熱休克蛋白70與重癥急性胰腺炎嚴(yán)重程度的關(guān)系

楊 娜，李學(xué)晉，梁增坤，王興鵬

(1. 河南省中牟縣中醫(yī)院，河南 中牟 451450；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453600；3. 上海市第一人民醫(yī)院，上海 200092)

熱休克蛋白70與重癥急性胰腺炎嚴(yán)重程度的關(guān)系

楊 娜1，李學(xué)晉2，梁增坤1，王興鵬3

(1. 河南省中牟縣中醫(yī)院，河南 中牟 451450；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453600；3. 上海市第一人民醫(yī)院，上海 200092)

目的 探討熱休克蛋白70(HSP70)與重癥急性胰腺炎嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。方法 在重癥急性胰腺炎大鼠模型復(fù)制成功后1 h、5 h、10 h，分別收集胰腺組織和血清；采用RealTime-PCR方法分別測定胰腺組織中HSP70 mRNA的表達(dá)情況，采用碘-淀粉比色法測定血清中淀粉酶水平，采用ELISA法測定血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。結(jié)果 在模型復(fù)制成功后1 h、5 h、10 h，胰腺組織HSP70 mRNA的表達(dá)呈明顯下降趨勢，大鼠血清中淀粉酶和TNF-α呈明顯升高的趨勢。結(jié)論 在重癥急性胰腺炎的發(fā)生過程中，胰腺組織HSP70表達(dá)逐漸下降，而胰腺組織的損傷程度逐漸加重，HSP70的低表達(dá)可能促使胰腺炎病情更加嚴(yán)重。

重癥急性胰腺炎；熱休克蛋白70；大鼠

重癥急性胰腺炎(SAP)是臨床上常見的急腹癥、危重癥，病死率居高不下，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，眾多學(xué)者提出了一系列學(xué)說，其中“急性胰腺炎自身消化學(xué)說”是一個經(jīng)典學(xué)說，目前認(rèn)為這一學(xué)說在SAP的發(fā)病過程中處于始動環(huán)節(jié)的地位[1-2]，但是胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)酶原異常激活的機(jī)制還存在很大爭議。目前研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白70(HSP70)與SAP的關(guān)系非常密切，HSP70可能參與了胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)酶原的異常激活[3-5]。為進(jìn)一步探討HSP70在SAP發(fā)病中的作用，筆者采用SAP大鼠模型進(jìn)行了相關(guān)研究，現(xiàn)報道如下。

1 實驗資料

1.1 SAP模型復(fù)制 選取體質(zhì)量為200～250 g的SD大鼠40只，雌雄各半，購自復(fù)旦大學(xué)動物中心。隨機(jī)將大鼠分為假手術(shù)組(Sham組，n=20)和SAP模型組(SAP組，n=20)。SAP大鼠模型的復(fù)制參照文獻(xiàn)[6]的方法，即受試動物于術(shù)前禁食不禁水12 h，1.5%的戊巴比妥鈉0.2 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉，無菌條件下行上腹正中切口，用動脈夾在近肝門處夾閉膽總管，經(jīng)胰管十二指腸開口處從胰膽管逆向加壓推注3%去氧膽酸鈉(0.1 mL/100 g體質(zhì)量，速度0.2 mL/min)，注射后壓迫進(jìn)針點1 min，解除膽管阻斷，分層關(guān)腹。Sham組不注射去氧膽酸鈉，其余操作同SAP組。造模后1 h、5 h、10 h，同上麻醉并取大鼠血液，離心取上清，并取胰腺組織置于液氮中留用。

1.2 胰腺組織HSP70 mRNA表達(dá)量檢測方法 參照Li等[6]的方法抽提胰腺組織中的mRNA，分光光度計檢測其260/280吸光度比值，計算RNA濃度；通過RNA的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，觀察18 s與28 s rRNA條帶。65 ℃ 5 min,變性RNA，立即放入冰浴，用PCR儀(ABI公司提供)進(jìn)行擴(kuò)增，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，反應(yīng)物進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性10 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s 40個循環(huán)擴(kuò)增。HSP70的相對表達(dá)量以特異性基因HSP70的copy數(shù)與內(nèi)參磷酸甘油酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的copy數(shù)的比值計算。HSP70及GAPDH引物序列用Primer510軟件設(shè)計，由大連寶生物公司合成。HSP70引物序列：上游為5'-GGCTATCGCTACTGGT-3'，下游為5'-GCAAGTCGCTCGTTCA-3'(目的片段237 bp)；GAPDH引物序列：上游為5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游為5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(目的片段452 bp)。

1.3 血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的檢測 參照定量ELISA試劑盒(Sigma)說明書測定。

1.4 血清中淀粉酶的檢測 參照淀粉酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書測定。

2 結(jié) 果

2.1 2組大鼠胰腺組織中HSP70 mRNA表達(dá)情況比較 Sham組和SAP組胰腺組織中的mRNA的5S、18S、28S亞基完整，見圖1；Sham組和SAP組胰腺組織中mRNA的熒光定量PCR曲線，見圖2；復(fù)制SAP模型后1 h，胰腺組織HSP70 mRNA的相對表達(dá)量最高，在隨后的5 h、10 h時間點上，胰腺組織HSP70 mRNA的相對表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯下降趨勢；在1 h時，SAP組與Sham組相比，HSP70 mRNA的相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；5 h時，SAP組與Sham組相比，HSP70 mRNA的相對表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)；10 h時，SAP組與Sham組相比，HSP70 mRNA的相對表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。見表1。

圖1 胰腺組織RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳

2.2 2組大鼠血清中淀粉酶水平比較 復(fù)制SAP模型后1h、5h、10h時間點上，大鼠血清中淀粉酶呈現(xiàn)出明顯升高的趨勢；在1 h時，SAP組與Sham組相比，血清中淀粉酶的含量無顯著性差異(P>0.05)；5 h、10 h時，SAP組與Sham組相比，血清中淀粉酶的含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

