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    氯碘羥喹對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠銅藍(lán)蛋白表達(dá)的影響

    2014-08-10 12:28:29陳艷麗王改青尹永峰趙瑞
    疑難病雜志 2014年4期
    關(guān)鍵詞:免疫組化腦組織腦出血

    陳艷麗,王改青,尹永峰,趙瑞

    論著·基礎(chǔ)

    氯碘羥喹對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠銅藍(lán)蛋白表達(dá)的影響

    陳艷麗,王改青,尹永峰,趙瑞

    目的研究金屬螯合劑氯碘羥喹(CQ)干預(yù)大鼠腦出血(ICH)后鐵超載狀態(tài)下銅藍(lán)蛋白(Cp)的表達(dá)。方法將48只Wistar大鼠隨機(jī)分為2組:對(duì)照組、干預(yù)組各24只,均采用立體定向技術(shù)向大鼠尾狀核區(qū)注射膠原酶制備ICH模型,制模成功后干預(yù)組給予氯碘羥喹50 mg/kg灌胃, 1次/12 h;對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃。2組在術(shù)后1、3、7、14 d不同時(shí)間點(diǎn)各取6只大鼠斷頭取腦,采用免疫組化染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Cp的表達(dá)。結(jié)果ICH模型制備后,隨著時(shí)間延長(zhǎng)2組Cp陽(yáng)性表達(dá)數(shù)顯著增加,在第7天達(dá)峰值;與對(duì)照組相比,干預(yù)組大鼠腦組織內(nèi)Cp在第1天無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),在3~14 d的表達(dá)均升高(P<0.05)。2組Cp mRNA表達(dá)水平高峰出現(xiàn)在第7天,且第3、7、14 d均高于第1天表達(dá)水平(P<0.05)。與對(duì)照組比較,干預(yù)組第3、7、14天Cp mRNA表達(dá)水平較高(P<0.05)。結(jié)論CQ通過(guò)調(diào)節(jié)腦出血后腦組織內(nèi)銅藍(lán)蛋白的表達(dá),可能加速腦組織內(nèi)鐵離子的清除從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

    氯碘羥喹;腦出血;銅藍(lán)蛋白;大鼠

    氯碘羥喹(clioquinol,CQ)是一種膜通透性強(qiáng),且能通過(guò)血腦屏障的2價(jià)金屬離子螯合劑。近年來(lái)研究表明CQ能調(diào)節(jié)腦內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài),對(duì)預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。腦出血后,隨著血紅蛋白的分解,局部鐵離子濃度持續(xù)升高,成為腦出血(ICH)繼發(fā)性腦損傷的重要因素之一[1]。鐵作為一種可變金屬,通過(guò)Fenton反應(yīng)可產(chǎn)生大量活性氧激發(fā)氧化壓力,引起腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化及DNA的破壞[2]。由于游離Fe2+參與活性氧的形成并在腦出血的損害機(jī)制中起主要作用,故對(duì)Fe2+的有效結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)可能預(yù)防或減輕鐵超載所致的繼發(fā)性損害[3]。目前關(guān)于腦出血后鐵離子代謝和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究很多,但腦出血后鐵超載的清除機(jī)制及腦內(nèi)鐵相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)CQ對(duì)亞鐵離子的螯合作用,動(dòng)態(tài)觀察銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin,Cp)表達(dá)的變化,進(jìn)一步明確ICH后鐵離子的清除機(jī)制,同時(shí)為腦出血的臨床治療開辟新思路,提供理論依據(jù)?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:3月齡雄性Wistar大鼠48只,體質(zhì)量250~300 g,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)和自由飲水,飼養(yǎng)室溫度20~25℃,濕度適中,由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按數(shù)字表隨機(jī)分為對(duì)照組和干預(yù)組各24只 ,每組造模術(shù)后,1、3、7、14 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取6只大鼠進(jìn)行觀測(cè)。(2)試劑與儀器:氯碘羥喹(武漢鴻信康精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)),江灣型腦立體定位儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司),微量注射器(上海高鴿工貿(mào)有限公司生產(chǎn)),膠原酶(上海杰美生物有限公司抗大鼠生產(chǎn)), 兔抗大鼠Cp抗體(博奧森生物公司生產(chǎn)),SABC免疫組化試劑盒(博士德生物試劑公司生產(chǎn)),DAB顯色劑(北京中杉金橋生物工程公司生產(chǎn)), PCR試劑盒及引物設(shè)計(jì)(大連寶生物工程有限公司生產(chǎn))。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 大鼠ICH模型制備:48只大鼠以4%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉,腦立體定位儀固定大鼠,頭正中約15 mm 縱行手術(shù)切口,暴露前囟,右側(cè)中線旁1.3 mm,前囟后3.2 mm為穿刺點(diǎn),用大頭針鉆透顱骨,微量注射器抽取含0.5 U膠原酶生理鹽水2 μl,迅速插入鉆好的孔內(nèi),向內(nèi)進(jìn)針5.8 mm。在2 min內(nèi)注射完畢,留針15 min后緩慢退針。拔針后無(wú)清亮液體自針道返流,大鼠蘇醒后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀視為造模成功,回籠飼養(yǎng)。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn):術(shù)后見明顯的肢體癱瘓,沿針道冠狀面切開腦組織可見基底節(jié)區(qū)血腫形成。各組術(shù)后各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)按參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分,最高分18分,最低分3分,分?jǐn)?shù)越低神經(jīng)功能障礙越重。干預(yù)組CQ 50 mg/kg灌胃,1次/12 h,對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃。2組造模后于1、3、7、14 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取6只大鼠腦組織進(jìn)行標(biāo)本制作。

