隔離技術(shù)在無菌檢查中的應(yīng)用

吳文蕾 程錦生 鄭金旺

（上海東富龍愛瑞思科技有限公司，上海 201108）

從1980 年代中期，無菌檢查隔離器，當(dāng)時(shí)也被稱為實(shí)驗(yàn)室隔離器，首先在歐洲發(fā)展起來。隔離器被證實(shí)能夠提供微生物測(cè)試一個(gè)最可靠的環(huán)境，該環(huán)境能夠很好的防止微生物對(duì)測(cè)試用品的污染，并且避免假陽性的產(chǎn)生。并且在全球制藥行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用。

隨著中國(guó)藥典、GMP 的發(fā)展，無菌檢查隔離器也更多的被國(guó)內(nèi)制藥企業(yè)關(guān)注。本文針對(duì)無菌檢查隔離器的法規(guī)要求，發(fā)展技術(shù)背景以及設(shè)備特點(diǎn)進(jìn)行了說明。

1 無菌檢查隔離器的法規(guī)與技術(shù)背景

1.1 與無菌檢查隔離器相關(guān)的法規(guī)

在2010 年《中國(guó)藥典》中的《附錄XI H 無菌檢查法》[1]中規(guī)定“無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10 000 級(jí)下的局部潔凈度100 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，……”

而2014 年，《中國(guó)藥典》對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室的增補(bǔ)征求意見《附錄XVIII G 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則》中說明，“無菌檢查應(yīng)在B 級(jí)背景下的A 級(jí)單向流潔凈區(qū)域或D 級(jí)背景下的隔離器中進(jìn)行，……”

這也就意味著，如果征求意見通過審批，原來使用10 000 級(jí)（即C 級(jí)）下局部A 級(jí)的制藥企業(yè)已經(jīng)無法滿足增補(bǔ)版的藥典要求。如要繼續(xù)滿足法規(guī)，則有兩種選擇，一是改造實(shí)驗(yàn)室為B 級(jí)，另一種就是直接將局部的單向流潔凈區(qū)域換成隔離器。

以下是國(guó)際主流法規(guī)機(jī)構(gòu)的文獻(xiàn)對(duì)無菌檢查的相關(guān)說明：

●USP <1208>無菌檢查–隔離器系統(tǒng)驗(yàn)證[2]

“用于實(shí)施藥典所規(guī)定無菌檢查的隔離器從1980年代中期就開始使用了?！?使用隔離器的操作者無需穿著特殊的潔凈服來操作無菌檢查，標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室服就足夠了。…… 無菌檢查隔離器不一定要放置于定級(jí)的潔凈室中，重要的是放置隔離器的區(qū)域要對(duì)非必要人員的進(jìn)出限制管理。……房間里無需進(jìn)行環(huán)境監(jiān)控。……”

●PIC/S PI 012-3 無菌檢查[3]

“無菌檢查應(yīng)該在無菌條件下進(jìn)行，無菌檢查的操作環(huán)境要求和無菌藥品的生產(chǎn)環(huán)境一致。……”

●PIC/S PI 014-3 用于無菌工藝生產(chǎn)和無菌檢查的隔離器[4]

“當(dāng)隔離器用于無菌檢查時(shí)，沒有正式要求他們被放置在D 級(jí)環(huán)境。這個(gè)環(huán)境應(yīng)當(dāng)受到控制，例如只允許受過培訓(xùn)的員工進(jìn)入，但不一定需要定級(jí)別?！?/p>

1.2 無菌檢查隔離器的發(fā)展與優(yōu)勢(shì)

從1980 年代中期，無菌檢查隔離器就在歐洲得到了應(yīng)用[2]，當(dāng)時(shí)也被稱為實(shí)驗(yàn)室隔離器，并且隔離器所提供的無菌環(huán)境逐漸地被認(rèn)為是執(zhí)行有爭(zhēng)議的微生物測(cè)試最可靠的環(huán)境，該環(huán)境能夠很好的防止微生物對(duì)測(cè)試用品的污染，并且避免假陽性的產(chǎn)生。

在隔離器技術(shù)應(yīng)用于無菌檢查之前，執(zhí)行無菌檢查的操作和產(chǎn)生假陽性是關(guān)注的重點(diǎn)問題。無菌檢查過程中，假陽性產(chǎn)生有以下可能性[5]：

