• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    氯碘羥喹對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠銅藍(lán)蛋白表達(dá)的影響

    2014-08-10 12:28:29陳艷麗王改青尹永峰趙瑞
    疑難病雜志 2014年4期
    關(guān)鍵詞:免疫組化腦組織腦出血

    陳艷麗,王改青,尹永峰,趙瑞

    論著·基礎(chǔ)

    氯碘羥喹對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠銅藍(lán)蛋白表達(dá)的影響

    陳艷麗,王改青,尹永峰,趙瑞

    目的研究金屬螯合劑氯碘羥喹(CQ)干預(yù)大鼠腦出血(ICH)后鐵超載狀態(tài)下銅藍(lán)蛋白(Cp)的表達(dá)。方法將48只Wistar大鼠隨機(jī)分為2組:對(duì)照組、干預(yù)組各24只,均采用立體定向技術(shù)向大鼠尾狀核區(qū)注射膠原酶制備ICH模型,制模成功后干預(yù)組給予氯碘羥喹50 mg/kg灌胃, 1次/12 h;對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃。2組在術(shù)后1、3、7、14 d不同時(shí)間點(diǎn)各取6只大鼠斷頭取腦,采用免疫組化染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Cp的表達(dá)。結(jié)果ICH模型制備后,隨著時(shí)間延長(zhǎng)2組Cp陽(yáng)性表達(dá)數(shù)顯著增加,在第7天達(dá)峰值;與對(duì)照組相比,干預(yù)組大鼠腦組織內(nèi)Cp在第1天無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),在3~14 d的表達(dá)均升高(P<0.05)。2組Cp mRNA表達(dá)水平高峰出現(xiàn)在第7天,且第3、7、14 d均高于第1天表達(dá)水平(P<0.05)。與對(duì)照組比較,干預(yù)組第3、7、14天Cp mRNA表達(dá)水平較高(P<0.05)。結(jié)論CQ通過(guò)調(diào)節(jié)腦出血后腦組織內(nèi)銅藍(lán)蛋白的表達(dá),可能加速腦組織內(nèi)鐵離子的清除從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

