孤獨(dú)癥譜系障礙致病基因SHANK3的研究進(jìn)展

劉春雪 姜永輝 徐 秀

·綜述·

孤獨(dú)癥譜系障礙致病基因SHANK3的研究進(jìn)展

劉春雪1姜永輝2徐 秀1

孤獨(dú)癥譜系障礙(ASD)是一類以不同程度的社會(huì)交往/交流障礙、狹隘的興趣和重復(fù)刻板行為、感知覺異常為主要特征的發(fā)育行為障礙性疾病，嚴(yán)重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量。

盡管目前ASD的病因在多數(shù)病例中仍不完全明了，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為遺傳因素、環(huán)境因素在ASD的發(fā)病中有重要作用。雙生子研究顯示，ASD同卵雙生共患率達(dá)60%～92%,異卵雙生共患率約10%，同胞再患概率3%～5%，較普通人群高25～60倍[1,2]，說明ASD與遺傳因素密切相關(guān)。近年來，采用候選基因及全基因組關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與ASD有關(guān)的突觸結(jié)構(gòu)及功能相關(guān)的致病候選基因，如SHANK3、NLGN3、NLGN4x、CNTNAP2、NRXN1、NRXN2、PCD9等。

另外，DNA拷貝數(shù)變異(CNV)可改變基因劑量，導(dǎo)致不同程度的基因表達(dá)差異，對(duì)表型改變及疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定作用[3,4]。研究發(fā)現(xiàn)，ASD患者較正常人更常攜帶CNV[5]。已報(bào)道SHANK3、FOXP2、NRXN1等基因的CNV及16p11.2、15q11-q13與ASD顯著相關(guān)[6～9]。本文將重點(diǎn)介紹SHANK3(SH3 and Multiple Ankyrin Repeat Domains 3)分子缺陷與ASD發(fā)生的關(guān)系。

1 SHANK3基因

2007年，研究人員對(duì)來自3個(gè)家庭的5名ASD兒童進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了與ASD有關(guān)的新基因——SHANK3[10]。到目前為止，已經(jīng)在超過1 000例ASD患者中識(shí)別出SHANK3基因的6類分子缺陷[11]：①細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)可見的22q13.3缺失(5～10 Mb)或環(huán)狀22號(hào)染色體[12,13]，②微缺失(0.1～4 Mb)[14,15]，③微小擴(kuò)增[16]，④基因內(nèi)斷點(diǎn)易位[17]，⑤微小基因內(nèi)缺失(<100 kb)[18]，⑥點(diǎn)突變[10,14]等。近來發(fā)現(xiàn)SHANK3基因CpG豐富的序列(又稱“CpG”島，CGI)的高度甲基化能夠改變其蛋白的組織特異性表達(dá)[19,20]。

人類基因組共有3個(gè)SHANK基因(SHANK1，SHANK2，SHANK3)，分別表達(dá)在大腦的不同區(qū)域。其中，SHANK3是SHANK家族中與ASD關(guān)系最密切的基因[20]。SHANK3基因位于22號(hào)染色體的13.3長(zhǎng)臂(22q13.3)，全長(zhǎng)約58 kb，包含22個(gè)外顯子(NM_033517),且富含GC序列(GC含量高達(dá)69%)。SHANK3基因編碼由1 747個(gè)氨基酸組成的SHANK3蛋白，該蛋白主要表達(dá)在興奮性神經(jīng)元的突觸后致密區(qū)(PSD)。SHANK3蛋白在人類紋狀體中呈高表達(dá)，尤其在神經(jīng)元的突觸中。在小鼠中，SHANK3蛋白在丘腦、紋狀體和小腦顆粒細(xì)胞中呈高表達(dá)[21]，在心臟、脾臟、小腸和腎臟等也均有表達(dá)，即SHANK3基因幾乎存在于各個(gè)系統(tǒng)中，這可以解釋ASD患者全身系統(tǒng)的功能改變。

