組織工程平滑肌構(gòu)建的研究進(jìn)展

鞏長鳳 侯 雷 於學(xué)禪 呂靜靜 竺亞斌

(浙江省寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 寧波 315211)

組織工程平滑肌構(gòu)建的研究進(jìn)展

鞏長鳳 侯 雷 於學(xué)禪 呂靜靜 竺亞斌*

(浙江省寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 寧波 315211)

平滑肌在人和動物體內(nèi)分布廣泛，普遍存在于消化道、呼吸道、血管、泌尿、生殖等諸多內(nèi)臟器官中，通過收縮蠕動來協(xié)助器官的功能發(fā)揮，是重要的功能組織。平滑肌組織工程的研究目的就是要為這些組織和器官的功能化重建提供支撐。目前關(guān)于單純平滑肌組織工程研究的報道并不太多，大多的研究主要結(jié)合在諸如血管、胃腸等組織/器官的構(gòu)建中。對于平滑肌的構(gòu)建仍然存在諸如生物材料的性能不可控、支架的制備技術(shù)較單一、種子細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)和生物功能較欠缺、以及動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)不完善等問題，實(shí)驗(yàn)室研究與實(shí)際應(yīng)用還存在較大距離。本文主要從種子細(xì)胞的獲取及支架構(gòu)建兩大方面闡述平滑肌組織工程的研究進(jìn)展。從干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞的研究示例中展望干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的前景。

平滑肌細(xì)胞； 干細(xì)胞； 平滑肌組織工程； 構(gòu)建

引言

平滑肌是一種具有自律性的無橫紋肌肉組織，受內(nèi)臟植物神經(jīng)的支配，能夠緩慢而持久的進(jìn)行收縮蠕動，主要分布于如食道、胃腸、氣管、心臟以及血管壁內(nèi)臟器官。其主要功能是收縮和擴(kuò)張，尤其在食道、胃、腸等消化器官中，平滑肌通過縮短或產(chǎn)生張力來使器官發(fā)生運(yùn)動或變形，使這些器官完成物質(zhì)的運(yùn)輸和存儲；在血管、括約肌等組織器官中，平滑肌又通過持續(xù)性的收縮或緊張性的收縮使器官對抗外力來保持形狀，維持血液的流通。盡管在不同的組織器官中，平滑肌的功能特性和調(diào)節(jié)機(jī)制不盡相同，但都與平滑肌的收縮擴(kuò)張相關(guān),平滑肌的這一特性對各個組織器官功能的發(fā)揮起到了至關(guān)重要的作用。

平滑肌組織由平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell, SMC)構(gòu)成，在生物體內(nèi)，SMC以合成型和收縮型兩種形態(tài)存在，處于合成型時SMC增殖能力旺盛，屬細(xì)胞增殖階段，合成分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，能夠很好的保持組織的力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)完整性。而在收縮型階段，SMC中肌絲蛋白豐富，細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌減少，細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘形態(tài)，緊密排列成肌束。SMC的這兩種形態(tài)在體內(nèi)可以有規(guī)律的相互轉(zhuǎn)換，使組織器官發(fā)揮其生物功能[1]。在細(xì)胞離體培養(yǎng)時，由于微觀環(huán)境的不同，尤其力學(xué)刺激的喪失，SMC容易不自覺地發(fā)生類型轉(zhuǎn)換，從收縮型轉(zhuǎn)化為合成型[2]，很難呈現(xiàn)類似體內(nèi)平滑肌的緊張性和伸展性，而使相應(yīng)的功能無法實(shí)現(xiàn)。因此，在工程化組織構(gòu)建中，人們努力尋找方法引導(dǎo)SMC由合成型向收縮型的轉(zhuǎn)變，這也是工程化組織構(gòu)建中的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。在現(xiàn)階段，平滑肌組織工程的研究雖已經(jīng)取得了較大進(jìn)步，但也還存在一些問題，離真正的臨床試驗(yàn)和應(yīng)用還有較大的距離。下面就平滑肌組織工程的研究進(jìn)展作一概述。

1 種子細(xì)胞的獲取

種子細(xì)胞、支架材料及二者的有機(jī)結(jié)合是組織工程研究中的三要素。其中種子細(xì)胞是組織工程平滑肌構(gòu)建中很重要的要素之一。對它的研究包括種子細(xì)胞的來源、體外增殖、功能分化及其動物體內(nèi)移植等。對于SMC的獲取概括起來可以分為兩種方法，一種是通過獲取自體組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，另一種方法是通過干細(xì)胞誘導(dǎo)分化來獲得。原代細(xì)胞作為種子細(xì)胞仍被眾多學(xué)者在研究中應(yīng)用，但原代細(xì)胞來源和數(shù)量有限，多次傳代增殖容易老化。隨著干細(xì)胞技術(shù)的日益發(fā)展和完善，很多學(xué)者轉(zhuǎn)向以干細(xì)胞為種子細(xì)胞，研究其向平滑肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及機(jī)制，這也成為了組織工程種子細(xì)胞研究中的熱點(diǎn)之一。

