應(yīng)用細(xì)菌磁顆粒real-timeRT-PCR檢測(cè)百合無癥病毒

鄧叢良，雙龍海，孫 寧,2，陳繼峰，魏海燕

(1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 101312； 2.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，南京 210096； 3.鄭州大學(xué)生物工程系，鄭州 450001)

應(yīng)用細(xì)菌磁顆粒real-timeRT-PCR檢測(cè)百合無癥病毒

鄧叢良1*，雙龍海1，孫 寧1,2，陳繼峰3，魏海燕1

(1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 101312； 2.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，南京 210096； 3.鄭州大學(xué)生物工程系，鄭州 450001)

為研究細(xì)菌磁顆粒分離提取不同樣本材料中的植物病毒RNA的效果，以及結(jié)合實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)LSV的靈敏性，選取感染病毒的西葫蘆葉片(CGMMV和SqMV)、大豆種子(BPMV)與百合葉片(LSV和ArMV)3種樣本材料，利用細(xì)菌磁顆粒分別提取這5種病毒RNA，與Trizol方法提取效果進(jìn)行比較，同時(shí)與Trizol real-time RT-PCR檢測(cè)LSV的靈敏度進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：BMPs方法能夠從3種植物樣本中提取病毒RNA，其檢測(cè)LSV的靈敏性與Trizol方法相當(dāng)。

細(xì)菌磁顆粒； 實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR； 靈敏度

納米材料是指在三維空間上至少有一維在0～100nm以內(nèi)或者以此為基本結(jié)構(gòu)單元而組成的材料，其具有小尺寸效應(yīng)，量子效應(yīng)，以及比表面積大等特性[1]。磁性納米顆粒是一種單磁疇的納米粒子，只有當(dāng)處于外部磁場(chǎng)中才會(huì)顯現(xiàn)出磁性，而且由于其尺寸小、比表面積大，能夠與靶標(biāo)物充分的結(jié)合，是用于固相分離的良好介質(zhì)[2]。細(xì)菌磁顆粒是一種分離自趨磁細(xì)菌的生物納米磁性顆粒，具有良好的生物相容性，表面主要由磷脂酰乙醇胺與磷脂酰甘油組成的磷脂膜包裹，表面分布有游離的氨基，能夠進(jìn)行通過物理吸附或借助化學(xué)偶聯(lián)劑與功能生物分子或藥物相連，可用于治療、診斷以及檢測(cè)等方面的應(yīng)用[3-6]。

植物病毒的檢測(cè)方法主要有鑒別寄主、血清學(xué)、電鏡觀察和分子生物學(xué)[7]。鑒別寄主方法雖然能夠?qū)Σ《靖腥局参锇Y狀更直觀的觀察，但很難對(duì)病毒的種屬進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定；DAS-ELISA是目前最為常用植物病毒檢測(cè)方法，但是這種方法依靠高靈敏性的血清，否則容易造成假陰性；電鏡觀察的制樣較為復(fù)雜，而且對(duì)病毒檢測(cè)來說，也容易受到電鏡視野的限制；分子生物學(xué)方法，主要是通過分子雜交、擴(kuò)增等技術(shù)對(duì)病毒核酸進(jìn)行分析，具有靈敏度高，特異性好的優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)于從復(fù)雜的植物樣本材料中提取病毒核酸，特別大多為RNA時(shí)，目前常用的提取技術(shù)，如利用有機(jī)溶劑(苯酚、氯仿等)抽提，具有耗時(shí)長、對(duì)操作人員身體易造成傷害等缺點(diǎn)。因此，必須發(fā)展新型的植物病毒提取技術(shù)。