    氯碘羥喹;腦出血;銅藍(lán)蛋白;大鼠

    氯碘羥喹(clioquinol,CQ)是一種膜通透性強(qiáng),且能通過(guò)血腦屏障的2價(jià)金屬離子螯合劑。近年來(lái)研究表明CQ能調(diào)節(jié)腦內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài),對(duì)預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。腦出血后,隨著血紅蛋白的分解,局部鐵離子濃度持續(xù)升高,成為腦出血(ICH)繼發(fā)性腦損傷的重要因素之一[1]。鐵作為一種可變金屬,通過(guò)Fenton反應(yīng)可產(chǎn)生大量活性氧激發(fā)氧化壓力,引起腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化及DNA的破壞[2]。由于游離Fe2+參與活性氧的形成并在腦出血的損害機(jī)制中起主要作用,故對(duì)Fe2+的有效結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)可能預(yù)防或減輕鐵超載所致的繼發(fā)性損害[3]。目前關(guān)于腦出血后鐵離子代謝和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究很多,但腦出血后鐵超載的清除機(jī)制及腦內(nèi)鐵相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)CQ對(duì)亞鐵離子的螯合作用,動(dòng)態(tài)觀察銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin,Cp)表達(dá)的變化,進(jìn)一步明確ICH后鐵離子的清除機(jī)制,同時(shí)為腦出血的臨床治療開辟新思路,提供理論依據(jù)?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:3月齡雄性Wistar大鼠48只,體質(zhì)量250~300 g,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)和自由飲水,飼養(yǎng)室溫度20~25℃,濕度適中,由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按數(shù)字表隨機(jī)分為對(duì)照組和干預(yù)組各24只 ,每組造模術(shù)后,1、3、7、14 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取6只大鼠進(jìn)行觀測(cè)。(2)試劑與儀器:氯碘羥喹(武漢鴻信康精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)),江灣型腦立體定位儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司),微量注射器(上海高鴿工貿(mào)有限公司生產(chǎn)),膠原酶(上海杰美生物有限公司抗大鼠生產(chǎn)), 兔抗大鼠Cp抗體(博奧森生物公司生產(chǎn)),SABC免疫組化試劑盒(博士德生物試劑公司生產(chǎn)),DAB顯色劑(北京中杉金橋生物工程公司生產(chǎn)), PCR試劑盒及引物設(shè)計(jì)(大連寶生物工程有限公司生產(chǎn))。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 大鼠ICH模型制備:48只大鼠以4%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉,腦立體定位儀固定大鼠,頭正中約15 mm 縱行手術(shù)切口,暴露前囟,右側(cè)中線旁1.3 mm,前囟后3.2 mm為穿刺點(diǎn),用大頭針鉆透顱骨,微量注射器抽取含0.5 U膠原酶生理鹽水2 μl,迅速插入鉆好的孔內(nèi),向內(nèi)進(jìn)針5.8 mm。在2 min內(nèi)注射完畢,留針15 min后緩慢退針。拔針后無(wú)清亮液體自針道返流,大鼠蘇醒后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀視為造模成功,回籠飼養(yǎng)。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn):術(shù)后見明顯的肢體癱瘓,沿針道冠狀面切開腦組織可見基底節(jié)區(qū)血腫形成。各組術(shù)后各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)按參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分,最高分18分,最低分3分,分?jǐn)?shù)越低神經(jīng)功能障礙越重。干預(yù)組CQ 50 mg/kg灌胃,1次/12 h,對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃。2組造模后于1、3、7、14 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取6只大鼠腦組織進(jìn)行標(biāo)本制作。

    1.2.2 標(biāo)本制作:各組腦出血模型大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉后,斷頭取腦,以針眼為中心做冠狀切面,額部用錫箔紙包裹,置于-80℃冰箱保存用于PCR檢測(cè);余下標(biāo)本固定于4%多聚甲醛液72 h,石蠟包埋,連續(xù)切片,厚約4 μm,行免疫組化染色。

    1.2.3 免疫組化染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,用新鮮配制的3% H2O2液處理10 min,雙蒸水洗3次;切片浸入0.01 mol枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0),并電爐加熱至沸騰后2 min斷電。冷卻后0.1 mol PBS(pH 7.2~7.4)洗滌2次;滴加正常山羊血清封閉液,37℃ 20 min。滴加稀釋的一抗(最佳稀釋濃度 1∶300),-4℃過(guò)夜。0.1 mol PBS洗2 min×3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG,37℃ 20 min。0.1 mol PBS洗2 min×3次;滴加試劑SABC,37℃ 20 min。PBS洗5 min×4次;取1ml雙蒸水,加DAB顯色試劑盒中A、B、C試劑各1滴,混勻后加至切片上,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,觀察DAB顯色完全后用雙蒸水洗滌中止反應(yīng);蘇木素輕度復(fù)染。脫水、透明及封片。

    1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:取血腫周圍腦組織進(jìn)行RT-q PCR分析。采用Trizol試劑提取腦組織總RNA。采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,按操作說(shuō)明將組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;Cp引物上游序列:5'-GGCTCCAAGAGGAAGAAACAT-3',下游序列:3'-CCAGAAGCATAGTCCCAAACTG-5',擴(kuò)增片段長(zhǎng)132 bp;β-actin引物上游序列:5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3',下游序列:3'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-5',擴(kuò)增片段長(zhǎng)150 bp。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸45 s。循環(huán)40次。應(yīng)用ABI7300型擴(kuò)增儀圖像處理系統(tǒng)分析。

    1.3 檢測(cè)指標(biāo)

    1.3.1 免疫組化染色:普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞漿和胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片在40倍物鏡下選擇缺血半暗帶區(qū)相鄰而不重疊的5個(gè)視野區(qū),計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取平均值為測(cè)量值。