1.1原代平滑肌細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)

來自于動物體內(nèi)的SMC被認(rèn)為是種子細(xì)胞的良好來源。從動物組織中獲取原代SMC主要采用酶消化和組織塊貼壁等二種方法。從20世紀(jì)70年代起，體外培養(yǎng)SMC的研究報道開始出現(xiàn)。1971年Campbell等采用酶消化法從雞胚組織中分離得到了平滑肌細(xì)胞[3]。同年，Ross等采用組織塊貼壁法也成功培養(yǎng)出了豚鼠主動脈的平滑肌細(xì)胞[4]，此后，通過酶消化法和組織塊貼壁法獲取原代SMC的研究和應(yīng)用越來越多。

楊等將Wistar大鼠處死后，無菌操作取出胸主動脈，用含有青霉素-鏈霉素的D-Hanks液反復(fù)漂洗，剝離血管外膜，剪開后刮除血管內(nèi)膜，再次漂洗后用眼科剪剪碎，浸入含有復(fù)合膠原酶(0.2%的Ⅰ型膠原酶和0.2%的Ⅱ型膠原酶)的DMEM培養(yǎng)基3～5 mL中，37℃搖晃8～10 h，使血管組織完全裂解，1000 r/min離心10 min后棄上清，用含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)，24 h后觀察到細(xì)胞附壁伸展，形態(tài)為梭型，對第3代的細(xì)胞進(jìn)行特異性肌動蛋白免疫細(xì)胞染色后，細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，獲取的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞[5]。Teng等用戊巴比妥鈉(25mg/kg)深度麻醉小鼠，剖開胸部取出冠狀動脈，剝離周圍結(jié)締、脂肪組織后用Hank’s緩沖液沖洗，剪塊然后用酶消化液(1 mg/mL膠原Ⅰ型酶、0.5 mg/mL蛋白酶抑制劑、3%牛血清蛋白、2%抗生素)消化90 min，1 000 r/min離心10 min后棄上清，用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、10%鼠血清蛋白、2%抗生素)重懸，置于包被了2%明膠的六孔板中培養(yǎng)。5 d后細(xì)胞開始爬出，10 d后傳代培養(yǎng)，進(jìn)行α-actin和smooth muscle myosin heavy chain的免疫組化檢測，97%以上的細(xì)胞呈現(xiàn)陽性結(jié)果[6]。Peng等從wistar大鼠體內(nèi)獲取肺動脈，用解剖鑷和剪刀除去結(jié)締組織、脂肪組織及外膜等，生理鹽水沖洗，剪成小塊后放至生理鹽水消化液(含有1 750 U/mL的Ⅰ型膠原酶、9.5 U/mL的木瓜蛋白酶、2 mg/mL的牛血清蛋白、1 mM二硫蘇糖醇)中37℃作用22 min，傾倒上清消化液，然后將組織塊碾碎，再加入5 mL生理鹽水吹打，300g離心10 min，棄上清后用含有5%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸后培養(yǎng)，3 d后細(xì)胞開始增殖、擴(kuò)散，形態(tài)呈現(xiàn)梭型，一周后生長達(dá)到80%，經(jīng)免疫組化和western blot鑒定，細(xì)胞表達(dá)a-smooth muscle actin和β-actin，最終證明了培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞[7]。

由于SMC自身具有較強(qiáng)的爬伸、遷移能力，因此，組織塊貼壁法也是目前較為常用的獲取種子細(xì)胞的方法之一，而且這種方法操作簡單，細(xì)胞未受到酶消化過程中的損傷，細(xì)胞活性較好。早在1907年，Harrison等在無菌條件下以淋巴液作培養(yǎng)基，將蛙胚神經(jīng)組織直接貼壁于培養(yǎng)瓶底面，獲得了神經(jīng)細(xì)胞，這是最早以組織塊貼壁法體外培養(yǎng)細(xì)胞的例子。此后，很多組織的細(xì)胞逐漸被嘗試以此法培養(yǎng)并獲得成功。Bygglin等為了在體外研究功能障礙的平滑肌細(xì)胞會引發(fā)動脈瘤形成，通過貼壁法培養(yǎng)了平滑肌細(xì)胞，首先通過手術(shù)獲取了顱內(nèi)動脈瘤組織，收集到含有青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(5 mL/500 mL)中，然后用磷酸緩沖液(PBS)清洗，切成2～4 mm大小的塊，貼壁于培養(yǎng)皿中，用含有10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素(5 mL/500 mL)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，一周后有細(xì)胞爬出，免疫檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌有α-SMA 和calponin，且在早期的幾次傳代中能夠維持原有的平滑肌細(xì)胞表型特點(diǎn)[8]。Hu等從雄性SD大鼠獲取了主動脈，用微型手術(shù)鑷將血管的內(nèi)皮刮除，切成大約1～2 mm的小塊，貼于2%明膠包被的培養(yǎng)皿中，用DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)，一周后細(xì)胞爬出約占40%，呈長梭型，以anti-actin抗體和 anti-SM22 抗體為一抗進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果呈現(xiàn)陽性，生長曲線測定顯示平滑肌細(xì)胞呈現(xiàn) “谷峰”狀生長趨勢，培養(yǎng)出的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞[9]。