近年來，采用化學(xué)合成的磁性納米顆粒在富集提取核酸方面，展現(xiàn)出非常巨大的優(yōu)勢(shì)。相比于化學(xué)合成的，細(xì)菌磁顆粒生物相容性與均一性更為優(yōu)良。因此，本文利用納米級(jí)細(xì)菌磁顆粒(bacterial magnetic particles，BMPs)比表面積大，分散性好，與病毒粒子非特異結(jié)合的特性，分別對(duì)感染黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)和南瓜花葉病毒(Squashmosaicvirus，SqMV)的西葫蘆葉片，感染菜豆莢斑駁病毒(Beanpodmottlevirus，BPMV)的大豆種子，感染百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)與南芥菜花葉病毒(Arabismosaicvirus,ArMV)的百合葉片這3種植物樣本材料進(jìn)行病毒核酸提取，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其對(duì)不同樣本材料提取的可靠性，同時(shí)對(duì)細(xì)菌磁顆粒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)LSV的靈敏性與常用的Trizol試劑方法進(jìn)行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料

攜帶CGMMV和SqMV的西葫蘆葉片、攜帶BPMV的大豆種子、攜帶LSV和ArMV的百合葉片以及相應(yīng)的陰性材料均由本實(shí)驗(yàn)室保存。Trizol試劑購自Invitrogen公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒均購自TaKaRa公司。細(xì)菌磁顆粒由鄭州大學(xué)陳繼峰博士提供。Real-time RT-PCR引物與探針見表1。

表1Real-timeRT-PCR引物與探針

Table1Primersandprobesforreal-timeRT-PCR

病毒Virus引物與探針Primerandprobe序列Sequence(5′?3′)CGMMV上游引物(Senseprimer)5′?GCGGGTTTTTACGCTTTCC?3′下游引物(Anti?senseprimer)5′?CGTATCCGTGGAGCTGAGAAG?3′探針(Probe)5′?FAM?ACGGTCCTGTGTTGAGGCCTATCTTCG?BHQ1?3′SqMV上游引物(Senseprimer)5′?CGCACCCATGTTATAAGAGGC?3′下游引物(Anti?senseprimer)SqMV?RP5′?ATAGCCAAAGCACAACCTGTATT?3′探針(Probe)5′?FAM?ACGCTGTGTTGCTTCTATCAATGTTCCA?BHQ1?3′BPMV上游引物(Senseprimer)5′?CTCTCCTTACATTAAATGTACAGTGTCTT?3′下游引物(Anti?senseprimer)5′?AACTTATTCCTGAATTTCTCCAAACT?3′探針(Probe)5′?FAM?TTCATAGCATTTGGAAATTTGGCTGATGA?BHQ1?3′LSV上游引物(Senseprimer)5′?CCCCTACGGGAGATTCTCAA?3′下游引物(Anti?senseprimer)5′?GGTTGCCATGTTGTTAGATACGA?3′探針(Probe)5′?FAM?TGACGAACTCTTCAAGATGAAGGTTGGC?BHQ1?3′ArMV上游引物(Senseprimer)5′?GCACTGTAGCCCTTGGAGATAATCC?3′下游引物(Anti?senseprimer)5′?CCCTCCAAATCCCACATTAACTTA?3′探針(Probe)5′?FAM?CTCACATGATAGCTTGTCATGGACTCC?TAMRA?3′

1.2 病毒RNA提取

稱取樣本材料各100mg，分別利用Trizol方法與BMPs方法提取病毒RNA。Trizol方法參考試劑說明進(jìn)行提取，稱取100mg樣本材料，將最后獲得的沉淀溶于500μL RNase Free water。BMPs方法參考文獻(xiàn)[5-6]，同樣稱取100mg樣本材料，加入1mL研磨緩沖液，離心后取100μL上清液，利用BMPs分離病毒粒子，加入50μL RNase free water，95 ℃孵育5 min，釋放病毒RNA。

1.3 BMPs real-time RT-PCR檢測(cè)

利用BMPs方法分別提取攜帶CGMMV和SqMV的西葫蘆葉片、攜帶BPMV的大豆種子以及攜帶LSV和ArMV的百合葉片的RNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，以Trizol方法提取陽性與陰性樣本RNA作為陽性與陰性對(duì)照。