    1.3.2 PT-qPCR 分析:PCR擴(kuò)增結(jié)束后,記錄每個(gè)反應(yīng)管中熒光信號(hào)所達(dá)設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)即CT值。以β-action為內(nèi)參,△CT是目的基因(target基因)和內(nèi)參基因循環(huán)閾值的差值。△△CT=干預(yù)組(CTtarget-CTβ-action)-對(duì)照組(CTtarget-CTβ-action)。目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT方法計(jì)算。

    2 結(jié) 果

    2.1 免疫組化Cp的表達(dá) Cp陽(yáng)性表達(dá)主要位于腦出血周邊的膠質(zhì)細(xì)胞,較少表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖1、2見封3)。隨著時(shí)間延長(zhǎng),2組Cp表達(dá)逐漸增多,于第7天達(dá)高峰;第3、7、14 d時(shí),干預(yù)組的表達(dá)較對(duì)照組明顯增多(P<0.05)。見表1。

    表1 2組Cp陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)比較個(gè)/HP)

    注:與1 d比較,*P<0.05;與3 d比較,#P<0.05;與7 d比較,△P<0.05;與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較,☆P<0.052.2 Cp mRNA表達(dá)變化 2組Cp mRNA表達(dá)水平高峰均出現(xiàn)在第7天,與對(duì)照組相比,干預(yù)組大鼠腦組織內(nèi)CP mRNA 在第1天無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),第3、7、14天3個(gè)時(shí)點(diǎn)的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組,2組比較差異有在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表2 2組Cp mRNA的表達(dá)比較

    注:與1 d比較,*P<0.05;與3 d比較,#P<0.05;與7 d比較,△P<0.05;與對(duì)照組比較,☆P<0.05

    3 討 論

    ICH后繼發(fā)腦損傷與諸多因素有關(guān),其中紅細(xì)胞最終降解產(chǎn)物鐵離子在血腫周圍組織濃度異常起主要作用。其中二價(jià)鐵可能起關(guān)鍵作用;鐵螯合劑的使用可有效減少神經(jīng)元死亡,提高神經(jīng)功能恢復(fù)能力[5]。但最近研究顯示三價(jià)鐵螯合劑——去鐵胺并不能改善大鼠腦出血的預(yù)后[6]。

    Cp是重要的亞鐵氧化酶,主要在肝臟合成,可在任何鼠類大腦皮質(zhì)、基底神經(jīng)節(jié)、黑質(zhì)、海馬、小腦、胼胝體等表達(dá),主要存在于腦毛細(xì)血管床周圍膠質(zhì)細(xì)胞。最早認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的Fe2+首先被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上,然后經(jīng)Cp的作用氧化成Fe3+,進(jìn)而與細(xì)胞外的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合離開細(xì)胞膜[7],Cp的主要作用是通過(guò)亞鐵氧化酶的活性實(shí)現(xiàn)的,既能影響細(xì)胞鐵釋放也能影響細(xì)胞鐵攝取,在腦細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中, 后者比前者重要[8]。

    Mukhopadhyay等[9]認(rèn)為如果缺乏Cp可以驅(qū)使非鐵蛋白結(jié)合的鐵離子(包括抗血酸亞鐵、枸櫞酸或自由的Fe2+)進(jìn)入神經(jīng)元或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織細(xì)胞中。造成神經(jīng)元或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織細(xì)胞中鐵的過(guò)度沉積,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)形成自由基,引起一連串的病理變化導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。另外有研究顯示,應(yīng)用銅藍(lán)蛋白能改善腦出血大鼠的運(yùn)動(dòng)功能,促進(jìn)康復(fù),認(rèn)為在腦內(nèi)鐵超載的狀態(tài)下其主要發(fā)揮了鐵釋放的功能[10]。本次試驗(yàn)顯示在腦出血對(duì)照組中,Cp表達(dá)逐漸增多,在第7天達(dá)高峰,因此推斷可能在生理情況下,Cp主要發(fā)揮其鐵攝取功能,在病理狀態(tài)下,Cp表達(dá)增多,發(fā)揮其鐵釋放作用,促進(jìn)鐵的轉(zhuǎn)出,從而減輕鐵超載情況下鐵離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。

