超聲波法提取丹酚酸B的工藝研究

王鳳儒，李鳳霞，金娟

(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

丹參為唇形科植物丹參(Radix Salviae Miltiorrhizae Bag)的干燥根和根莖。別名赤參，又叫紫丹參，紅根。是雙子葉植物唇形科的干燥根及根莖。我國主要分布于山西省、安徽省、河南省、甘肅省、四川省等地?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》等歷代本草均有收載。丹參歸心、肝經(jīng)，藥性微寒，味苦、無毒，具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效［1］。丹參在臨床上廣泛用于治療心血管系統(tǒng)疾病，具有擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量、改善微循環(huán)、降低心肌耗氧量、防治心肌缺血和心肌梗塞等作用。臨床研究表明，丹參化學提取物具有促進組織的修復與再生能力，包括清除壞死心肌細胞，促使肉芽形成，改善肝臟微循環(huán)，抗菌消炎等功效［2］。丹參的主要化學成分包括以丹參酚酸B為代表的水溶性酚酸類化合物和以丹參酮A為代表的醇溶性菲醌類化合物。其中脂溶性成分包括丹參酮、異丹參酮、丹參酸甲酯等。傳統(tǒng)的丹參酮A的提取方法為水提醇沉，熱堿提取法等，這也是目前制備丹參注射提取方法常用方法［3－6］。本文主要探討超聲波提取法對丹酚酸的最佳工藝，以擴大超聲波提取丹參酚酸B的應(yīng)用。

1 材料與儀器

RE522OA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海振捷實驗設(shè)備有限公司);KQ2200E型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);高效液相色譜儀(Agilent 1200);丹酚酸B標準品(中國食品藥品檢定研究院，2013007);甲醇、乙腈、甲酸等試劑均為國產(chǎn)色譜純。

2 方法

2.1 超聲波法提取工藝

稱取適量預處理的丹參粉末，單因素試驗和正交試驗超聲波提取，浸提液4000r/min離心10min，上清液即為丹酚酸B的粗提液。在粗提液中加入無水乙醇至乙醇濃度80%，靜置沉淀過夜。抽濾，沉淀經(jīng)自然干燥后稱重，以定提取物得率與丹酚酸B含量為指標，確定最佳提取工藝。

2.2 丹酚酸B含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Extend－C18(250mm ×4.6mm，5μm);流動相:甲醇:乙腈:甲酸:水(30:10:1:59);流速:1.5mL/min;波長:λ =286nm;進樣體積:20μL;保留時間:20min;理論塔板數(shù)按丹參酚酸B峰計算不低于2000。

2.2.2 制備標準曲線

精密稱定丹酚酸B對照品25mg，水解并定容至50mL。稀釋丹酚酸 B濃度為 0.03125mg/mL、0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL標準液，分別按照2.2.1條件進樣。以丹酚酸B濃度X為橫坐標，峰面積 Y為縱坐標，Y=416.73X－16.312，R2=0.9999，得標準回歸曲線。

2.2.3 待測溶液的制備

稱取提取浸膏5g，置50mL量筒中，使充分溶解，濾過，精密量取續(xù)濾液1mL，至10mL容量瓶中定容。

2.2.4 樣品中丹酚酸B測定

吸取待測溶液20μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

3 結(jié)果與結(jié)論

3.1 單因素試驗

3.1.1 料液比

保持提取溫度40℃，提取時間30min，超聲波頻率40kHz，料液比分別為 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35提取，結(jié)果見圖1。隨著提取溶劑(水)的增加，丹酚酸B提取率逐漸升高，料液比為1∶25以后，隨著料液比的增大得率增加趨勢趨于緩和。因此，選擇料液比1∶15，1∶20，1∶25 三個水平進行正交試驗。