為了在保持細(xì)胞活性的同時提高培養(yǎng)效率，有人采用將上述兩種方法結(jié)合進(jìn)行原代細(xì)胞的培養(yǎng)。Wang等從豚鼠獲取了螺旋動脈組織，將組織剪塊后用0.1%的胰酶消化液37℃作用20 min，然后將1～2 mm大小的組織塊貼壁培養(yǎng)于35 mm的培養(yǎng)皿中，一周后動脈平滑肌細(xì)胞從組織周圍爬出，經(jīng)臺盼藍(lán)活力鑒定，細(xì)胞活力高于90%，分別進(jìn)行了a-smooth muscle actin、myosin、vWF的免疫熒光鑒定，vWF組的細(xì)胞未被熒光著色，a-smooth muscle actin、myosin組鑒定的細(xì)胞均出現(xiàn)熒光，證明了培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞，先用酶解法對剪碎的組織塊進(jìn)行消化、再將未消化完全的組織塊進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，獲取的平滑肌細(xì)胞純度高活性大[10]。經(jīng)過酶消化作用的組織塊，細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相對松散，其中的細(xì)胞更容易從組織塊爬出，縮短了培養(yǎng)時間，也減少了酶消化法對細(xì)胞的損傷。

1.2干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法

足量且具備特定生物學(xué)活性的種子細(xì)胞是組織構(gòu)建成功的前提，而原代細(xì)胞作為種子細(xì)胞存在數(shù)量不足、來源缺乏的問題，通過體外傳代擴(kuò)增，容易引起細(xì)胞老化、功能喪失等。于是人們將注意力轉(zhuǎn)向具有無限的增殖和分化能力的干細(xì)胞。干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為SMC，是平滑肌組織工程研究的重點(diǎn)之一，為提供大量平滑肌種子細(xì)胞提供了有效方法[11-12]。

1.2.1胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)是從早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來的，體外培養(yǎng)時具有無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ESC細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為幾乎所有種類的機(jī)體細(xì)胞。Chou等將ESC種植在包被了轉(zhuǎn)化生長因子β的聚合膠原(Ⅰ型)纖維(polymerized type I collagen fibrils)上，48 h后，細(xì)胞能夠表達(dá)多種平滑肌細(xì)胞特異性蛋白，如：鈣調(diào)蛋白、肌動蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白(SM-MHC)，說明此種膠原支架具有誘導(dǎo)ESC向SMC轉(zhuǎn)化的潛能，并且能夠影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21CIP1、p27KIP1、Cyclin A和D1、Cdk2等的分泌，從而調(diào)控平滑肌細(xì)胞的擴(kuò)增和分化[13]。Huang等將ESCs種植在一個多孔的聚氨酯材料的管狀支架上，在含有內(nèi)皮生長因子VEGF的培養(yǎng)基中靜態(tài)培養(yǎng)2 d，然后在模擬血管流體和圓周離心的動態(tài)的條件下繼續(xù)培養(yǎng)了2 d，經(jīng)肌動蛋白免疫組化鑒定，多孔材料孔內(nèi)細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞[14]。Hill等將ESCs培養(yǎng)在改良的分化培養(yǎng)基(內(nèi)含15%的knockout血清替代品、1%必須氨基酸、2 mM的L-谷氨酸、0.1 mM的β-巰基乙醇、8 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子)環(huán)境中13～15 d，然后轉(zhuǎn)移到一個纖連蛋白包被的培養(yǎng)皿中，用含高糖的添加了轉(zhuǎn)化因子β1和PDGF-BB的培養(yǎng)基培養(yǎng)，2 d后進(jìn)行SM22、鈣調(diào)蛋白、肌動蛋白免疫組化檢測，證明有平滑肌細(xì)胞的生成[15]。

胚胎干細(xì)胞雖然是一個無限的種子細(xì)胞資源，體外培養(yǎng)方法以及體內(nèi)轉(zhuǎn)化研究的進(jìn)步也都展現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞用于組織工程的潛能，但由于ESC的獲取存在倫理和排斥等諸多障礙，限制了其在組織工程器官構(gòu)建中的應(yīng)用。