    有研究發(fā)現(xiàn),鐵螯合劑和缺氧能增加外周細(xì)胞Cp mRNA的表達(dá)[9]。另外有研究認(rèn)為Cp與鐵調(diào)素、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白共同對(duì)二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白(FP1)發(fā)揮其鐵轉(zhuǎn)出的功能起協(xié)同作用,共同調(diào)節(jié)鐵的利用與儲(chǔ)存,同時(shí)FP1介導(dǎo)的鐵轉(zhuǎn)出也依賴Cp的亞鐵氧化酶的活性[11~13]。本實(shí)驗(yàn)顯示在對(duì)照組中,第3、7、14天 Cp mRNA的表達(dá)逐漸增多。這與以上觀察一致,提示Cp的中樞調(diào)控可能和外周的調(diào)控機(jī)制類似。

    Cp作為一個(gè)急性期反應(yīng)蛋白,在臨床許多疾病的診斷檢測(cè)及預(yù)后判斷上應(yīng)用廣泛。根據(jù)目前研究已明確,Cp在腦內(nèi)鐵代謝紊亂過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,但是具體的機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

    1 Wagner KR,Sharp FR,Ardizzone TD,et al. Heme and Iron metabolism:role in cerebral hemorrhage[J]. J Cereb Blood FloW Metab,2003,23(6):629-652.

    2 Friedman A,Arosio P,Finazzi D,et al. Ferritin aSan important player in neurodegeneration[J].Parkinsonism Relat Disord,2011,17(6):423-430.

    3 Wu H,Wu T,Li M ,et al.Efficacy of the lipid-soluble iron chelator 2,2’-dipyridy1 against hemorrhagic brain injury[J].Neurobiol Dis,2012,45(1):388-394.

    4 Gorio A,Gokmen N,Erbayraktar S,et a1.Recombinant human erythropoietin counteractSsecondary injury and markedly enhanceSneurological recovery from experimental spinal cord trauma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(14):9450-9455.

    5 Wu H,Wu T,Xu X,et al;Iron toxicity in mice with collagenase-induced intracerebral hemorrhage[J].J Cereb Blood Flow Metab,2011 ,31(5):1243-1250.

    6 Auriat AM,Silasi G,Wei Z,et al. Ferric iron chelation lowerSbrain iron levelSafter intracerebral hemorrhage in ratSbut doeSnot improve outcome[J].Exp Neurol,2012,234(1):136-143.

    7 Qian ZM,Wang Q. Expression of iron transport protein and excessive iron accumulation in the brain in neurodegenerative disorders[J]. Brain ReSRev,1998,27(3):257-267.

    8 常彥忠,錢忠明.銅藍(lán)蛋白與腦代謝[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2002,33(2):102-103.

    9 Mukhopadhyay CK,Mazumder B,Fox PL,et al.Role of hypoxia inducible actor 1in transcriptional activation of ceruloplasmin by iron deficiency[J]. J Biol Chem,2000,275(28):21048-21054.

    10 楊樹旭,錢聰,葉紅星,等.銅藍(lán)蛋白對(duì)腦出血大鼠腦水腫的影響[J]. 全科醫(yī)學(xué)臨床與教育,2010,8(4):402-404.

    11 Zheng W,Monnot AD.Regulation of brain iron and copper homeostasiSby brain barrier systems:Implication in neurodegenerative diseases[J].Pharmacol Ther,2012,133(2):177-188.

    12 Rouault TA,Zhang DL,Jeong SY.Brain iron homeostasis,the choroid plexus,and localization of iron transport proteins[J].Metab Brain Dis,2009,24(4):673-684.