    1.2.2 標(biāo)本制作:各組腦出血模型大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉后,斷頭取腦,以針眼為中心做冠狀切面,額部用錫箔紙包裹,置于-80℃冰箱保存用于PCR檢測(cè);余下標(biāo)本固定于4%多聚甲醛液72 h,石蠟包埋,連續(xù)切片,厚約4 μm,行免疫組化染色。

    1.2.3 免疫組化染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,用新鮮配制的3% H2O2液處理10 min,雙蒸水洗3次;切片浸入0.01 mol枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0),并電爐加熱至沸騰后2 min斷電。冷卻后0.1 mol PBS(pH 7.2~7.4)洗滌2次;滴加正常山羊血清封閉液,37℃ 20 min。滴加稀釋的一抗(最佳稀釋濃度 1∶300),-4℃過(guò)夜。0.1 mol PBS洗2 min×3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG,37℃ 20 min。0.1 mol PBS洗2 min×3次;滴加試劑SABC,37℃ 20 min。PBS洗5 min×4次;取1ml雙蒸水,加DAB顯色試劑盒中A、B、C試劑各1滴,混勻后加至切片上,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,觀察DAB顯色完全后用雙蒸水洗滌中止反應(yīng);蘇木素輕度復(fù)染。脫水、透明及封片。

    1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:取血腫周圍腦組織進(jìn)行RT-q PCR分析。采用Trizol試劑提取腦組織總RNA。采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,按操作說(shuō)明將組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;Cp引物上游序列:5'-GGCTCCAAGAGGAAGAAACAT-3',下游序列:3'-CCAGAAGCATAGTCCCAAACTG-5',擴(kuò)增片段長(zhǎng)132 bp;β-actin引物上游序列:5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3',下游序列:3'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-5',擴(kuò)增片段長(zhǎng)150 bp。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸45 s。循環(huán)40次。應(yīng)用ABI7300型擴(kuò)增儀圖像處理系統(tǒng)分析。

    1.3 檢測(cè)指標(biāo)

    1.3.1 免疫組化染色:普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞漿和胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片在40倍物鏡下選擇缺血半暗帶區(qū)相鄰而不重疊的5個(gè)視野區(qū),計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取平均值為測(cè)量值。

    1.3.2 PT-qPCR 分析:PCR擴(kuò)增結(jié)束后,記錄每個(gè)反應(yīng)管中熒光信號(hào)所達(dá)設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)即CT值。以β-action為內(nèi)參,△CT是目的基因(target基因)和內(nèi)參基因循環(huán)閾值的差值。△△CT=干預(yù)組(CTtarget-CTβ-action)-對(duì)照組(CTtarget-CTβ-action)。目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT方法計(jì)算。

    2 結(jié) 果

    2.1 免疫組化Cp的表達(dá) Cp陽(yáng)性表達(dá)主要位于腦出血周邊的膠質(zhì)細(xì)胞,較少表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖1、2見封3)。隨著時(shí)間延長(zhǎng),2組Cp表達(dá)逐漸增多,于第7天達(dá)高峰;第3、7、14 d時(shí),干預(yù)組的表達(dá)較對(duì)照組明顯增多(P<0.05)。見表1。

    表1 2組Cp陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)比較個(gè)/HP)

    注:與1 d比較,*P<0.05;與3 d比較,#P<0.05;與7 d比較,△P<0.05;與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較,☆P<0.052.2 Cp mRNA表達(dá)變化 2組Cp mRNA表達(dá)水平高峰均出現(xiàn)在第7天,與對(duì)照組相比,干預(yù)組大鼠腦組織內(nèi)CP mRNA 在第1天無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),第3、7、14天3個(gè)時(shí)點(diǎn)的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組,2組比較差異有在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表2 2組Cp mRNA的表達(dá)比較

    注:與1 d比較,*P<0.05;與3 d比較,#P<0.05;與7 d比較,△P<0.05;與對(duì)照組比較,☆P<0.05

    3 討 論

    ICH后繼發(fā)腦損傷與諸多因素有關(guān),其中紅細(xì)胞最終降解產(chǎn)物鐵離子在血腫周圍組織濃度異常起主要作用。其中二價(jià)鐵可能起關(guān)鍵作用;鐵螯合劑的使用可有效減少神經(jīng)元死亡,提高神經(jīng)功能恢復(fù)能力[5]。但最近研究顯示三價(jià)鐵螯合劑——去鐵胺并不能改善大鼠腦出血的預(yù)后[6]。