PSD是突觸后膜細(xì)胞骨架纖維特化的區(qū)域，后膜的細(xì)胞骨架和定位與突觸前膜末端的活性區(qū)域相對(duì)應(yīng)。這種結(jié)構(gòu)的功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附性、控制受體聚集和調(diào)節(jié)受體功能[22]。通過PSD，細(xì)胞表面受體可以與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架連接。在突觸中，突觸前膜的神經(jīng)元表面蛋白(neurexin)結(jié)合到突觸后膜的神經(jīng)配體蛋白(neuroligin)上，神經(jīng)配體蛋白再綁定到SHANK3蛋白上[23]，并在谷氨酸能神經(jīng)元突觸上形成復(fù)合物。這種蛋白復(fù)合物在維持突觸正常功能和樹突棘正常形態(tài)，以及調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮-抑制平衡中均發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。

SHANK3有多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域[11]：ANK、SH3、PDZ(PSD-95/Discs large/ZO-1)、富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域(proline rich region containing homer and cortactin-binding sites)和SAM(圖1)。作為突觸后致密復(fù)合體的主要支架蛋白，SHANK3蛋白與多種突觸分子相互作用[11]，可通過ANK結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞骨架結(jié)合，通過PSD-95/GKAP與膜上的NMDA受體或細(xì)胞黏附分子等結(jié)合，通過homer-binding結(jié)構(gòu)域與mGlu受體結(jié)合等[20]。

研究顯示，SHANK3基因在人工培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中過表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)樹突棘的擴(kuò)大和成熟，而敲除海馬神經(jīng)元的SHANK3基因時(shí)，樹突棘的密度則減少[24]。這說明SHANK3能促進(jìn)樹突棘的成熟和擴(kuò)大，甚至能夠誘導(dǎo)無棘神經(jīng)元的樹突棘形成[25]。同樣，SHANK3基因敲除小鼠表現(xiàn)出自殘行為、重復(fù)理毛、社會(huì)交往和溝通障礙[26～28],其海馬細(xì)胞神經(jīng)傳遞減少、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用異常、突觸減少、樹突分叉增多[29]、樹突棘數(shù)量明顯減少和PSD更稀薄等[30]。同時(shí)，一些支架蛋白，如鳥苷酸激酶相關(guān)蛋白(GKAP)和谷氨酸受體亞基的水平也降低，這與神經(jīng)信號(hào)強(qiáng)度降低的結(jié)果一致[29,31]。這些研究結(jié)果提示，SHANK3基因在樹突棘的形成、成熟和穩(wěn)定中都起關(guān)鍵作用[32,33]。另外，盡管SHANK3基因敲除小鼠整個(gè)大腦體積無明顯增加，但紋狀體體積有少量增加，而在ASD患者中發(fā)現(xiàn)尾狀核體積有明顯增加。這些神經(jīng)生物學(xué)的改變可能與ASD樣行為有關(guān)，包括焦慮、刻板行為、自殘行為和拒絕社會(huì)交往等[26,29]。

圖1 人類SHANK3基因外顯子結(jié)構(gòu)、選擇性剪接的外顯子、蛋白結(jié)構(gòu)域、啟動(dòng)子和5個(gè)CpG島(CGI)[19]

注 11a是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的外顯子；藍(lán)色箭頭表示目前在ASD患者中發(fā)現(xiàn)的可能致病的點(diǎn)突變位點(diǎn)

2 22q13.3缺失綜合征

SHANK3基因最初被認(rèn)為與22q13.3缺失綜合征有關(guān)[34]。22q13.3缺失綜合征，又稱Phelan-McDermid綜合征(PMS，MIM #606232)，是由22號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端的微缺失所致[21]。首例PMS由Watt在1985年報(bào)道，1例4歲男孩患有嚴(yán)重智力障礙、無語言交流和面部畸形。研究發(fā)現(xiàn)，其缺失來源于母親的22號(hào)染色體的臂間倒位，造成減數(shù)分裂重組，從而導(dǎo)致22q12至22q末端(22qter)的缺失。PMS的主要特征為全面發(fā)育遲緩、肌張力減退、中至重度智力障礙、語言缺失或嚴(yán)重的語言發(fā)育遲緩和顱面部異常[11,23]等，近來又發(fā)現(xiàn)PMS患者有非典型雙向情感障礙[35,36]。在超過1 000例PMS患者中有75%以上被診斷為ASD[11],具有典型的ASD臨床表現(xiàn)，如社會(huì)交往/社會(huì)溝通障礙、眼神交流減少、焦慮和自傷行為，因此PMS被列為ASD的一種綜合征形式[23]。大部分22q13.3的末端缺失是由于簡(jiǎn)單的缺失、非平衡易位、環(huán)狀染色體所致，缺失長(zhǎng)度為100 kb至>9 Mb[23]。