1.4 靈敏性比較

分別取100mg含LSV的陰性與陽性百合葉片組織，加入1mL研磨緩沖液進(jìn)行研磨，離心，取20μL陽性材料上清液，利用陰性材料上清液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為10n(n=1、2、3……6)，分別利用BMPs方法與Trizol方法提取病毒RNA，通過real-time RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較兩者的靈敏性。

1.5 Real-time RT-PCR

在200μL離心管中加入5 μL RNA與1μL下游引物(10μmol/L)，70℃水浴10min，立即置于冰上2 min，而后依次加入2 μL 5×M-MLV Buffer，0.5 μL dNTP Mixture(10mmol/L)，0.25 μL M-MLV(200U/μL)，0.25 μL RNase Inhibitors(40U/μL)，補(bǔ)足無RNase free water至10μL，42 ℃溫育60min，70℃ 10min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，冰上放置2 min。

在一個(gè)潔凈的200μL離心管中依次加入2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10μL Premix ExTaq(2×)、上游引物(10μmol/L)和下游引物(10μmol/L)各0.4 μL、0.2 μL探針(10μmol/L)，補(bǔ)足去離子水至20μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 10s；95 ℃ 5 s，60℃ 20s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMPs real-time RT-PCR檢測(cè)

圖1為利用BMPs方法分別提取西葫蘆葉片組織(CGMMV與SqMV)、大豆種子(BPMV)與百合葉片(LSV與ArMV)3種不同樣本材料中的病毒RNA進(jìn)行real-time RT-PCR檢測(cè)的擴(kuò)增曲線。從相對(duì)熒光強(qiáng)度(ΔRn)對(duì)循環(huán)數(shù)(cycle)的擴(kuò)增曲線可以看到，BMPs方法能夠準(zhǔn)確的分別從3種樣本材料中提取出病毒RNA，隨循環(huán)數(shù)的增大，ΔRn升高，均擴(kuò)增曲線，而陰性材料的均有沒有擴(kuò)增，與Trizol real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，檢測(cè)CT值見表2。

圖1 Real-time RT-PCR檢測(cè)Fig.1 Real-time RT-PCR detection

表2Real-timeRT-PCR檢測(cè)CT

Table2CTvaluesofreal-timeRT-PCRdetection

樣本材料Sample病毒VirusBMPsreal?timeRT?PCR(CT)陽性Positive陰性NegativeTrizolreal?timeRT?PCR(CT)陽性Positive陰性Negative西葫蘆葉片ZucchinileavesCGMMVSqMV22．6520．46404020．7817．954040大豆種子SoybeanseedsBPMV36．574032．5240百合葉片LilyleavesLSVArMV29．2335．35404027．8534．914040

2.2 BMPs real-time RT-PCR檢測(cè)LSV靈敏性

BMPs real-time RT-PCR檢測(cè)LSV如圖2，CT值隨稀釋梯度的增大而增大，當(dāng)稀釋梯度為10-6時(shí)，擴(kuò)增沒結(jié)果沒有超過閾值，其CT值為40，各梯度檢測(cè)CT值依次為22.65、25.31、28.48、31.45、34.68、40，其陰性對(duì)照CT為40。結(jié)果表明：BMPs real-time RT-PCR檢測(cè)LSV的稀釋限點(diǎn)為10-5。

2.3 Trizol real-time RT-PCR檢測(cè)LSV靈敏性

圖3為Trizol real-time RT-PCR檢測(cè)LSV靈敏性結(jié)果。從圖中可以看到，隨著陽性材料稀釋倍數(shù)的增大，檢測(cè)CT值依次增大，當(dāng)稀釋梯度為10-6時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度(ΔRn)沒有超過閾值，其CT值依次為20.97、23.27、28.66、33.54、37.77、40，陰性對(duì)照曲線沒有擴(kuò)增(CT=40)。結(jié)果表明：Trizol real-time RT-PCR檢測(cè)LSV稀釋限點(diǎn)為10-5。