    Cp是重要的亞鐵氧化酶,主要在肝臟合成,可在任何鼠類大腦皮質(zhì)、基底神經(jīng)節(jié)、黑質(zhì)、海馬、小腦、胼胝體等表達(dá),主要存在于腦毛細(xì)血管床周圍膠質(zhì)細(xì)胞。最早認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的Fe2+首先被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上,然后經(jīng)Cp的作用氧化成Fe3+,進(jìn)而與細(xì)胞外的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合離開細(xì)胞膜[7],Cp的主要作用是通過(guò)亞鐵氧化酶的活性實(shí)現(xiàn)的,既能影響細(xì)胞鐵釋放也能影響細(xì)胞鐵攝取,在腦細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中, 后者比前者重要[8]。

    Mukhopadhyay等[9]認(rèn)為如果缺乏Cp可以驅(qū)使非鐵蛋白結(jié)合的鐵離子(包括抗血酸亞鐵、枸櫞酸或自由的Fe2+)進(jìn)入神經(jīng)元或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織細(xì)胞中。造成神經(jīng)元或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織細(xì)胞中鐵的過(guò)度沉積,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)形成自由基,引起一連串的病理變化導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。另外有研究顯示,應(yīng)用銅藍(lán)蛋白能改善腦出血大鼠的運(yùn)動(dòng)功能,促進(jìn)康復(fù),認(rèn)為在腦內(nèi)鐵超載的狀態(tài)下其主要發(fā)揮了鐵釋放的功能[10]。本次試驗(yàn)顯示在腦出血對(duì)照組中,Cp表達(dá)逐漸增多,在第7天達(dá)高峰,因此推斷可能在生理情況下,Cp主要發(fā)揮其鐵攝取功能,在病理狀態(tài)下,Cp表達(dá)增多,發(fā)揮其鐵釋放作用,促進(jìn)鐵的轉(zhuǎn)出,從而減輕鐵超載情況下鐵離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。

    有研究發(fā)現(xiàn),鐵螯合劑和缺氧能增加外周細(xì)胞Cp mRNA的表達(dá)[9]。另外有研究認(rèn)為Cp與鐵調(diào)素、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白共同對(duì)二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白(FP1)發(fā)揮其鐵轉(zhuǎn)出的功能起協(xié)同作用,共同調(diào)節(jié)鐵的利用與儲(chǔ)存,同時(shí)FP1介導(dǎo)的鐵轉(zhuǎn)出也依賴Cp的亞鐵氧化酶的活性[11~13]。本實(shí)驗(yàn)顯示在對(duì)照組中,第3、7、14天 Cp mRNA的表達(dá)逐漸增多。這與以上觀察一致,提示Cp的中樞調(diào)控可能和外周的調(diào)控機(jī)制類似。

    Cp作為一個(gè)急性期反應(yīng)蛋白,在臨床許多疾病的診斷檢測(cè)及預(yù)后判斷上應(yīng)用廣泛。根據(jù)目前研究已明確,Cp在腦內(nèi)鐵代謝紊亂過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,但是具體的機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

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    Influenceofclioquinolonexperimentalcerebralhemorrhageinratswithceruloplasminexpression

    CHENYanli,WANGGaiqing,YINYongfeng,ZHAORui.

    DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,ChinaCorrespondingauthor:WANGGaiqing,E-mail:wanggq08@126.com

    ObjectiveTo study the effect of clioquinol on the expression of ceruloplasmin in experimental cerebral hemorrhage (ICH) rats.Methods48 Wistar ratSwere randomly divided into 2 groups:control group and the intervention group with each group of 24 rats,using stereotactic injection of collagenase preparation ICH model to the caudate nucleuSof rats,after molding succesSthe intervention group were given clioquinol 50 mg / kg orally every 12 h; intragastric saline control group. From each of 2 groups,six ratSdecapitated at different time pointSafter 1,3,7,14 d,using immunohistochemical staining and real-time PCR detection of Cp.ResultsICH model after preparation ,two groupSwith time Cp positive expression waSsignificantly increased in the first seven daySof the peak; compared with the control group,the intervention group within the brain tissue of ratSin the first Cp day showed no significant difference (P>0.05),the expression at 3-14 d were higher (P<0.05). 2 groups' Cp mRNA expression levelSpeaked at 7 days,and the first 3,7,14 d were higher than the first day expression level (P<0.05). Compared with the control group,the intervention group 3,7,14 day Cp mRNA expression levelSwere higher (P<0.05).ConclusionCQ adjust cerebral hemorrhage by regulating the expression of ceruloplasmin in brain tissue,brain tissue may accelerate the removal of iron ionSand thuSplay a protective role in the brain.

    Chloroiodide quinoline; Cerebral hemorrhage; Ceruloplasmin; Rats

    山西省高??萍蓟痦?xiàng)目(No.20091113);山西醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金(No.01201115)

    030001 太原,山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

    王改青, E-mail:wanggq08@126.com

    10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.04.020

    2013-12-17)

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