Bonaglia等[34]發(fā)現(xiàn)1例男童具PMS全部特征，其神經(jīng)系統(tǒng)損害尤為突出，表現(xiàn)為輕度智力低下、重度語言發(fā)育遲緩、輕度肌張力減退和典型的面部異常。遺傳分析發(fā)現(xiàn)染色體存在平衡易位：46,XY,t(12;22)(q24.1;q13.3)。通過測(cè)序，在22號(hào)染色體位置296489-296494處發(fā)現(xiàn)斷裂點(diǎn)。該研究首次證明了SHANK3是PMS患者神經(jīng)損害(語言發(fā)育遲緩和智力障礙)的主效基因。另一方面，對(duì)微小末端缺失的研究進(jìn)一步支持了SHANK3基因在PMS中的重要作用。Misceo等[37]在1例女性患者中也發(fā)現(xiàn)了SHANK3基因末端缺失，包括SHANK3基因最后2個(gè)外顯子以及ACR基因，SHANK3最后2個(gè)外顯子包含SAM結(jié)構(gòu)域，提示SAM結(jié)構(gòu)域丟失會(huì)引起PMS臨床表型。核型分析發(fā)現(xiàn)：46,X,t(X;22)(q21.3;q13.33)，測(cè)序發(fā)現(xiàn)缺失長(zhǎng)度為17 581 bp。同時(shí)，該患者X染色體上存在283 764 bp的擴(kuò)增。該患者4歲時(shí)即表現(xiàn)出嚴(yán)重的語言發(fā)育遲緩和社交障礙，并表現(xiàn)出刻板行為。6歲時(shí)診斷為中度智力發(fā)育遲緩，20歲時(shí)出現(xiàn)高促性腺激素性腺功能低下癥。

2003年，Luciani等[38]在33例PMS患者中發(fā)現(xiàn)，17例存在環(huán)狀22號(hào)染色體，片段缺失從160 kb至9 Mb，且關(guān)鍵區(qū)域包含SHANK3、ACR和RABL2基因。其中74%的缺失來源于父親的22號(hào)染色體。同年，Wilson等[13]報(bào)道了 56例PMS患者，其22q13.3區(qū)域缺失長(zhǎng)度為130 kb至>9 Mb。同樣，大部分PMS病例(45/56)缺失的關(guān)鍵區(qū)域也包含SHANK3基因，且父親的22號(hào)染色體缺失占其研究病例的70%。這種高比例的父源缺失也在其他末端缺失綜合征中發(fā)現(xiàn)[39,40]。這些現(xiàn)象表明，與女性生殖細(xì)胞相比，男性生殖細(xì)胞對(duì)染色體斷裂可能具有更大的易感性。

22q13.3缺失綜合征可能缺失的基因超過90種[23]，其中神經(jīng)系統(tǒng)障礙與SHANK3基因關(guān)系最為密切，主要是由SHANK3單倍劑量不足引起[23]。22q13.3區(qū)域的缺失造成此類PMS患者的每個(gè)細(xì)胞的SHANK3基因只有1個(gè)拷貝數(shù)，而不是正常的2個(gè)拷貝數(shù)。小鼠模型提示SHANK3單倍劑量不足造成了SHANK3蛋白的表達(dá)減少50%[41]，引起突觸功能和神經(jīng)元之間信息傳導(dǎo)功能的下降，從而導(dǎo)致PMS的臨床特征。

Shcheglovitov等[42]從PMS患者的皮膚成纖維細(xì)胞中提取誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(iPS cells)，并進(jìn)一步用來產(chǎn)生功能性神經(jīng)元。研究顯示，PMS神經(jīng)元的SHANK3基因表達(dá)減少，并造成興奮性突觸傳遞出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷，而對(duì)于抑制性突觸傳遞則無明顯影響。而這些PMS神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞可以通過SHANK3基因的再表達(dá)或者使用胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)獲得糾正。