● 由操作者在無意識(shí)的情況下造成的污染；

● 在容器表面存在的污染；

● 測(cè)試環(huán)境與設(shè)施造成的污染；

● 使用受到污染的試劑和設(shè)備，或者取樣的操作產(chǎn)生的污染。

質(zhì)量控制微生物實(shí)驗(yàn)室依賴于有效控制的測(cè)試環(huán)境，適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品樣本和測(cè)試試劑，以及操作者的無菌技巧，才能夠保證無菌檢查的成功執(zhí)行。適當(dāng)?shù)脑噭┖彤a(chǎn)品樣本可以通過每批次促生長(zhǎng)以及產(chǎn)品樣本抗菌性和抗真菌性測(cè)試來進(jìn)行驗(yàn)證，但是控制測(cè)試的環(huán)境和管理控制操作人員的行為則相對(duì)困難。

隨著隔離器應(yīng)用于無菌檢查，雖然操作方式上并沒有簡(jiǎn)化，有時(shí)甚至操作起來不如傳統(tǒng)的方式方便，但是受到更可控環(huán)境的保護(hù)，加強(qiáng)了微生物的控制，并且降低了假陽性的發(fā)生，從而提高了測(cè)試性能。

Jack Lysfjord 在其著作中引用了美國(guó)某藥廠對(duì)無菌檢查在潔凈室進(jìn)行與在隔離器中進(jìn)行產(chǎn)生假陽性和經(jīng)濟(jì)損失做的比較，見表1 所示[6]：

表1 假陽性：隔離器 VS 潔凈室

另一方面，從使用成本角度考慮，在ISPE 的《無菌產(chǎn)品生產(chǎn)設(shè)施基礎(chǔ)指南》中提到，在使用隔離器時(shí)，運(yùn)行成本大約低于傳統(tǒng)潔凈室運(yùn)行成本的75%，主要是與HVAC 有關(guān)的運(yùn)行成本。其他成本，如：更衣、廠房設(shè)施布局、環(huán)境監(jiān)測(cè)方面也節(jié)省了花費(fèi)。

按照2014 年增補(bǔ)版征求稿的《中國(guó)藥典》，無菌檢查在B 級(jí)背景下的A 級(jí)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)室，如圖1 所示，需要設(shè)計(jì)復(fù)雜的更衣區(qū)域、緩沖間。

而如果是用隔離器，最簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)就是一個(gè)D 級(jí)房間，帶一個(gè)物料進(jìn)出口，一個(gè)人員進(jìn)出口即可。如圖2 所示。

2 無菌檢查隔離器

2.1 無菌檢查隔離器的設(shè)計(jì)

無菌檢查隔離器（如圖3）一般結(jié)構(gòu)由一個(gè)傳遞窗和一個(gè)操作區(qū)主箱體組成。結(jié)構(gòu)使用不銹鋼制成。隔離器具有良好的密閉性，運(yùn)行時(shí)內(nèi)部正壓控制，內(nèi)部單向流設(shè)計(jì)。主箱體上配備有手套，用以在隔離器中執(zhí)行無菌檢查操作。

主箱體內(nèi)部設(shè)置有無菌檢查專用的集菌儀，應(yīng)當(dāng)選用針對(duì)隔離器專門設(shè)計(jì)的集菌儀，如Millipore 的SteritestTMEquinox Isofit Pump（見圖4）。

圖1 傳統(tǒng)的微生物實(shí)驗(yàn)室布局圖

圖2 無菌檢查隔離器實(shí)驗(yàn)室部件圖

傳遞窗和主箱體配備內(nèi)置式汽化過氧化氫滅菌系統(tǒng)，根據(jù)工藝需求對(duì)隔離器內(nèi)部或傳遞進(jìn)入的耗材、樣品和試劑容器表面進(jìn)行滅菌。

隔離器可集成粒子計(jì)數(shù)器、微生物采樣器等環(huán)境監(jiān)測(cè)設(shè)備。

通過觸摸屏對(duì)隔離器進(jìn)行操作，根據(jù)客戶需求不同可提供滅菌數(shù)據(jù)、環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)報(bào)表的存儲(chǔ)、電子版本輸出或打印等功能?？刂葡到y(tǒng)的設(shè)計(jì)可滿足GAMP5，以及21CFR Part 11 對(duì)電子記錄和電子簽名的要求。

圖3 無菌檢查隔離器

圖4 隔離器專用集菌儀

2.2 汽化過氧化氫滅菌

汽化過氧化氫滅菌是無菌檢查隔離器中最重要的功能之一，使得隔離器內(nèi)部控制在一個(gè)生物負(fù)載很低的環(huán)境下。合理的滅菌循環(huán)可以使整個(gè)滅菌循環(huán)快速和安全。