    13 Leitner DF,Connor JR.Functional roleSof transferrin in the brain[J].Biochim BiophySActa,2012,1820(3):393-402.

    Influenceofclioquinolonexperimentalcerebralhemorrhageinratswithceruloplasminexpression

    CHENYanli,WANGGaiqing,YINYongfeng,ZHAORui.

    DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,ChinaCorrespondingauthor:WANGGaiqing,E-mail:wanggq08@126.com

    ObjectiveTo study the effect of clioquinol on the expression of ceruloplasmin in experimental cerebral hemorrhage (ICH) rats.Methods48 Wistar ratSwere randomly divided into 2 groups:control group and the intervention group with each group of 24 rats,using stereotactic injection of collagenase preparation ICH model to the caudate nucleuSof rats,after molding succesSthe intervention group were given clioquinol 50 mg / kg orally every 12 h; intragastric saline control group. From each of 2 groups,six ratSdecapitated at different time pointSafter 1,3,7,14 d,using immunohistochemical staining and real-time PCR detection of Cp.ResultsICH model after preparation ,two groupSwith time Cp positive expression waSsignificantly increased in the first seven daySof the peak; compared with the control group,the intervention group within the brain tissue of ratSin the first Cp day showed no significant difference (P>0.05),the expression at 3-14 d were higher (P<0.05). 2 groups' Cp mRNA expression levelSpeaked at 7 days,and the first 3,7,14 d were higher than the first day expression level (P<0.05). Compared with the control group,the intervention group 3,7,14 day Cp mRNA expression levelSwere higher (P<0.05).ConclusionCQ adjust cerebral hemorrhage by regulating the expression of ceruloplasmin in brain tissue,brain tissue may accelerate the removal of iron ionSand thuSplay a protective role in the brain.

    Chloroiodide quinoline; Cerebral hemorrhage; Ceruloplasmin; Rats

    山西省高??萍蓟痦?xiàng)目(No.20091113);山西醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金(No.01201115)

    030001 太原,山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

    王改青, E-mail:wanggq08@126.com

    10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.04.020

    2013-12-17)