1.2.2間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)是存在于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要分布于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，因此也稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cell, BMSC)。BMSC具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下已被誘導(dǎo)分化為肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞等多種細(xì)胞。Li等從小鼠骨髓獲得了BMSC，在SMC培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞分泌的肝細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子等隨之增加，而且各類平滑肌細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)也增加，并出現(xiàn)了平滑肌細(xì)胞特有的“峰谷”生長特征[16]。肝細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向SMC分化起到了重要的促進(jìn)作用。Sharma等將人的BMSC種植在由辛二醇檸檬酸制成的彈性薄膜上，移植到大鼠膀胱損傷處，10周后，發(fā)現(xiàn)原損傷處形成了有序的平滑肌束。損傷的刺激以及自體SMC營造的微環(huán)境誘導(dǎo)促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞的分化[17]。徐等將BMSC與血管SMC混合培養(yǎng)，并以間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)為對照，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞間的直接接觸可以促進(jìn)BMSC向平滑肌細(xì)胞的分化[18]。間充質(zhì)干細(xì)胞來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，在體內(nèi)器官組織的重建中存在著巨大的潛力。

1.2.3脂肪干細(xì)胞

脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSC)是近幾年來從脂肪組織中分離得到的具有多向分化潛能的一種干細(xì)胞。ADSC能夠在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，同時它具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細(xì)胞、適宜大規(guī)模培養(yǎng)、對機(jī)體損傷小等優(yōu)點(diǎn)。Harri等從臍帶脂肪組織獲取了脂肪干細(xì)胞，并用含有血管緊張素、轉(zhuǎn)化生長因子β1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，經(jīng)基因擴(kuò)增、蛋白印跡等方法測定，分化后的細(xì)胞表達(dá)了調(diào)寧蛋白、鈣結(jié)合蛋白以及ASMA、SM22等，然后將初步分化的脂肪干細(xì)胞種植在由膠原材料制備的支架上，采用模擬血管流體腔的生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞粘附并擴(kuò)增，血管平滑肌特異性蛋白(α-actin)分泌量增加，證實(shí)ADSC能夠用于組織工程構(gòu)建研究[19]。Zhao等從新西蘭大白兔腹股溝處獲取脂肪組織，培養(yǎng)獲得脂肪干細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，能夠形成有序的平滑肌細(xì)胞束[20]。Wang等從SD大鼠的腹股溝脂肪處獲取組織，體外培養(yǎng)獲得了ADSC，用自制的模具構(gòu)建出了聚乳酸 (PLGA) -ADSCs-PLGA夾層的管狀復(fù)合物，培養(yǎng)基內(nèi)添加肝細(xì)胞生長因子、血小板生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維生長因子進(jìn)行培養(yǎng)，有平滑肌樣細(xì)胞產(chǎn)生[21]。通過改變細(xì)胞生長條件，可對脂肪干細(xì)胞生長、遷移、擴(kuò)增以及分化進(jìn)行誘導(dǎo)，而且脂肪組織來源廣泛，體內(nèi)儲備量大，適宜自體移植，這些優(yōu)點(diǎn)使ADSCs成為了組織工程和器官重建研究中的重要的種子細(xì)胞來源。

1.2.4誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞及其他種類干細(xì)胞

誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced- pluripotent stem cells, iPSC)是由動物體細(xì)胞經(jīng)多種誘導(dǎo)因子(oct4，c-myc，sox2，klf4等)轉(zhuǎn)染，在一定條件下轉(zhuǎn)化為與ESC形態(tài)、功能類似的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，并表達(dá)干細(xì)胞基因和蛋白[22]。1962年，Gurdon通過實(shí)驗(yàn)將蝌蚪細(xì)胞的細(xì)胞核移植到卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，培育出了成體青蛙，首次證實(shí)了分化了的細(xì)胞基因組是可以逆轉(zhuǎn)變的。2006年，山中伸彌等科學(xué)家，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將基因轉(zhuǎn)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和成年小鼠尾部末端成纖維細(xì)胞中，使它們轉(zhuǎn)變?yōu)閕PSCs，并在2007年用同樣的方法誘導(dǎo)人體表皮細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂信咛ジ杉?xì)胞活動特征的人體iPSC。iPSC又可經(jīng)誘導(dǎo)分化為所需要的其他種類的體細(xì)胞，免除了從人體胚胎提取干細(xì)胞的倫理道德限制，這是干細(xì)胞研究中里程碑式的進(jìn)步，在干細(xì)胞研究及應(yīng)用中具有廣泛的前景。

Yoshida等采用平滑肌細(xì)胞分化培養(yǎng)基對小鼠來源的iPSC進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)6 d后轉(zhuǎn)移至12孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)免疫熒光檢測在培養(yǎng)板上形成了平滑肌細(xì)胞及粘膜細(xì)胞，表現(xiàn)出平滑肌細(xì)胞束的縱向收縮活動和能夠自發(fā)的有節(jié)奏收縮的心肌樣細(xì)胞，使iPSC應(yīng)用于平滑肌組織及相關(guān)器官的損傷修復(fù)及組織工程構(gòu)建成為可能[23]。Xie等用含有全反式維甲酸分化培養(yǎng)基對iPSC進(jìn)行培養(yǎng)，8～10 d后對培養(yǎng)細(xì)胞的檢測發(fā)現(xiàn)，全反式維甲酸的濃度能夠影響iPSC向SMC的誘導(dǎo)分化[24]。隨著人們對多功能干細(xì)胞研究的增多，更多的誘導(dǎo)方法會被人們發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞將會真正的應(yīng)用到組織工程的構(gòu)建中，從而解決種子細(xì)胞的來源問題。

