珍珠母鎮(zhèn)靜催眠作用及其不同炮制品對(duì)小鼠腦內(nèi)5-羥色胺濃度的影響

劉 冬，代婷婷，查榮博，曲 鵬，李 影,2，杜 鶴，趙思遠(yuǎn)，宋 利，張 輝*，孫佳明*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

珍珠母(Margaritiferaconcha)是常用中藥材，為蚌科動(dòng)物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)、褶紋冠蚌Cristariaplicata(Leach)或珍珠貝科動(dòng)物馬氏珍珠貝Pteriamartensii(Dunker)的貝殼，具有平肝，潛陽(yáng)，定驚，止血的功效，用于治療頭眩、耳鳴、心悸失眠等癥[1]。主要的成分為CaCO3，含量在90%以上，有機(jī)質(zhì)含量3.5%左右，另含少量的鎂、鐵離子、氨基酸。為探查珍珠母不同炮制品的鎮(zhèn)靜催眠作用及作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同炮制品對(duì)氯苯丙氨酸造模小鼠腦內(nèi)5-HT濃度的影響,為進(jìn)一步研究珍珠母的炮制機(jī)理提供了具體的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 雄性健康實(shí)驗(yàn)級(jí)小鼠60只，體質(zhì)量(20±2) g。由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

1.2 藥物 珍珠母烘烤品和超微粉為本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 試劑與儀器 對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)，購(gòu)自Sigma公司；安定注射液，5-HT酶聯(lián)反應(yīng)(ELISA)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程有限公司。酶標(biāo)儀(日本TARAKA公司)；CO2培養(yǎng)箱，METTLER TOLEDO電子天平(SARTORIUS AG)；CR20B2型冷凍高速離心機(jī)(日本日立)；GVDV300三頻恒溫超聲波清洗器(江蘇昆山超美)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠自主活動(dòng)次數(shù)的測(cè)定 將60只雄性小鼠隨機(jī)分6組，每組10只,空白組、模型組、陽(yáng)性組、珍珠母生品組、烘烤品組和超微粉組。模型組按小鼠30 mg/100 g體質(zhì)量用量腹腔注射PCPA[2]，空白組腹腔注射相同體積的生理鹽水。腹腔注射30 h后，小鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，模型成功[3]。樣品按生藥量218.75 g/kg體質(zhì)量給藥，空白組和模型組給同體積生理鹽水，陽(yáng)性組為安定劑量按0.04 mg/20 g。1次/d，連續(xù)給藥7 d。

2.2 珍珠母不同炮品對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響 給藥1周后，禁食12 h，將小鼠放入自主活動(dòng)儀中適應(yīng)環(huán)境2 min后開(kāi)始觀察并記錄5 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)次數(shù)。將各組小鼠給藥前后活動(dòng)次數(shù)及差值與空白對(duì)照組比較，作t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理，并用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因子方差分析，比較各給藥劑量的鎮(zhèn)靜活性，并記錄腦及腦干重量[4]。

2.3 小鼠腦干內(nèi)5-HT濃度的測(cè)定

2.3.1 樣品的采集與處理 末次給藥12 h后，記錄完小鼠自主活動(dòng)，將小鼠眼球取血,低溫2 000～3 000 r/min離心20 min，取上清，暫保存在-80 ℃冰箱，待測(cè)。同時(shí)在冰盤(pán)上取出腦及腦干并稱重。

2.3.2 5-HT標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并用小鼠5-HT試劑盒進(jìn)行濃度檢測(cè),以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及其對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y=0.003 1X+0.056 2(R2=0.999 2)表明5-HT在62.5～1 000 nmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量濃度為62.5 nmol/L。

2.3.3 小鼠腦內(nèi)5-HT濃度的測(cè)定 根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,用純化的5-HT抗體包被微孔板，向各微孔中依次加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉素-HRP、抗5-HT抗體，然后加入洗滌液用洗板機(jī)經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加入顯色劑放入CO2培養(yǎng)箱37 ℃避光顯色10 min，然后加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各樣品的濃度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠自主活動(dòng)及腦系數(shù)的比較 由表1可知,小鼠的自主活動(dòng)模型組較其他組活動(dòng)的次數(shù)平均次數(shù)多，其中陽(yáng)性對(duì)照組、超微粉組、與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，烘烤組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此超微粉組、烘烤組對(duì)PCPA睡眠模型小鼠有助催眠作用,但生品組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由表可以看出在給藥組中超微粉組小鼠平均活動(dòng)次數(shù)最低，提示超微粉比其他給藥組鎮(zhèn)靜催眠作用強(qiáng)。通過(guò)對(duì)PCPA睡眠模型小鼠腦及腦干系數(shù)比較可知，藥物對(duì)小鼠腦干重量系數(shù)基本沒(méi)有影響(P>0.05)，但通過(guò)觀察腦系數(shù)可知模型組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示PCPA藥物改變了小鼠腦重量系數(shù)。同時(shí)超微粉組、陽(yáng)性組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示藥物可能對(duì)PCPA睡眠模型小鼠腦重量系數(shù)有影響，這有可能是藥物改變了PCPA睡眠模型小鼠除腦干外的其他腦組織生理指標(biāo)。