圖2 熒光定量PCR儀的擴(kuò)增曲線

組別1h5h10hSham組7.825±0.5768.326±0.7317.457±0.829SAP組15.476±1.327①②9.832±0.972②3.521±0.673①

注：①與Sham組比較，P<0.05；②與10 h SAP組比較，P<0.05。

表2 2組大鼠血清中淀粉酶水平比較

注：①與Sham組比較，P<0.05；②與1 h SAP組比較，P<0.05。

2.3 2組大鼠血清中TNF-α水平比較 復(fù)制SAP模型后1 h、5 h、10 h，大鼠血清中TNF-α呈現(xiàn)出明顯升高的趨勢；在1 h時，SAP組與Sham組相比，血清中TNF-α水平無顯著性差異(P>0.05)；5 h、10 h時，SAP組與Sham組相比，血清中TNF-α的水平明顯升高(P均<0.05)。見表3。

表3 2組大鼠血清中TNF-α水平比較

注：①與Sham組比較，P<0.05；②與1 h SAP組比較，P<0.05。

3 討 論

近年來，眾多學(xué)者認(rèn)為胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原等的過早激活是SAP的早期事件，在SAP的發(fā)病過程中起到了扳機(jī)的關(guān)鍵作用，各種病因觸發(fā)胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原、脂肪酶原等的激活，導(dǎo)致腺泡細(xì)胞的損傷和整個胰腺組織的破壞，進(jìn)而累及機(jī)體多系統(tǒng)、多器官[7-9]。然而對胰酶胞內(nèi)激活的機(jī)制，迄今并不十分清楚。

HSP70是HSP家族中的一員，是一種與細(xì)胞應(yīng)激損傷關(guān)系密切的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核及真核細(xì)胞中，具有高度保守的序列。研究發(fā)現(xiàn)，如同其他的熱休克蛋白一樣，它在正常細(xì)胞中表達(dá)很低,但是在高溫、缺氧、寒冷、感染、饑餓、創(chuàng)傷、中毒等因素刺激下表達(dá)增強(qiáng),對提高細(xì)胞耐受應(yīng)激的能力、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的作用,認(rèn)為是細(xì)胞的一種自身保護(hù)機(jī)制[10-12]。Lee等[13]發(fā)現(xiàn)，冷水浸浴法(CWI)預(yù)刺激能特異性地誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞HSP60的合成，誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP能完全抑制雨蛙肽誘導(dǎo)的大鼠胰腺炎，并呈劑量相關(guān)性，并認(rèn)為HSP能阻止細(xì)胞溶酶體組織蛋白酶B向消化酶原顆粒豐富部位移位，從而阻止溶酶體蛋白水解酶-組織蛋白酶B與消化酶的共區(qū)域化，抑制胰腺細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原的激活，減輕雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎模型的胰腺病理改變。本實驗結(jié)果表明，在復(fù)制SAP模型后1 h，胰腺組織中HSP70 mRNA的表達(dá)增高，是胰腺細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的表現(xiàn)，具有重要的代償意義；在復(fù)制SAP模型后5 h以及10 h，胰腺組織中HSP70 mRNA的表達(dá)量持續(xù)顯著下降，并且胰腺組織損傷程度更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為血清中的淀粉酶及TNF-α水平明顯升高等。提示胰腺組織HSP70的表達(dá)下降可提高胰腺組織對損傷因子的敏感性，在胰腺腺泡中,低表達(dá)的HSP70可能參與酶原的過早激活進(jìn)而使胰腺組織發(fā)生自身消化，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞聚集和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，HSP70的低表達(dá)可能促使胰腺炎的病情更加嚴(yán)重。綜上，本研究在整體水平上初步揭示HSP70與SAP之間的關(guān)系，對于HSP70如何參與胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原的過早激活尚需要進(jìn)一步的研究闡明。

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Relationship between Heat shock protein 70 and the severity of severe acute pancreatitis

Yang Na1, Li Xuejin2, Liang Zengkun1, Wang Xingpeng3

(1. The Traditional Chinese Medical Hospital of Zhongmou County, Zhongmou 451450, Henan, China; 2. Sanquan College of Xinxiang Medical College, Xinxiang 453600, Henan, China; 3. The First People's Hospital of Shanghai, Shanghai 200092, China)

Objective It is to explore the relationship of Heat shock protein 70 with the severity of severe acute pancreatitis. Methods Pancreatic tissues and serum were collected respectively in 1h, 5h, 10h after severe acute pancreatitis models were copied successfully. Realtime-PCR was used to detect the expression of HSP70 mRNA in pancreastic tissue. Iodin-amylum colorimetry was used to detect amylase level in the serum.ELISA was used to detect the level of TNF-α in the serum. Results In 1 h, 5 h, 10 h after severe acute pancreatitis models were copied successfully. the expression of pancreas HSP70 mRNA appeared downward trend (P<0.05), the amylase and TNF-α level in serum of rat appeared increased trend significantly (P<0.05). Conclusion In the process of the occurrence of severe acute pancreatitis, the expression of pancreas HSP70 gradually decreased, and the degree of injury was more severer, lower expression of HSP70 may increase the severity of acute pancreatitis.

severe acute pancreatitis； Heat shock protein 70; rat

楊娜，女，主治醫(yī)師，研究方向為消化系統(tǒng)疾病。

王興鵬，E-mail：xpwcn@public7.sta.net.cn

國家自然科學(xué)基金資助項目(30770978)

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.13.002

R0657.51

A

1008-8849(2014)13-1372-03

2013-12-30