2 支架構(gòu)建以及與種子細(xì)胞的復(fù)合

組織工程平滑肌廣被科學(xué)家們用于如胃、腸、食道、血管等器官的損傷修復(fù)以及替代研究，期望這種治療方法能夠取代傳統(tǒng)的手術(shù)切除，減少并發(fā)癥并減輕病人的痛苦。組織工程化組織/器官的構(gòu)建其最終目的是實(shí)現(xiàn)體內(nèi)應(yīng)用，為此，平滑肌組織工程構(gòu)建物必須在結(jié)構(gòu)和功能上與體內(nèi)相似，平滑肌的肌束方向、胃腸等器官的平滑肌管狀形態(tài)等都是重要的研究內(nèi)容。

2.1平滑肌支架的制備

圖1 三維結(jié)構(gòu)支架制作過程圖及支架上細(xì)胞形態(tài)圖[30]。(a)三維微結(jié)構(gòu)的制作過程圖；(b) SMCs種植3 d后的形態(tài)；(c)SMCs種植7 d后的形態(tài)Fig.1 Fabrication process of a microstructured biodegradable film and graphics of cells on microstructured biodegradable scaffold [30]. (a) Fabrication process of a microstructured biodegradable film; (b) SMCs after 3 days’ culture；(c) SMCs after 7 days’ culture.

生物體內(nèi)的SMC是以收縮型和合成型兩種形式存在，它們在體內(nèi)有規(guī)律的轉(zhuǎn)換，才能維持肌組織生物功能的發(fā)揮。然而經(jīng)體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞，多呈現(xiàn)合成型，為完善體外構(gòu)建的組織工程平滑肌的結(jié)構(gòu)和功能，人們首先考慮使體外培養(yǎng)的合成型SMC轉(zhuǎn)換為收縮型的SMC?？茖W(xué)家們已發(fā)現(xiàn)不僅多種生長因子、細(xì)胞因子及黏連蛋白等都對SMC表型的轉(zhuǎn)換有影響，而且用于支持細(xì)胞生長的支架的物理和化學(xué)性質(zhì)也同時對細(xì)胞的形貌和功能產(chǎn)生重要的影響[25]。Stegemann等發(fā)現(xiàn)二維的單層培養(yǎng)對細(xì)胞的功能具有約束，于是對體外三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行了研究，結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)、各類生長因子以及物理或化學(xué)刺激對細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換的影響，展現(xiàn)了對調(diào)控平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的新思路[26]。以Ⅰ型膠原制成模擬細(xì)胞外基質(zhì)的立體支架，將平滑肌細(xì)胞種植于上，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)和蛋白測定，這種三維結(jié)構(gòu)的膠原蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并分泌平滑肌細(xì)胞特有肌動蛋白α-actin[27]。Shen等以彈性較好的聚氨酯為材料，制備了不同微槽尺寸的三維支架，分別在微槽中種植SMC和骨骼肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在寬度為40μm的微槽內(nèi)有肌纖維產(chǎn)生，因此認(rèn)為這種三維的微槽結(jié)構(gòu)能夠引導(dǎo)SMC的取向生長和表型轉(zhuǎn)換，有利于維持SMC的收縮功能[28]。聚氨酯具有良好的力學(xué)性能，塑形容易，可作為細(xì)胞組織構(gòu)建的穩(wěn)定支撐，但其與生物體的相容性還需要更多的評測，其降解速度也相對偏慢[29]。后來，Shen等又以己內(nèi)酯、丙交酯和丙烯酸的共聚物為基材，以圖案化硅片為母版，結(jié)合紫外光引發(fā)交聯(lián)技術(shù)，制備了具有微槽結(jié)構(gòu)的三維支架(見圖1)[30]，相較于兩維的平面支架，SMC更能夠沿微槽方向取向排列并生長，且α-actin表達(dá)增加，進(jìn)一步證明了三維微槽支架能夠促使SMC由合成型向收縮型轉(zhuǎn)換，這種三元共聚物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為-42.3℃，遠(yuǎn)低于動物體溫，因此在體內(nèi)可以體現(xiàn)良好的彈性。此三元共聚物以己內(nèi)酯為主要成分(含量約為60 %)，疏水性強(qiáng)。而且聚己內(nèi)酯是半結(jié)晶性聚合物，降解速率較緩慢[31]，因此，其降解速度是否與平滑肌的生長相匹配，尚不可知。