表1 各組小鼠的自發(fā)活動(dòng)的比較

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 珍珠母不同炮制品對(duì)小鼠腦內(nèi)5-HT濃度的影響 由表2可知，珍珠母生品組、烘烤品組、超微粉組都可以增加小鼠腦干中的5-HT含量，有助催眠作用。與模型組對(duì)照比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠腦干中5-HT濃度比較 ng/h

注：與模型組比較，#P<0.05。

4 討論

眾所周知，伴隨著越來(lái)越快的生活節(jié)奏，各種各樣的社會(huì)生存壓力不斷增加從而導(dǎo)致了更多的人在睡覺(jué)時(shí)出現(xiàn)障礙，越來(lái)越多的人出現(xiàn)了睡眠障礙，尤其是失眠。因而越來(lái)越多的研究者為了更好地控制睡眠、緩解失眠而致力于睡眠研究。有研究表明睡眠與大腦內(nèi)許多神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)，5-HT作為腦內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其參與了睡眠的發(fā)生和維持。腦內(nèi)5-HT能神經(jīng)元的細(xì)胞體主要位于中縫核，Mansari等[5]發(fā)現(xiàn)分別破壞中縫核頭部和尾部的5-HT能神經(jīng)元,結(jié)果是不同的，前者引起快眼睡眠的減少，后者引起慢眼睡眠的減少，并進(jìn)而認(rèn)為中縫核頭部的5-HT能神經(jīng)元與快眼睡眠的產(chǎn)生和維持有關(guān)[6]。PCPA是小鼠腦內(nèi)5-HT合成酶——色氨酸羥化酶的抑制劑,能夠阻斷腦內(nèi)5-HT的合成，使5-HT濃度降低，是導(dǎo)致小鼠睡眠時(shí)間縮短的主要原因[7]。珍珠母有效組分對(duì)睡眠的影響同樣和腦內(nèi)5-HT合成酶抑制劑PCPA相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究表明，珍珠母有效組分使5-HT濃度增加[8]。

珍珠母的傳統(tǒng)炮制方法為將貝殼用堿水煮過(guò)，漂凈，刮去外層黑皮，煅至松脆即成。珍珠母作為中醫(yī)臨床的常用中藥，具有平肝潛陽(yáng)，定驚明目的功效，用于頭痛眩暈，煩躁失眠，肝熱目赤，肝虛目昏，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。本研究表明，珍珠母具有一定的鎮(zhèn)靜催眠作用，而珍珠母的生品，烘烤品和超微粉均可增加小鼠腦內(nèi)5-HT濃度,可能是其鎮(zhèn)靜催眠作用的機(jī)制之一。而且從小鼠自主活動(dòng)、腦系數(shù)及腦內(nèi)5-HT濃度比較分析結(jié)果中可以看出超微粉鎮(zhèn)靜安眠功效最大，而烘烤品、生品的依次降低。

依據(jù)肽鍵熱振蕩理論，大分子蛋白質(zhì)等成分經(jīng)烘烤后，通過(guò)分子中肽鍵熱振蕩作用，發(fā)生物理結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致了活性發(fā)生相應(yīng)的改變。其中烘烤品的功效優(yōu)于生品，說(shuō)明珍珠母烘烤品在炮制加熱過(guò)程中，組織疏松，有效成分易于溶出，但某些大分子蛋白或肽類(lèi)成分易受到破壞，導(dǎo)致活性提高不大；而超微粉品未受到熱炮制產(chǎn)生大分子類(lèi)成分的破壞，僅是物理變化促使蛋白質(zhì)等有效成分的溶出，故而活性最強(qiáng)。以上結(jié)果提示超微粉碎可以作為貝殼類(lèi)藥材的傳統(tǒng)熱炮制方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。

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