由內(nèi)部氣流循環(huán)系統(tǒng)將快速生成的汽化過氧化氫帶入隔離器主箱體和傳遞窗中，對(duì)試劑樣品，耗材外包裝表面進(jìn)行滅菌。在隔離器完成空載的滅菌性能確認(rèn)后，需要針對(duì)固定的試劑、耗材等物品的排放方式進(jìn)行滿載的滅菌循環(huán)開發(fā)并驗(yàn)證，圖5 是隔離器在進(jìn)行滿載測(cè)試。合理的物品排放，恰當(dāng)?shù)臏缇h(huán)工藝參數(shù)，能在較短的時(shí)間內(nèi)（視裝載量和隔離器空間大小而定，一般在1.5～2.5 h 左右）實(shí)現(xiàn)6 SLR。并且滅菌過程具有重演性。圖6 為隔離器在空載時(shí)的滅菌循環(huán)曲線。

汽化過氧化氫滅菌工藝中很重要的一點(diǎn)是通風(fēng)后過氧化氫的殘留，一般要求通風(fēng)后過氧化氫濃度< 1 mL/m3（μg/g）。過多的殘留可能會(huì)導(dǎo)致假陰性的產(chǎn)生。

圖5 隔離器滿載測(cè)試

圖6 隔離器滅菌曲線報(bào)表

2.3 有關(guān)工藝耗材、試劑和工具

圖7 傳統(tǒng)的無菌檢查隔離器

圖7 所示為傳統(tǒng)的無菌檢查，操作人員正用注射器在酒精燈的火焰保護(hù)下處理粉針劑樣品。而試劑、培養(yǎng)基等是用牛皮紙覆蓋用線扎的。而這樣的傳統(tǒng)操作方式，以及選用的耗材包裝在隔離器中是絕對(duì)不推薦的。

操作者通過隔離器的手套對(duì)無菌檢查進(jìn)行操作，在使用前后都要對(duì)手套的完整性進(jìn)行檢查，在隔離器中應(yīng)當(dāng)避免使用注射器這類尖銳物，同時(shí)進(jìn)行的操作又較精細(xì)復(fù)雜的工具。一是戴手套操作會(huì)使得手的靈活性相對(duì)降低，復(fù)雜的動(dòng)作容易造成動(dòng)作失誤，而尖銳物容易扎破手套，破壞隔離器的完整性。

所有傳入隔離器的物品使用汽化過氧化氫進(jìn)行表面滅菌，要確保表面滅菌效果的同時(shí)，還要考慮過氧化氫在包裝表面造成的滲透和吸附問題。包裝材料的滲透可能會(huì)造成一定的工藝影響，例如，用于環(huán)境檢測(cè)的培養(yǎng)基，如果過氧化氫滲透到培養(yǎng)基中，可能會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的假陰性。而材料吸附會(huì)延長(zhǎng)過氧化氫的分解，延長(zhǎng)滅菌后的通風(fēng)時(shí)間。因此需要對(duì)選用的包裝材料進(jìn)行一些評(píng)估，或者選用隔離器專用的成品耗材，如Merck Millipore，BD 的相關(guān)產(chǎn)品。

編號(hào) 測(cè)試步驟 時(shí)間（min）1準(zhǔn)備試劑、樣品，打開隔離器 15 2按照SOP 進(jìn)料 30 3隔離器關(guān)門檢查 5 4隔離器泄漏測(cè)試，滅菌循環(huán)啟動(dòng) 120 5整理內(nèi)部物料 15 6 無菌檢查正式進(jìn)行（約10 個(gè)批次測(cè)試左右） 300 7打開隔離器進(jìn)行清理、清潔 30總時(shí)間 510

2.4 無菌檢查隔離器的排產(chǎn)

以下為一個(gè)僅含主箱體的隔離器（不帶Passbox）的一天的使用周期，適合測(cè)試量較小的用戶使用。如圖5，即為這種應(yīng)用方式。

當(dāng)用戶檢測(cè)批次較多時(shí)，建議配置Passbox，從而可以連續(xù)進(jìn)行無菌檢查。在進(jìn)行無菌檢查的同時(shí)，可利用Passbox 進(jìn)行下一批物料的滅菌，完成后轉(zhuǎn)移至主箱體。圖8 所示即為帶Passbox 的隔離器，圖中操作人員正在對(duì)隔離器的主箱體和Passbox 進(jìn)料。

首次滅菌完成后，主箱體就不再打開，而傳遞、進(jìn)料和滅菌的操作都將在Passbox 中進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)連續(xù)的測(cè)試。一天8.5 h 左右可以連續(xù)做約20 個(gè)測(cè)試。

圖8 正在對(duì)隔離器進(jìn)行裝料

需要注意的是，當(dāng)主箱體連續(xù)進(jìn)行測(cè)試時(shí)，需要定期進(jìn)行微生物檢測(cè)，尤其注意隔離器手套手指部分要定期進(jìn)行表面微生物測(cè)試，如果微生物水平有超過警告線的趨勢(shì)時(shí)，就應(yīng)當(dāng)對(duì)隔離器主箱體進(jìn)行滅菌。通過這些微生物測(cè)試數(shù)據(jù)，可確定隔離器整體滅菌的周期，形成SOP。