3 SHANK3基因擴(kuò)增

研究表明，22號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端(22qter)無論是缺失還是擴(kuò)增均與ASD有關(guān)，表現(xiàn)為神經(jīng)功能障礙，SHANK3基因就位于此區(qū)域。22q近端段的擴(kuò)增比較常見，而22q末端擴(kuò)增則較為罕見。Barajas-Barajas等[43]總結(jié)了22q末端擴(kuò)增患者的臨床特征，包括嚴(yán)重智力障礙、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、生長(zhǎng)缺陷、先天性肌張力低下、腦水腫、小頭畸形、內(nèi)眥贅皮、耳位低、鼻梁突出、腭裂、人中長(zhǎng)、小頜畸形和隱睪癥等。

表1中總結(jié)了文獻(xiàn)中報(bào)道的21例22q12或22q13-22qter的單純擴(kuò)增(不伴有其他染色體的缺失)，其中13例由家族性平衡易位(9例是母方，4例是父方)引起。這些患者的平均壽命均較低。9/21例在12歲前夭折。這21例分為4組:22q13-22qter的擴(kuò)增(8例)、22q13.1-22qter的擴(kuò)增(2例)、22q13.2-22qter的擴(kuò)增(3例)、22q13.3-22qter的擴(kuò)增(8例)。其中22q13.1-22qter擴(kuò)增病例存在多器官發(fā)育缺陷，臨床癥狀突出，生存率也低于另外3組。而22q13.2-22qter和22q13.3-22qter的生存率較高，但其臨床癥狀差異較大[44]。

Feenstra等[44]報(bào)道了首例成人男性22q13擴(kuò)增患者，21號(hào)和22號(hào)染色體存在易位：46,XY,der(21)t(21;22)(p12;q13.3)，其臨床表型輕微，只有輕度的學(xué)習(xí)障礙和輕微的面部異常，其兒子也存在相同的易位,表現(xiàn)為面部畸形(眼睛深陷、面中部平坦、上唇突出)，精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，驚厥發(fā)作，社會(huì)交往障礙 。 而該患者父母的基因型和表型都正常。

表1 4種22q末端單純擴(kuò)增及其臨床表現(xiàn)

注 1)PMID為PubMed indexed唯一標(biāo)識(shí)碼。+：陽(yáng)性，-：陰性；NR ：未報(bào)道

Jafri等[45]首次報(bào)道了一個(gè)家庭中兩兄弟同時(shí)存在22q13.3擴(kuò)增和22q13.3缺失，其母親22號(hào)染色體上存在倒位：46, XX, inv(22)(p13; q13.32)。該母親的表型正常，曾流產(chǎn)過2次，現(xiàn)存活3個(gè)兒子。次子6歲，嬰兒時(shí)期有輕度發(fā)育遲緩、社交能力和適應(yīng)能力障礙，曾被診斷為未分類的廣泛性發(fā)育障礙(PDD-NOS)，基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其22號(hào)染色體上有22q13.3-22qter的擴(kuò)增。三子4歲，嬰兒時(shí)期有嚴(yán)重的全面發(fā)育落后，尤其是語言和運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，并伴有面部畸形特征：瞼裂、肉質(zhì)手、寬鼻梁、面中部平坦、下頜和耳朵突出，先天性趾側(cè)彎，痛閾高，搖晃步態(tài)(肌張力低下)，出現(xiàn)ASD樣行為(具有攻擊性，如打咬照料者和寵物)，呈典型的PMS特征，曾被診斷為廣泛性發(fā)育障礙和注意力缺陷多動(dòng)障礙(ADHD)?；驒z測(cè)發(fā)現(xiàn)其22號(hào)染色體上有22q13.3-22qter缺失。該家系提示當(dāng)親代存在倒位或平衡易位時(shí)，可能會(huì)以非平衡易位的形式傳遞給后代，或者通過正常的等位基因和倒位的等位基因之間發(fā)生重組而出現(xiàn)缺失和擴(kuò)增。