3.1.2 提取溫度

保持料液比1∶20、提取時間30min、超聲波頻率40kHz，提取溫度分別為 30、40、50、60、70℃提取，結(jié)果見圖2。50℃ ～60℃之間多糖的提取率明顯增加，60℃時達到最高值，超過60℃時，提取率下降。因此，選擇提取溫度40℃，50℃，60℃三個水平進行正交試驗。

3.1.3 提取時間

保持料液比1∶20、提取溫度50℃、超聲波頻率40kHz，分別在 20，25、30、35、40min 條件下提取，結(jié)果見圖3。提取時間為30min時，得率最高，此后下降。推測隨受熱時間延長，部分丹酚酸B降解。綜合考慮丹酚酸B的得率和節(jié)約能源，提取時間較為適宜的3個水平為25、30、35min，以此三個水平進行正交試驗。

圖2 提取溫度對丹酚酸B得率的影響

圖3 提取時間對丹酚酸B得率的影響

3.1.4 超聲波頻率

保持料液比 1∶20，提取溫度 50℃，提取時間30min，超聲波頻率分別為 20，30，40，50，60kHz 時提取，結(jié)果見圖4。超聲波頻率在40kHz之前丹酚酸B得率明顯上升，此后略有下降。因此，選擇超聲波頻率為30，40，50kHz三個水平進行正交試驗。

圖4 超聲波頻率對丹酚酸B得率的影響

3.2 正交試驗

采用L9(34)正交設(shè)計，試驗結(jié)果見表1。

影響丹酚酸B得率的主次為溫度＞時間＞超聲頻率＞料液比。確定最佳提取工藝為提取溫度40℃、提取時間25min、提取超聲頻率30kHz、料液比1∶25為理論最佳工藝。

按照理論最佳提取工藝，丹酚酸B提取得率為13.31%。

4 討論

從丹參中提取丹酚酸B的過程主要有破碎、提取、沉淀、干燥等，是影響回收率和產(chǎn)品質(zhì)量的主要環(huán)節(jié)。參考相關(guān)丹酚酸B提取的文獻，主要提取方法有中性熱水提取，水煎法，回流提取，超臨界CO2，浸漬法。傳統(tǒng)的丹參提取法提取丹參酸B得率低，對有效成分的破壞大，影響產(chǎn)品最終收率，并且產(chǎn)生大量雜質(zhì)，影響到用藥安全。超聲波作為一種新的提取手段，提取效率高、經(jīng)濟方便、破碎效果好本試驗確定提取丹酚酸B的最佳工藝組合為料液比1∶25、提取溫度40℃、提取時間25min、超聲波頻率30kHz，丹酚酸B得率達13.31%，這種工藝提取出的浸膏量大并且含量較高。

［1］唐召力，覃碧云，滕秋葉，等.丹參多酚酸鹽與丹參注射液對不穩(wěn)定型心絞痛氧化修飾低密度脂蛋白、血友病因子和超敏C反應(yīng)蛋白的作用比較［J］.臨床薈萃，2012，27(17):1495 －1497.

［2］杜中良，程振田.正交試驗法優(yōu)選丹參中丹酚酸B的提取工藝［J］.中國藥房，2010，31(3):35 －44.

［3］高秀梅，邢永發(fā)，姬艷蘇.丹參酚酸B、丹參酮治療心血管疾病的藥理學研究進展［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2012，44(7):82 －85.

［4］李學林，姚保杰，李春曉.丹參及其制劑對血小板功能影響的研究進展［J］.中國藥房，2013，24(7):670 －672.

［5］楊立波，陳延軍，郝東偉.注射用丹參多酚酸鹽聯(lián)合通心絡(luò)膠囊治療不穩(wěn)定型心絞痛的臨床觀察［J］.中國醫(yī)藥科學，2012，6(11):59－62.

［6］王鳳儒，李鳳霞，金娟.丹參多酚酸鹽對冠心病患者免疫相關(guān)指標的影響［J］.中醫(yī)藥學報，2014，42(3):181 －183.