靜電紡絲是一種制備納米纖維生物支架的技術(shù)，模擬生物體細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)納米級結(jié)構(gòu)，制備組織工程用支架，被學(xué)者們用于平滑肌組織工程構(gòu)建中誘導(dǎo)細(xì)胞的趨向生長。Zhu等采用靜電紡絲系統(tǒng)制備了以聚己內(nèi)酯為材料的有序纖維支架，并在其表面包被了纖維蛋白，種植人的臍動脈平滑肌細(xì)胞后，直徑合適的支架纖維能夠引導(dǎo)SMC的取向，使SMC從合成型轉(zhuǎn)化為收縮型平滑肌細(xì)胞，從而為引導(dǎo)體外SMC的取向生長提供了又一種切實(shí)可行的方法[32]。聚己內(nèi)酯是一種常用的非結(jié)晶性高分子材料，具有較低的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，由于其較強(qiáng)的疏水性使其降解速率明顯小于如聚乳酸、聚羥基乙酸等相對親水性的聚合物，需要更多的改性或改造來提高其親水性，使其在電紡應(yīng)用中既能保持良好的力學(xué)性能和熱降解性，又能呈現(xiàn)較好的生物可降解性[33]。

除了上述三維微槽和電紡絲技術(shù)，適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刺激對于SMC的功能維持也非常重要。Boonen等從小鼠的下肢肌肉中提取肌肉祖細(xì)胞，將其種植在包被了層粘連蛋白和膠原蛋白的培養(yǎng)皿中，經(jīng)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖后，種植在硅膠薄膜上，置于與拉力設(shè)備相聯(lián)的培養(yǎng)系統(tǒng)中，模擬體內(nèi)的動態(tài)拉伸運(yùn)動，對細(xì)胞進(jìn)行間歇的拉伸刺激，經(jīng)過肌球蛋白、RNA測定以及型貌觀察，細(xì)胞的肌動蛋白、肌球蛋白的分泌量增加，細(xì)胞呈現(xiàn)有序性生長[34]。Gauvin分離大鼠真皮纖維母細(xì)胞，種植在一個帶有固定框架的明膠包被的組織培養(yǎng)盤中，在周期性的動態(tài)拉力刺激下細(xì)胞基質(zhì)及細(xì)胞骨架呈現(xiàn)方向性的排列，單軸拉伸試驗(yàn)結(jié)果表明骨骼肌的力學(xué)性能得到明顯提高[35]。機(jī)械刺激對要求方向性活動的肌組織來說，充分模擬了類似于體內(nèi)的運(yùn)動微環(huán)境，對體外培養(yǎng)細(xì)胞生物功能的維持是有利的。

2.2管狀平滑肌的構(gòu)建

血管、食道、腸腔等器官宏觀上都為管狀結(jié)構(gòu)，因此，在體外構(gòu)建時除了具有微觀構(gòu)造外，也需要有相應(yīng)的管狀外形。對于工程化平滑肌組織的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有些科學(xué)家采用由片狀平滑肌縫合為管狀的方法。Saxena等將綿羊食道上皮細(xì)胞種植在預(yù)先種植了成纖維細(xì)胞的牛膠原支架上，兩周后將其縫合成管狀后植入到綿羊食道粘膜內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有新的血管形成[36]。但更多的研究是采用一定尺寸的管子為細(xì)胞培養(yǎng)的支架，以此構(gòu)建管狀的組織工程平滑肌。Zhang 等以絲素蛋白為基材，采用靜電紡絲技術(shù)首先制備中空的管子，然后將人的動脈平滑肌細(xì)胞種植于管子的內(nèi)腔進(jìn)行模擬血液流動的動態(tài)培養(yǎng)，兩周后行免疫組化檢測，鑒定為動脈平滑肌細(xì)胞[37]。直接在管子內(nèi)腔培養(yǎng)細(xì)胞往往存在細(xì)胞種植不均、培養(yǎng)微環(huán)境和力學(xué)刺激不平衡等問題。1999年，Niklason等應(yīng)用懸液滴加法，在管狀支架上種植牛主動脈平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)一段時間后，對細(xì)胞-支架復(fù)合物進(jìn)行免疫組化檢測，出現(xiàn)鈣調(diào)蛋白及肌球蛋白表達(dá)[38]，但要在管狀支架上使細(xì)胞均勻地種植和分布于整個支架，用這種細(xì)胞懸液靜態(tài)滴加法是難以實(shí)現(xiàn)的。Soletti設(shè)計了一種專門用于培養(yǎng)管狀支架上細(xì)胞的真空設(shè)備，利用真空環(huán)境中離心力和液流效應(yīng)，給種植在管狀支架上的細(xì)胞以縱向和環(huán)向方向的力學(xué)刺激，從而促進(jìn)細(xì)胞向縱向和環(huán)向方向生長[39]。Nieponice應(yīng)用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動的真空裝置，在用聚氨酯制成的管狀多孔支架上種植肌源性干細(xì)胞，細(xì)胞能夠均勻地在管狀支架上生長，培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞依舊維持高生存率和增殖率，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞在管狀支架上的均勻培養(yǎng)[40]。Villalona等對支架上種植細(xì)胞的方法進(jìn)行了總結(jié)，分析比較了靜態(tài)培養(yǎng)、動態(tài)培養(yǎng)、靜電培養(yǎng)、磁力培養(yǎng)等方法在環(huán)狀支架細(xì)胞種植中的運(yùn)用。靜態(tài)培養(yǎng)時，常在管狀支架上包被一種或者幾種的生物膠(如纖連蛋白、纖維蛋白等)，起到滯留細(xì)胞或者促進(jìn)細(xì)胞的粘附作用，便于提高細(xì)胞懸液直接滴于管狀支架上的種植率。動態(tài)培養(yǎng)包括轉(zhuǎn)動培養(yǎng)和真空培養(yǎng)兩種，轉(zhuǎn)向培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速從0.2～500 r/min不等，時間從12～72 h不等，高速率轉(zhuǎn)動培養(yǎng)通常能夠提高種植率，而且對細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響；真空培養(yǎng)法是通過內(nèi)部和外部的壓力差使細(xì)胞駐留于管狀支架的孔隙內(nèi)，種植率可達(dá)60%～90%。真空裝置通常一次性應(yīng)用，可減少污染的機(jī)率，對細(xì)胞形態(tài)影響較少。靜電培養(yǎng)系統(tǒng)是通過提供支架短暫的表面電荷，提高細(xì)胞的粘附率，最高可達(dá)90%。磁力培養(yǎng)法通過磁力對納米顆粒的吸附作用提高細(xì)胞種植和粘附，磁石可以隨意快速的移動改變位置，且能夠反復(fù)使用，在臨床上應(yīng)用非常有利[41]。創(chuàng)建更為安全簡便、可靠實(shí)用的細(xì)胞種植方法，仍需要更多的試驗(yàn)和探索。