22q末端擴(kuò)增可能導(dǎo)致位于此區(qū)域的SHANK3基因過表達(dá)，干擾突觸發(fā)育，如Okamoto等[16]報(bào)道的1例22q13微擴(kuò)增的6歲女童，2歲4月才會(huì)獨(dú)走，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，6歲只能理解一些簡(jiǎn)單的句子，說幾個(gè)單詞，MRI顯示額葉白質(zhì)區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度異常(T1低信號(hào)，T2高信號(hào))。SHANK3單倍劑量不足已證實(shí)與ASD有關(guān)[10],但SHANK3擴(kuò)增與ASD的關(guān)系還不明確。Durand等[10]發(fā)現(xiàn)1例22q末端出現(xiàn)擴(kuò)增的男童，診斷為Asperger綜合征，語言發(fā)育較早，語言流利，但社會(huì)溝通和人際交往表現(xiàn)出嚴(yán)重的障礙。類似的發(fā)現(xiàn)也在其他報(bào)道中出現(xiàn)[46]。但并不是所有的SHANK3基因過表達(dá)都引起ASD[16,47],而且在一項(xiàng)針對(duì)427例ASD患者進(jìn)行的全基因組CNV分析結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)22qter擴(kuò)增[48]。因此仍需要進(jìn)一步探究SHANK3基因擴(kuò)增與神經(jīng)系統(tǒng)異常有何種重要的聯(lián)系以及其與ASD的關(guān)系。另外，22q13.3-22qter擴(kuò)增的病例數(shù)可能比現(xiàn)有報(bào)道的更多，只是由于其片段太小以及臨床癥狀相對(duì)較輕，目前的診斷技術(shù)尚未能全部診斷出來[48]。

4 SHANK3基因突變

目前，在約1%的ASD患者中檢測(cè)到SHANK3基因突變[14]。在ASD患者中發(fā)現(xiàn)SHANK3基因的序列改變，包括錯(cuò)義突變、移碼突變和剪接位點(diǎn)的突變[10, 14, 49～52]。圖1中的藍(lán)色倒三角顯示人類中已發(fā)現(xiàn)的SHANK3點(diǎn)突變位置。表2總結(jié)了近5年來國(guó)內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的與ASD有關(guān)的SHANK3基因突變類型，以及突變體基因型/表型的關(guān)系。在ASD患者和嚴(yán)重的語言發(fā)育障礙患者中發(fā)現(xiàn)了新的點(diǎn)突變，其影響內(nèi)含子5的剪接受體位點(diǎn)[31]和內(nèi)含子9的剪接供體位點(diǎn)[50],而外顯子21的一個(gè)堿基對(duì)插入突變則引起框移(p.A1227fs)[10]。p.A1227fs突變的患者表現(xiàn)為非典型性ASD和語言發(fā)育遲緩，此突變是從其父親遺傳，其父也有學(xué)習(xí)障礙和ADHD[14]。而剪接突變c.1820-4G>A與Asperger綜合征患者有關(guān)[14]。以上數(shù)據(jù)表明，SHANK3分子缺陷能夠引起ASD,但其臨床表現(xiàn)差異較大。

大片段缺失一般與明顯的結(jié)構(gòu)畸形和社會(huì)交流障礙有關(guān)，而小片段缺失或點(diǎn)突變往往表現(xiàn)為與SHANK3單倍劑量不足有關(guān)，包括ASD、驚厥、異常EEG、肌張力減退、睡眠障礙、異常腦MRI和胃食管反流[53]。雖然在ASD患者中發(fā)現(xiàn)SHANK3基因缺失提示單倍劑量不足是ASD發(fā)病的主要原因[13]，但對(duì)于SHANK3基因點(diǎn)突變(如錯(cuò)義突變和小的基因內(nèi)缺失)的發(fā)病機(jī)制并不是很清楚[18,54]。另外，在ASD患者中，SHANK3基因致病性突變的頻率不足0.75%[55]，因而對(duì)ASD的貢獻(xiàn)較小。不同的SHANK3基因突變可能會(huì)通過不同的機(jī)制來調(diào)節(jié)PSD中蛋白-蛋白相互作用，引起突觸功能改變，從而造成各種不同的臨床表型[11]。但是，結(jié)合本文中總結(jié)的基因型-表型的聯(lián)系可以給臨床診斷提供思路。