    猜你喜歡
    免疫組化腦組織腦出血
    中西醫(yī)結(jié)合治療腦出血的療效觀察
    夏枯草水提液對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎的治療作用及機(jī)制研究
    嬰幼兒原始黏液樣間葉性腫瘤一例及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    結(jié)直腸癌組織中SOX9與RUNX1表達(dá)及其臨床意義
    小腦組織壓片快速制作在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
    芒果苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦組織炎癥損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    脾切除后伴發(fā)腦出血1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    納洛酮在腦出血治療中的應(yīng)用探析
    子宮瘢痕妊娠的病理免疫組化特點(diǎn)分析
    DNA雙加氧酶TET2在老年癡呆動(dòng)物模型腦組織中的表達(dá)及其對(duì)氧化應(yīng)激中神經(jīng)元的保護(hù)作用
    亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品电影一区二区三区| 多毛熟女@视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲五月天丁香| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产高清有码在线观看视频 | 精品国产乱码久久久久久男人| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美在线一区亚洲| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲精华国产精华精| 两个人视频免费观看高清| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲七黄色美女视频| 日本 欧美在线| 午夜福利视频1000在线观看 | 成人特级黄色片久久久久久久| 丝袜在线中文字幕| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久人人精品亚洲av| 老司机靠b影院| av天堂在线播放| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲全国av大片| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品影院久久| 村上凉子中文字幕在线| 色在线成人网| 久久亚洲精品不卡| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 一区福利在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲片人在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 人人澡人人妻人| 日日摸夜夜添夜夜添小说| av电影中文网址| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品久久久久久,| 悠悠久久av| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲视频免费观看视频| 在线天堂中文资源库| 久久久精品欧美日韩精品| 免费观看人在逋| 亚洲人成电影观看| 男人操女人黄网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲人成伊人成综合网2020| 成年女人毛片免费观看观看9| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 高清在线国产一区| 91老司机精品| 波多野结衣巨乳人妻| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 老汉色∧v一级毛片| 久热爱精品视频在线9| 精品不卡国产一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 999久久久国产精品视频| 乱人伦中国视频| 国产成人系列免费观看| 国产精品久久久久久精品电影 | 国产免费av片在线观看野外av| 一级a爱片免费观看的视频| 久久精品国产清高在天天线| 视频区欧美日本亚洲| 欧美在线一区亚洲| 99香蕉大伊视频| 国内精品久久久久久久电影| 少妇的丰满在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 正在播放国产对白刺激| 精品一区二区三区av网在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 精品久久久久久,| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲中文av在线| 国产成人精品无人区| 一级片免费观看大全| 给我免费播放毛片高清在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 精品欧美国产一区二区三| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品 欧美亚洲| 窝窝影院91人妻| 女性被躁到高潮视频| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲专区中文字幕在线| 一区福利在线观看| 在线免费观看的www视频| 黑丝袜美女国产一区| 电影成人av| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲成国产人片在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 女性被躁到高潮视频| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 日韩精品青青久久久久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲国产精品999在线| 欧美午夜高清在线| or卡值多少钱| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品无人区乱码1区二区| 日韩欧美在线二视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费观看精品视频网站| 91九色精品人成在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 午夜福利欧美成人| av有码第一页| 啪啪无遮挡十八禁网站| 99久久国产精品久久久| 级片在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 成人av一区二区三区在线看| 丁香欧美五月| 黄色视频,在线免费观看| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 多毛熟女@视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一区福利在线观看| a级毛片在线看网站| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 99国产精品一区二区蜜桃av| 后天国语完整版免费观看| 欧美中文综合在线视频| 岛国在线观看网站| 99re在线观看精品视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 老司机福利观看| av电影中文网址| 午夜福利18| 久久中文字幕人妻熟女| 三级毛片av免费| 啦啦啦韩国在线观看视频| 午夜激情av网站| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产色视频综合| 久久草成人影院| 一级毛片精品| 9热在线视频观看99| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产av精品麻豆| 午夜免费激情av| 十分钟在线观看高清视频www| 怎么达到女性高潮| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 成人av一区二区三区在线看| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 乱人伦中国视频| 美女午夜性视频免费| videosex国产| 一本久久中文字幕| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜免费鲁丝| 日韩国内少妇激情av| 久久婷婷成人综合色麻豆| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久久久大精品| 国产熟女午夜一区二区三区| 伦理电影免费视频| 亚洲国产精品合色在线| www.