在體外構(gòu)建的基礎(chǔ)上，人們將支架植入動物體內(nèi)進(jìn)行在體研究，以檢測支架的組織相容性以及生物功能。Roh等在以己內(nèi)酯和乙醇酸共聚物制成的管狀支架上種植了骨髓來源平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)建了含有平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的組織工程脈管，植入綿羊體內(nèi)。4周后，植入物上均出現(xiàn)了內(nèi)皮化，且無血栓形成[42]。Shinoka等用丙交酯和己內(nèi)酯共聚物制成的管狀支架和患者自體的骨髓細(xì)胞有機(jī)復(fù)合，并對23個患者進(jìn)行了心血管吻合試驗(yàn)，32個月的隨訪發(fā)現(xiàn)，這種復(fù)合物發(fā)揮了正常的脈管功能，為血管平滑肌組織工程構(gòu)建提供了借鑒[43]。Zakhem等將殼聚糖溶解在0.2 M的乙酸溶液中，配制成2%(W/V)的殼聚糖溶液，然后以殼聚糖溶液和Ⅰ型膠原(1:1體積比)為基材制備了管狀支架，并將結(jié)腸平滑肌細(xì)胞種植于包被了纖維蛋白的水凝膠中，將此水凝膠覆于管狀支架上(如圖2所示)，2周后，此支架在活性膽堿和氯化鉀的作用下有收縮反應(yīng)，在腸血管活性多肽作用下能起松弛反應(yīng)。他們認(rèn)為殼聚糖和膠原是很好的構(gòu)建腸道平滑肌組織的生物材料，易塑形為管狀的結(jié)構(gòu)，易降解且對細(xì)胞無毒[44]。

圖2 不同長度(3～12 cm) 和不同直徑及壁厚的復(fù)合殼聚糖管狀支架[44]。(a)不同長度(3～12 cm) 的復(fù)合殼聚糖管狀支架；(b)不同直徑及壁厚的復(fù)合殼聚糖管狀支架Fig.2 Composite chitosan tubular scaffolds with different lengths and different lumen diameters and wall thicknesses[44]. (a)Composite chitosan tubular scaffolds with different lengths ranging from 3 cm up to 12 cm; (b)Composite chitosan tubular scaffolds with different lumen diameters and wall thicknesses

圖3 用于制備管狀支架的兩個設(shè)備。(a)一種組織工程用管狀支架的制備裝置[47]；(b)改進(jìn)后的管狀支架制備裝置(1-底座；2-主體；3-蓋板；4-硅橡膠板；5-內(nèi)柱；6-環(huán)形間隙；7-定位圈；8-長螺桿；9-第一密封條；10-定位銷；11-圓形定位塊；12-蝶形螺母；13-防塵塞)[48] Fig.3 Two devices for fabrication of tissue engineered tubular scaffold. (a)The simpler device for fabrication of tissue engineered tubular scaffold[47]; (b)The updated version on which a predetermined pattern can be produced on scaffold lumen and outer face (1-pedestal; 2-main body; 3-coverplate; 4-silicon rubber sheet; 5-inner column; 6-annular gap; 7-locating ring; 8-long bolt; 9- No.1 sealing strip; 10-locating pin; 11-circular located block; 12-butterfly nut; 13-dust proof)[48]