5 SHANK3基因的甲基化

SHANK3基因除了發(fā)生缺失、擴(kuò)增和點(diǎn)突變外，其CGI的異常甲基化也與ASD的發(fā)病相關(guān)。組織特異性的DNA甲基化被認(rèn)為是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要方式，它不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，卻能改變基因的表達(dá)。DNA甲基化常發(fā)生在基因5′端的CGI。甲基化程度與基因表達(dá)通常呈反比關(guān)系，即CGI高度甲基化往往引起基因的低表達(dá)。

SHANK3基因是一個(gè)高GC含量的基因，有多個(gè)選擇性剪接外顯子(圖1中紅色標(biāo)記)，這些選擇性剪接外顯子分別編碼SH3、proline-rich和 SAM結(jié)構(gòu)域。SHANK3有5個(gè)CGI[56]，圖1顯示，1個(gè)位于5′啟動(dòng)子區(qū)和4個(gè)位于基因內(nèi)(基因內(nèi)CGIs)。這些CGI在腦內(nèi)表現(xiàn)為局部區(qū)域特異性的甲基化模式。Maunakea等[57]首次報(bào)道SHANK3基因中存在一個(gè)以上的基因啟動(dòng)子活性，Wang等[58]進(jìn)一步證實(shí)小鼠的SHANK3基因中有6個(gè)基因啟動(dòng)子，這些基因內(nèi)多個(gè)啟動(dòng)子以及選擇性剪接使SHANK3基因產(chǎn)生多個(gè)mRNA和蛋白異構(gòu)體，而每個(gè)SHANK3異構(gòu)體均能與不同的蛋白結(jié)構(gòu)域形成一種獨(dú)特的組合方式[58]。

Beri等[27]分析了小鼠和人SHANK基因的CGIs的DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)SHANK1、SHANK2和SHANK3基因均含有CGIs，但只有SHANK3基因在其大部分的CGIs中顯示組織特異性的甲基化模式，而且當(dāng)SHANK3基因在組織中呈高度甲基化時(shí)，其表達(dá)很低甚至缺如。研究顯示，經(jīng)體外甲基化處理后，海馬神經(jīng)元中SHANK3蛋白的表達(dá)顯著減少。相反，HeLa細(xì)胞在經(jīng)甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-AZA)處理后，SHANK3的CGIs出現(xiàn)去甲基化，又重新表達(dá)SHANK3蛋白，SHANK3異構(gòu)體的特異性表達(dá)也發(fā)生改變[32]。因此，減少或增加基因組DNA甲基化，均能調(diào)節(jié)SHANK3基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。提示DNA甲基化的改變和腦SHANK3基因的表達(dá)、ASD患者的神經(jīng)系統(tǒng)障礙之間存在密切的聯(lián)系。

表2 人類SHANK3基因突變類型和表型的關(guān)系

注 1)PMID為PubMed indexed唯一標(biāo)識(shí)碼

Zhu等[19]分析54例ASD患者和43例對(duì)照組腦組織SHANK3基因的5個(gè)CGIs的DNA甲基化水平，在約15%的ASD患者腦組織中發(fā)現(xiàn)CGI-2、3和 4的所有CpG位點(diǎn)的甲基化水平都比對(duì)照組高，并發(fā)現(xiàn)特定SHANK3 mRNA異構(gòu)體的表達(dá)水平的降低以及選擇性剪接的改變等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)異常復(fù)雜的模式。亞硫酸氫鹽克隆和測(cè)序研究(BSP)[27]的結(jié)果也相似，SHANK3基因的CGI-2～5在外周血淋巴細(xì)胞(PBL)中表現(xiàn)出廣泛的甲基化，但在大腦、小腦和心臟中甲基化程度很低，甚至缺如。其中，CGI-2比較特殊，其所有的CpG二核苷酸在小腦以及大部分的大腦和心臟中未發(fā)生甲基化。而CGI-1在所有的組織中幾乎都不發(fā)生甲基化，CGI-5的甲基化水平也較低。提示SHANK3基因內(nèi)CGIs具有組織特異性的基因表達(dá)和選擇性剪切作用[57,59]。