自偷自拍.com| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲精华国产精华精| 欧美丝袜亚洲另类 | 99精品久久久久人妻精品| xxx96com| 国产亚洲av高清不卡| 搡老岳熟女国产| 丝袜美腿诱惑在线| 精品熟女少妇八av免费久了| xxx96com| 女同久久另类99精品国产91| 日韩精品免费视频一区二区三区| 91av网站免费观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 99国产精品99久久久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 黄频高清免费视频| 久久香蕉激情| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费无遮挡裸体视频| 国产xxxxx性猛交| or卡值多少钱| 一进一出抽搐动态| 窝窝影院91人妻| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲自拍偷在线| 亚洲中文av在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 午夜免费鲁丝| 中文亚洲av片在线观看爽| 男人舔女人下体高潮全视频| cao死你这个sao货| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产区一区二久久| 窝窝影院91人妻| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲精品一区av在线观看| 国产xxxxx性猛交| 欧美激情极品国产一区二区三区| 变态另类丝袜制服| tocl精华| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 免费看十八禁软件| 午夜成年电影在线免费观看| 激情在线观看视频在线高清| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品精品国产色婷婷| 午夜老司机福利片| 丁香六月欧美| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲第一青青草原| 日本a在线网址| 欧美黄色淫秽网站| 成人永久免费在线观看视频| 村上凉子中文字幕在线| 91av网站免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 好男人电影高清在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 性少妇av在线| 香蕉久久夜色| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产精品九九99| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美一区二区精品小视频在线| 美女高潮到喷水免费观看| 男人操女人黄网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产午夜精品久久久久久| 麻豆国产av国片精品| 国产99久久九九免费精品| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 一级毛片高清免费大全| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 亚洲色图综合在线观看| 男人舔女人的私密视频| 啦啦啦 在线观看视频| 三级毛片av免费| 精品久久久精品久久久| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 看免费av毛片| 国产精品综合久久久久久久免费 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品不卡国产一区二区三区| 一进一出好大好爽视频| 日本a在线网址| 校园春色视频在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 一区二区三区精品91| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 在线观看一区二区三区| 免费看十八禁软件| 午夜久久久久精精品| 国产成人欧美| 女性生殖器流出的白浆| 美女 人体艺术 gogo| 一级毛片女人18水好多| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久国产成人精品二区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲国产看品久久| 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费搜索国产男女视频| 色尼玛亚洲综合影院| 窝窝影院91人妻| 波多野结衣av一区二区av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 校园春色视频在线观看| 亚洲三区欧美一区| 国产精品一区二区三区四区久久 | 久久久水蜜桃国产精品网| 三级毛片av免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品影院久久| 两个人视频免费观看高清| 久久午夜综合久久蜜桃| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 免费看美女性在线毛片视频| 国产激情久久老熟女| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 黄色视频不卡| 狂野欧美激情性xxxx| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 99国产精品一区二区三区| 丰满的人妻完整版| 99精品久久久久人妻精品| 精品国产国语对白av| 国产高清激情床上av| 好男人在线观看高清免费视频 | 欧美性长视频在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 黄色片一级片一级黄色片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 长腿黑丝高跟| 桃色一区二区三区在线观看| 曰老女人黄片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 最新在线观看一区二区三区| 国产乱人伦免费视频| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 中文亚洲av片在线观看爽| 免费观看人在逋| 亚洲在线自拍视频| 免费看a级黄色片| 亚洲黑人精品在线| 久久久久精品国产欧美久久久| ponron亚洲| 亚洲七黄色美女视频| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产亚洲欧美精品永久| 国产午夜福利久久久久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 高清在线国产一区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久久国产精品麻豆| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 不卡av一区二区三区| 99热只有精品国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产熟女xx| 黄片小视频在线播放| 热99re8久久精品国产| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲第一青青草原| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| АⅤ资源中文在线天堂| 性欧美人与动物交配| 在线观看66精品国产| 久久香蕉国产精品| 可以在线观看的亚洲视频| 757午夜福利合集在线观看| 午夜福利,免费看| 日韩av在线大香蕉| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久精品国产综合久久久| 午夜影院日韩av| 国产精品精品国产色婷婷| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 91字幕亚洲| 18美女黄网站色大片免费观看| 又黄又粗又硬又大视频| 久久久国产精品麻豆| 中文字幕最新亚洲高清| 好男人电影高清在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 黑人操中国人逼视频| 亚洲男人天堂网一区| 老司机午夜福利在线观看视频| 美女国产高潮福利片在线看| 午夜福利一区二区在线看| 麻豆av在线久日| 欧美大码av| 又黄又爽又免费观看的视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲全国av大片| 亚洲av电影在线进入| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品影院久久| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲情色 制服丝袜| 久久久久久免费高清国产稀缺| 一夜夜www| 久久人妻av系列| 我的亚洲天堂| 国产av在哪里看| www.www免费av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 