筆者所在課題組專注于食道組織工程的研究，平滑肌構(gòu)建是其中很重要的一部分內(nèi)容。通過對食道的組織學(xué)結(jié)構(gòu)解剖、分析，了解了食管組織具有粘膜、粘膜下層、肌層及外膜等結(jié)構(gòu)，其中上皮層由生長在基膜上的復(fù)層未角化磷狀上皮細(xì)胞組成，支持上皮生長的基膜具有納米級纖維和多孔的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其化學(xué)組成以IV型膠原、層粘連蛋白、巢蛋白及蛋白聚糖為主要成分[45]。在此基礎(chǔ)上，分別運(yùn)用熱致相分離和電紡絲技術(shù)獲得不對稱多孔支架，并在其上包被基膜蛋白(從豬食道粘膜中提取)，構(gòu)建了仿生上皮層組織[46]。對于在食道中非常重要的平滑肌組織(具有內(nèi)環(huán)紋外縱紋的雙層結(jié)構(gòu))，自行設(shè)計了內(nèi)外表面圖案化的管狀支架的制備模具(見圖3)。以低毒的鐵系化合物為催化劑，在聚合反應(yīng)的同時定型，制備了內(nèi)外表面具有互相垂直的微槽結(jié)構(gòu)的生物可降解管狀支架，以引導(dǎo)平滑肌細(xì)胞取向生長，形成內(nèi)環(huán)外縱的復(fù)層肌組織。為了使管狀支架上的細(xì)胞種植、培養(yǎng)得以均勻化，設(shè)計了適合管狀支架培養(yǎng)的生物反應(yīng)器[47-48]，以克服靜態(tài)培養(yǎng)造成的細(xì)胞種植不均勻、無力學(xué)刺激等缺點(diǎn)。目前正在研究將分別構(gòu)建的上皮層和平滑肌層二種支架復(fù)合，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，在體外研究基礎(chǔ)上，將其植入動物體內(nèi)進(jìn)行原位誘導(dǎo)分化及蠕動功能的培育，以最終構(gòu)建具有天然食管結(jié)構(gòu)的組織工程食道，實(shí)現(xiàn)能用于病變或缺損食道組織的功能化修復(fù)。

3 結(jié)論與展望

組織工程平滑肌的研究目前還未完全成功，仍具有很大的進(jìn)步空間。其中作為支架基材的生物材料的性能、降解速度與組織再生的匹配等問題還需進(jìn)一步明確。干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的應(yīng)用雖然具有很好的發(fā)展前景，但諸如干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化、在動物體內(nèi)的生長和分化機(jī)制等仍未十分清楚。另外，在構(gòu)建完整的消化道、血管等含有平滑肌成分的組織或器官時還需考慮神經(jīng)支配的問題，使其能接近或完全實(shí)現(xiàn)正常的收縮和蠕動。但伴隨著對種子細(xì)胞和生物材料研究的深入和發(fā)展，相信組織工程平滑肌的構(gòu)建也將逐步成熟和完善。而且，平滑肌組織是血管、腸、膀胱、食道等體內(nèi)多種器官的重要組成部分，對其的成功構(gòu)建也將為上述這些組織/器官的重建和再生提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

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ProgressoftheConstitutionofTissueEngineeredSmoothMuscle

GONG Chang-Feng HOU Lei YU Xue-Chan LV Jing-Jing ZHU Ya-Bin*

(TheMedicalSchool,NingboUniversity,Ningbo315211,China)

Smooth muscle tissue is an important component in many organs of human as well as animals, such as alimentary canal, respiratory organs, blood vessel and genitals. It contracts and relaxes under stimuli to assist the functions of these organs. Although some progresses in materials and scaffold fabrications have been achieved in the tissue engineered smooth muscle, many challenges exist in the field. There is still a long distance from experimental attempts to clinical applications. This article reviewed the progress and prospect of materials, scaffold fabrication techniques, cell cultivation, interactions between cells and scaffolds,invivoevaluation and clinical attempts. The differentiation of stem cells to muscle cells was also discussed, as it presents the promising prospect in smooth muscle tissue engineering.

smooth muscle cell; stem cell; smooth muscle tissue engineering; reconstitution

10.3969/j.issn.0258-8021. 2014. 01.015

2013-01-11，錄用日期：2013-06-17

國家自然科學(xué)基金(81171476)；浙江省杰出青年科學(xué)基金(R2101166)；寧波市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金(2011B82014)

R318.08

A

0258-8021(2014) 01-0098-09

*通信作者。E-mail: zhuyabin@nbu.edu.cn