2.5 軟墻隔離器

最早的無菌檢查隔離器是軟墻隔離器。它由不銹鋼材質(zhì)作為框架和基座，在框架上裝上封閉的PVC 材質(zhì)的塑料罩，裝配有半身衣或手套對(duì)無菌檢查進(jìn)行操作，透明的材質(zhì)使得工藝內(nèi)部的操作一覽無余。相對(duì)于不銹鋼的硬墻材質(zhì)，這種軟墻隔離器較為經(jīng)濟(jì)。由于PVC 材料可折疊，框架可拆散，因此對(duì)于進(jìn)廠空間有限制的實(shí)驗(yàn)室可能是一種可選方案。

但是軟墻隔離器的結(jié)構(gòu)不如硬墻的堅(jiān)固，容易造成破損。對(duì)柔軟的表面擦拭清潔也不如硬墻結(jié)構(gòu)的操作可靠方便。在進(jìn)行汽化過氧化氫滅菌的過程中，PVC 材質(zhì)容易吸附過氧化氫，從而造成通風(fēng)時(shí)間過長(zhǎng)。一般軟墻隔離器中氣流為紊流，雖然法規(guī)如USP 對(duì)無菌檢查隔離器的氣流要求的描述為“紊流或單向流”，事實(shí)上，越來越多的用戶傾向于使用單向流。圖9 所示的為一家無菌檢查隔離器供應(yīng)商對(duì)軟墻隔離器和硬墻隔離器 （帶passbox 和不含passbox） 進(jìn)行的趨勢(shì)分析。可見無菌檢查隔離器的需求量逐年增大，而軟墻隔離器的使用量逐年呈遞減趨勢(shì)。

圖9 無菌檢查隔離器的發(fā)展趨勢(shì)

3 總結(jié)

綜上所述，無菌檢查隔離器的應(yīng)用能保障無菌檢查在一個(gè)受控封閉的，低生物負(fù)載的環(huán)境下操作，隔離操作者和工藝，從工藝本身避免假陽性的產(chǎn)生。當(dāng)操作高活性、藥性強(qiáng)的藥品時(shí)還能保護(hù)操作者不受藥物影響。按照國(guó)際主流的法規(guī)，無菌檢查可以完全摒棄潔凈室，縮小廠房結(jié)構(gòu)，省去繁復(fù)的更衣過程，以及減少或者省略日常的房間微生物檢測(cè)，降低運(yùn)行成本。

隔離器的結(jié)構(gòu)一定程度上限制了操作者的動(dòng)作幅度，隔離器的手套也降低了手指的靈活性。一天的工作安排要充分考慮耗材、試劑的傳遞滅菌周期。手套、半身衣等部件的破損會(huì)直接影響隔離器的完整性。因此，要重新考慮無菌檢查工藝過程與隔離器的匹配性。使用適當(dāng)?shù)姆椒?，選擇適合隔離器的耗材與工具是非常重要的。

無菌檢查隔離器的裝載量要經(jīng)過驗(yàn)證，在保證滅菌效果達(dá)到6 log 的同時(shí)，確保通風(fēng)充分，殘留降低到可接受范圍，避免假陰性的產(chǎn)生。

連續(xù)進(jìn)行多批次的無菌檢查操作時(shí)，要關(guān)注隔離器內(nèi)部的環(huán)境監(jiān)測(cè)，包括粒子、微生物，尤其是工作臺(tái)、手套等部件的表面微生物檢查。制定合理的隔離器內(nèi)部清潔和滅菌頻率。

無菌檢查隔離器發(fā)展至今已經(jīng)超過了40 年，有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2000 年，全球范圍有500 臺(tái)無菌檢查隔離器應(yīng)用于大大小小的藥廠。對(duì)于中國(guó)，無論從法規(guī)角度還是制藥企業(yè)自身的發(fā)展來看，隔離器已經(jīng)成為無菌檢查的應(yīng)用趨勢(shì)。

[1] 中國(guó)藥典, 附錄XI H 無菌檢查法, 2010.[S].

[2] USP 24, Chapter<1208> Sterility Testing: Validation of Isolator Systems , second supplement (1999).[S].

[3] PIC/S, PI 012-3, Recommendation on Sterility Testing, 2007.[S].

[4] PIC/S, PI 014-3, Recommendation Isolators Used for Aseptic Processing and Sterility Testing, 2007.[S].

[5] Carmen M.Wagner, Patrice Cloue[M]. Sterility Test Isolators, 2009.

[6] Jack Lysfjord, Practical Aseptic Processing –Fill and Finish[M]. 2009, vol 2, 86-87.