圖2 BMPs-based real-time RT-PCR檢測(cè)靈敏性Fig.2 Sensitivity of BMPs-based real-time RT-PCR detection

圖3 Trizol real-time RT-PCR檢測(cè)靈敏性Fig.3 Sensitivity of Trizol-based real-time RT-PCR detection

3 討論

本研究利用細(xì)菌磁顆粒(BMPs)提取了多種樣本材料中的植物病毒RNA，并結(jié)合real-time RT-PCR技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行了檢測(cè)。對(duì)于不同的樣本材料(西葫蘆葉片、大豆種子和百合葉片)均具有很好的提取和檢測(cè)效果。但是，BMPs方法提取的病毒核酸的濃度要低于Trizol試劑(real-timeRT-PCR的CT)，尤其是對(duì)于大豆種子材料，其CT值要高大約3個(gè)CT值，這表明其核酸濃度要低近10倍。這可能是由于大豆種子豐富的蛋白質(zhì)占據(jù)了病毒粒子的吸附位點(diǎn)，造成病毒核的提取量比較低。同時(shí)，相比于大豆種子材料，葉片材料病毒核酸的提取效果與Trizol試劑相差不多。

此外，對(duì)于檢測(cè)百合葉片LSV的靈敏性進(jìn)行了測(cè)定，并與Trizol real-time RT-PCR檢測(cè)百合葉片LSV的靈敏性相比，具有相同的檢測(cè)靈敏性，表明該檢測(cè)方法具有很好的靈敏性。

細(xì)菌磁顆粒(BMPs)具有良好的生物相容性，同時(shí)由于表面分布有游離的氨基，造成粒子之間相互排斥，在水溶液中分散性好，當(dāng)與樣本溶液混合時(shí)，能夠與病毒粒子發(fā)生相互作用，利用外加磁場(chǎng)，將BMPs與病毒的復(fù)合物從樣本溶液中分離出來。本實(shí)驗(yàn)室通過研究建立了提取植物病毒RNA的BMPs方法，并將此方法與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于檢測(cè)多種植物病毒，此方法具有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1)特異性好，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)具有靈敏性好，特異性高；2)操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短；3)不需要使用有機(jī)溶劑，避免對(duì)操作人員健康帶來損傷。

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Applicationofbacterialmagneticparticle-basedreal-timeRT-PCRfordetectingLilysymptomlessvirus

Deng Congliang1, Shuang Longhai1, Sun Ning1,2, Chen Jifeng3，Wei Haiyan1

(1.TestingCenterofBeijingInspectionandQuarantineBureau,Beijing101312,China; 2.CollegeofBiologicalandMedicalEngineering,SoutheastUniversity,Nanjing210096,China; 3.DepartmentofBioengineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

To evaluate the effectiveness of the BMPs-based method,which was used for extracting plant viral RNAs from different samples,cucurbita pepo leaves (infected by CGMMV or SqMV),soybean seeds (infected by BPMV),and lily leaves (infected by LSV or ArMV) were extracted by BMPs-based real-time RT-PCR.The effectiveness and sensitivity of BMPs-based real-time RT-PCR were compared with that of the Trizol-based method.The results indicated that the BMPs-based method was effective for separating and extracting plant viral RNAs,and the sensitivity for detecting LSV using BMPs-based real-time RT-PCR equals that of the Trizol-based real-time RT-PCR.

bacterial magnetic particles (BMPs); real time RT-PCR; sensitivity

2013-02-22

：2013-10-16

公益性行業(yè)(質(zhì)檢)科研專項(xiàng)(201110035)；國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010IK179)

S 432.41

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.018

* 通信作者 E-mail: dengcl@bjciq.gov.cn