午夜福利一区二区在线看| 一进一出抽搐动态| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 黄色视频,在线免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| av中文乱码字幕在线| 国产色视频综合| 美女国产高潮福利片在线看| 90打野战视频偷拍视频| 制服人妻中文乱码| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产成人影院久久av| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品日产1卡2卡| 久久欧美精品欧美久久欧美| 桃红色精品国产亚洲av| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av成人av| 高清在线国产一区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 中文字幕人妻熟女乱码| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久精品影院6| 高清在线国产一区| 日本五十路高清| 国产av又大| 欧美激情久久久久久爽电影 | 日日爽夜夜爽网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久性视频一级片| 亚洲色图av天堂| 午夜福利免费观看在线| 久久伊人香网站| 国产一区在线观看成人免费| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品免费视频内射| 久久中文字幕人妻熟女| 一级毛片女人18水好多| 91九色精品人成在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 多毛熟女@视频| 亚洲少妇的诱惑av| 国产色视频综合| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 99热只有精品国产| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精品国产亚洲在线| 满18在线观看网站| 国产1区2区3区精品| 亚洲成人国产一区在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 中文字幕精品免费在线观看视频| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜久久久在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 男人操女人黄网站| 亚洲熟女毛片儿| 色播亚洲综合网| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 十八禁网站免费在线| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 真人一进一出gif抽搐免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 黑丝袜美女国产一区| 91精品国产国语对白视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久国产欧美日韩av| 久久九九热精品免费| 亚洲专区国产一区二区| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品亚洲美女久久久| 嫩草影院精品99| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲av美国av| 国产精品一区二区免费欧美| 久久亚洲精品不卡| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 桃色一区二区三区在线观看| 999久久久国产精品视频| 操出白浆在线播放| 悠悠久久av| 成人手机av| 老司机深夜福利视频在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲av成人一区二区三| 久久久久久国产a免费观看| 丁香六月欧美| 在线天堂中文资源库| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久影院123| 黄片小视频在线播放| 制服人妻中文乱码| 日韩欧美三级三区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久伊人香网站| 国产免费av片在线观看野外av| 国产片内射在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 国产真人三级小视频在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲精品一区av在线观看| 很黄的视频免费| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品无人区乱码1区二区| www.自偷自拍.com| 热99re8久久精品国产| 午夜精品国产一区二区电影| 久久久国产成人免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产国语露脸激情在线看| 男人舔女人的私密视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| ponron亚洲| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲精品一区av在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| av中文乱码字幕在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 波多野结衣av一区二区av| 狂野欧美激情性xxxx| 男女下面进入的视频免费午夜 | 69精品国产乱码久久久| 一区二区三区高清视频在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 色哟哟哟哟哟哟| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲全国av大片| 99久久精品国产亚洲精品| 国产成人系列免费观看| 色av中文字幕| 欧美黑人精品巨大| av天堂久久9| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲久久久国产精品| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 国产麻豆69| 国产亚洲精品第一综合不卡| 极品人妻少妇av视频| 在线视频色国产色| 亚洲国产中文字幕在线视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 制服诱惑二区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美日韩一级在线毛片| 嫩草影视91久久| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品日产1卡2卡| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 一进一出好大好爽视频| 9色porny在线观看| 国产午夜精品久久久久久| netflix在线观看网站| 91av网站免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 久久精品成人免费网站| 亚洲精品在线美女| 国产麻豆成人av免费视频| av中文乱码字幕在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 在线观看一区二区三区| 亚洲第一电影网av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 脱女人内裤的视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久精品影院6| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 一进一出抽搐动态| 色在线成人网| 精品欧美一区二区三区在线| 少妇被粗大的猛进出69影院| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久久久久大精品| 亚洲一区中文字幕在线| 国产色视频综合| 亚洲伊人色综图| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲,欧美精品.| 热re99久久国产66热| 精品免费久久久久久久清纯| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲少妇的诱惑av| 校园春色视频在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产1区2区3区精品| 制服丝袜大香蕉在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久国产成人免费| 最好的美女福利视频网| 成人18禁在线播放| АⅤ资源中文在线天堂| 美国免费a级毛片| 久久久久久久久久久久大奶| 麻豆久久精品国产亚洲av| 成人国语在线视频|