淋巴細(xì)胞數(shù)為(20.4±3.8)×109L-1，低濃度組為(15.3±2.1)×109L-1，高、低濃度組均高于CY組(P均<0.05)。

2.3 各組小鼠T、B、NK、NKT和γδT細(xì)胞含量比較 細(xì)胞經(jīng)過CY抑制以后明顯出現(xiàn)淋巴細(xì)胞比例的變化，T細(xì)胞含量明顯高于N組，B細(xì)胞、NK細(xì)胞含量明顯低于N組，NKT細(xì)胞含量變化不大(P均<0.05),高濃度組B細(xì)胞比例比低濃度組有明顯上升(P<0.05)。而高、低濃度組之間的NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、γδT比例無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.4 各組小鼠淋巴細(xì)胞增殖情況比較 N組加入R848后，小鼠脾細(xì)胞的OD值明顯升高(P<0.05)。CY組小鼠脾細(xì)胞使用R848刺激前后OD值比較無顯著性差異(P>0.05)。低、高濃度組在R848刺激后CD值明顯高于CY組(P<0.05)，且高濃度組比低濃度組有明顯上升(P<0.05)。見表3。

3 討 論

玉屏風(fēng)是傳統(tǒng)的中藥方劑，其能改善患兒體液、細(xì)胞免疫功能，機(jī)體免疫力提高，在許多免疫功能異常疾病的治療中發(fā)揮了積極的作用[2-4]。研究表明玉屏風(fēng)散的生物轉(zhuǎn)化液能夠通過增強(qiáng)小鼠血清IL-2水平,顯著提高機(jī)體的免疫功能[5]。也有報(bào)道表明玉屏風(fēng)散的作用可能與血清IgE、IL-4下降, IFN-γ升高有關(guān)[6]。

表2 各組T、B、NK、NKT和γδT細(xì)胞含量比較

注：①與N組比較，P<0.05；②與CY組比較，P<0.05；③與低濃度組比較，P<0.05。

表3 各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖情況比較±s)

注：①與未加R484比較，P<0.05；②與CY組比較，P<0.05；③與低濃度組比較，P<0.05。

筆者首先對不同組小鼠進(jìn)行了血常規(guī)的檢測，結(jié)果表明環(huán)磷酰胺可使小鼠的血白細(xì)胞明顯降低，而白細(xì)胞減少癥是環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制功能的表現(xiàn)之一[7]。結(jié)果表明制作環(huán)磷酰胺免疫抑制模型成功。此外，玉屏風(fēng)高、低濃度組小鼠血液中的白細(xì)胞含量與環(huán)磷酰胺組相比明顯升高，這與潘小平等[8]報(bào)道的玉屏風(fēng)散可以治療白細(xì)胞減少癥是一致的。但玉屏風(fēng)藥液灌胃后，小鼠的紅細(xì)胞數(shù)上升不明顯，提示玉屏風(fēng)對骨髓等器官制造紅細(xì)胞的促進(jìn)作用不明顯。以上說明玉屏風(fēng)對外周血白細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，可增強(qiáng)免疫功能，從而對白細(xì)胞減少癥模型小鼠具有明顯治療作用，這為以后臨床推廣應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

脾臟是機(jī)體內(nèi)最大的免疫器官，也是體內(nèi)淋巴細(xì)胞的主要集聚場所[9]，體內(nèi)淋巴細(xì)胞的含量與免疫功能是密切相關(guān)的。因此，筆者也觀察了不同組別小鼠脾臟分離的淋巴細(xì)胞的含量。結(jié)果表明環(huán)磷酰胺可以明顯減少小鼠脾臟中淋巴細(xì)胞的數(shù)目，玉屏風(fēng)可以有效提高環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠脾臟中淋巴細(xì)胞的含量，進(jìn)一步表明玉屏風(fēng)具有免疫促進(jìn)功能。

T細(xì)胞和B細(xì)胞是介導(dǎo)機(jī)體抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)性細(xì)胞，NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和γδT細(xì)胞是介導(dǎo)天然免疫的主要細(xì)胞群，γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17等前炎癥細(xì)胞因子[10]。本研究結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺可以明顯降低小鼠脾臟中CD19+B淋巴細(xì)胞和DX5+NK細(xì)胞的含量，其機(jī)制可能與環(huán)磷酰胺抑制骨髓的造血功能有關(guān)[11]。其次，筆者發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)處理小鼠脾細(xì)胞中的B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的含量相對于環(huán)磷酰胺單獨(dú)處理組有明顯升高，表明玉屏風(fēng)可以部分緩解環(huán)磷酰胺對骨髓造血功能的抑制，玉屏風(fēng)的主要成分黃芪可能在此過程中發(fā)揮了重要的作用。張琰等[12]報(bào)道表明，黃芪多糖對環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓抑制及毒性有保護(hù)作用。

R848是一種小分子的咪唑喹啉類化合物，通過和TLR7TLR8來激活淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用[13]。抗原遞呈細(xì)胞以及許多淋巴細(xì)胞，如B細(xì)胞、NK等可以表達(dá)TLR7[14-15]。本研究使用R848在體外與淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)3 d，使用MTT的方法觀察了不同組小鼠在R848的作用下增殖的情況。結(jié)果表明玉屏風(fēng)灌胃也可以增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞對R848的反應(yīng)性，這可能與玉屏風(fēng)能夠刺激細(xì)胞分泌IL-2有關(guān)[5]。

綜上所述，玉屏風(fēng)藥液能夠部分緩解環(huán)磷酰胺對C57BL/6小鼠免疫功能的抑制作用，為進(jìn)一步明確玉屏風(fēng)的藥理機(jī)制提供了幫助。

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Effect of Yupingfeng solution on the immune function of C57BL/6 mice inhibited by Cyclophosphamide

Chen Jianming1,2，Chen Dianhui1，Yu Xiuxue1，Li Lu1，Wu Fan1，Liang Hui3, Huang Jun1

(1.School of Basic Medicine, Guangzhou Medical College, Guanghou 510182, Guangdong, China; 2.The Central Hospital of Fanyu District of Guangzhou, Guangzhou 511400, Guangdong, China; 3.The People’s Hospital of Longhua New District, Shenzhen 518109, Guangdong, China)

Objective It is to observe the effect of Yupingfeng (YPF) solution on the immune function of C57BL/6 mice treated with Cyclophosphamide. Methods Cyclophosphamide was given to C57BL/6 mice by abdominal subcutaneous injection to establish inhibit immune function models which were given YPF solution at dose of 50mg/d and 100 mg/d respectively by intragastric administration for 7 days. Blood tests were used to count the percentage of blood cells in different groups of mice. Microscope was used to count spleen cells in different groups of mice. The cell surface stain method was used to observe the percentage of lymphocyte subsets. MTT assay was used to observe cell proliferation after simulation for 72 h with R848. Results YPF can inhibit Cyclophosphamide-induced neutropenia, partly inhibit the reduction of mouse spleen lymphocytes, increase the contents of B cell, NK cell, partly promote lymphocytes proliferation in cyclophosphamide-treated mice. Conclusion YPF solution can partially relieve the inhibition effect of Cyclophosphamide in immune function of C57BL/6 mouse.

Yupingfeng solution, Cyclophosphamide; spleen; lymphocyte; proliferation

陳健明，男，碩士，研究方向?yàn)榕R床兒科免疫性疾病的治療。

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(A2012603)；廣州市高?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目(2012C117)

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.23.001

R-332

A

1008-8849(2014)23-2509-04

2014-01-05