6 SHANK3突變小鼠模型

當(dāng)前，對(duì)于以ASD患兒為樣本的機(jī)制研究存在很多的局限性：①尸檢腦組織資源非常有限,并且通常不能獲得高質(zhì)量的腦組織；②神經(jīng)影像學(xué)研究提供的信息有限；③由于ASD患兒在臨床癥狀和分子缺陷上存在較大的異質(zhì)性，使研究設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)解釋存在種種困難。因此，建立與人類ASD具有相同分子缺陷和臨床表型的動(dòng)物模型是研究ASD的關(guān)鍵。小鼠模型對(duì)于研究基因功能、探索SHANK3基因在ASD神經(jīng)病理學(xué)中的作用具有重要意義。

突觸后SHANK3蛋白在正常的神經(jīng)連接發(fā)育中起關(guān)鍵性的作用，研究人員發(fā)現(xiàn)SHANK3基因敲除后的小鼠表現(xiàn)出ASD的特征，包括社會(huì)行為缺陷、刻板行為、自殘行為和焦慮等，并出現(xiàn)異常的突觸形態(tài)[30,58](如樹突棘密度減少，長(zhǎng)度增加)和異常的突觸生理功能[28,30](如AMPA受體介導(dǎo)的突觸傳遞減弱、微小興奮性突觸后電流頻率增加和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用減弱等)。這些發(fā)現(xiàn)表明，SHANK3基因在神經(jīng)連接中起關(guān)鍵作用，并為以后探索其他社會(huì)行為的神經(jīng)遺傳學(xué)改變提供了一種新的思路[28]。通過神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)[54,60]和小鼠模型[28,30,58,61]證明了SHANK3在紋狀體水平調(diào)節(jié)PSD，在AMPA谷氨酸受體上調(diào)節(jié)基底神經(jīng)傳遞，影響長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用，通過組織AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)重塑樹突棘等過程中起重要作用。

如今報(bào)道的SHANK3基因突變小鼠的突變類型主要包括編碼ANK結(jié)構(gòu)域的外顯子4～9缺失[30,58]、編碼ANK結(jié)構(gòu)域的外顯子4～7缺失[28]、編碼SH3結(jié)構(gòu)域的外顯子11缺失[41]和編碼PDZ結(jié)構(gòu)域的外顯子13～16缺失[28]。外顯子4～9缺失小鼠GluA1、GKAP、Homer1b/c和GluN2A減少，表現(xiàn)為社會(huì)新奇感減少，二元測(cè)試中雙向社會(huì)互動(dòng)降低[30,58]。外顯子4～7缺失小鼠皮質(zhì)紋狀體的突觸傳遞輕度減少，但能正常發(fā)起社會(huì)交往[28]。外顯子11缺失小鼠GluN2B和SHANK2增加，出現(xiàn)自殘行為[41]。外顯子13～16缺失小鼠SAPAP3/GKAP3、PSD-93、Homer1、GluN2A和GluN2B減少，紋狀體體積、樹突長(zhǎng)度和表面積均增加，但樹突棘密度以及長(zhǎng)度減少，二元測(cè)試中互動(dòng)減少，鼻-鼻接觸頻率降低[28]。

SHANK3基因在哺乳動(dòng)物胚胎和新生兒早期階段的腦中的表達(dá)相對(duì)較低，在出生后2周表達(dá)增強(qiáng)，成人大腦中又低于發(fā)育中的大腦[63,64]。小鼠模型提示CGI-2的甲基化率在出生后1周明顯增高，高峰是2周，然后逐漸下降[20]。小鼠大腦的突觸形成主要發(fā)生在生后2周內(nèi)，隨著突觸的成熟，SHANK3的表達(dá)增加[64]。有趣的是，CGI-2在突觸成熟的過程中甲基化模式發(fā)生變化。SHANK3基因的轉(zhuǎn)錄開始于CGI-2附近，其表達(dá)在出生后增強(qiáng)，但在第2周短暫減弱，之后又再次增強(qiáng)。

7 總結(jié)與展望

神經(jīng)元之間準(zhǔn)確無誤的信息交換是通過突觸實(shí)現(xiàn)的，突觸傳遞活動(dòng)是學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知的生物學(xué)基礎(chǔ)。SHANK3基因編碼的SHANK3蛋白是位于興奮性PSD的多結(jié)構(gòu)域支架蛋白，主要功能是將經(jīng)遞質(zhì)受體，離子通道和其他膜蛋白與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和G-蛋白偶聯(lián)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑連接起來。與神經(jīng)生長(zhǎng)素共同參與了突觸后結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，尤其是那些與語言和社會(huì)交往相關(guān)的突觸結(jié)構(gòu)通路。另外，SHANK3蛋白在突觸的形成和樹突棘的成熟中具有重要作用。

異常的SHANK3基因劑量與嚴(yán)重的認(rèn)知缺陷有關(guān)，包括語言和交流障礙以及ASD。SHANK3基因的單倍劑量不足與22q13.3缺失綜合征有重要聯(lián)系，而SHANK3基因過表達(dá)則可能表現(xiàn)出躁狂樣的行為和驚厥發(fā)作。小腦顆粒細(xì)胞中的SHANK3基因過表達(dá)通過結(jié)合谷氨酸的不同亞型受體來減少樹突棘和突觸的形成，相反，抑制海馬神經(jīng)元SHANK3基因的表達(dá)則會(huì)減少樹突棘的數(shù)量[27]。因此，任何一個(gè)方向上(表達(dá)不足或過度表達(dá))的不正確基因劑量都可能是有害的。

盡管遺傳因素在ASD發(fā)病機(jī)制中占有非常重要的作用，但基因突變和染色體微缺失或重復(fù)只占特發(fā)性ASD的10%～20%，大多數(shù)特發(fā)性ASD的病因依然不明[19,59,65,66]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，基因和環(huán)境的相互作用對(duì)ASD的發(fā)生起關(guān)鍵作用[67]。在ASD患兒中，可能并不一定存在DNA水平的變異，而是基因的調(diào)控水平發(fā)生異常，某些目前未知的環(huán)境因素起著重要作用[68]。腦內(nèi)突觸功能障礙會(huì)引發(fā)ASD[69]，進(jìn)而可以推測(cè)突觸基因(尤其是SHANK3基因)的表觀遺傳失調(diào)(如DNA甲基化)可能是ASD的分子基礎(chǔ)。CGIs已經(jīng)在人類50%的基因中發(fā)現(xiàn)，且通常位于啟動(dòng)子或外顯子區(qū)域[27]。SHANK3基因的DNA甲基化從分子的層面提示，CGIs與SHANK3的異構(gòu)體和組織特異性的表達(dá)有關(guān)，SHANK3基因在ASD的發(fā)病機(jī)制中可以作為基因與環(huán)境相互作用的一個(gè)有效的生物學(xué)標(biāo)志。

結(jié)合生理學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)和行為學(xué)的研究，小鼠模型對(duì)于研究基因功能、探索SHANK3基因在ASD發(fā)生中具有關(guān)鍵作用。另外，SHANK3為相對(duì)保守的基因，斑馬魚與人的序列同源性核苷酸為61.9%，氨基酸為65.5%。斑馬魚作為模式動(dòng)物，不僅可以通過檢測(cè)分子基因水平變化，檢測(cè)細(xì)胞組織器官發(fā)育分化及形態(tài)差異，還可通過分析其行為特征，對(duì)神經(jīng)精神系統(tǒng)的發(fā)育進(jìn)行研究。因此，可以利用動(dòng)物模型來探討SHANK3基因分子缺陷在ASD發(fā)生形態(tài)、行為變化中的分子機(jī)制，為ASD的分子靶向干預(yù)提供新的思路。

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(本文編輯：張崇凡)

10.3969/j.issn.1673-5501.2014.04.014

國(guó)家自然科學(xué)基金課題：SHANK3基因缺失/點(diǎn)突變與孤獨(dú)癥表型關(guān)系的研究及機(jī)制探討(2013NSFC：81371270)

1 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 上海，201102；2 美國(guó)杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)院

徐秀，E-mail：xuxiu@shmu.edu.cn

2014-06-03

2014-07-15)