成年大鯢實驗室飼養(yǎng)及蛻皮和體表粘液收集方法

許永杰，李學英, 王大忠，羅蔓莉，耿娜娜，鄭 翔

(1.遵義醫(yī)學院 細胞生物學與遺傳學教研室，貴州 遵義 563099； 2.遵義師范學院，貴州 遵義 563002)

大鯢(Andriasdavidianus)，俗稱娃娃魚，屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，我國主要分布在貴州、陜西、湖南等地。其被譽為“活化石”，具有很高的食用及藥用價值，被國家列為Ⅱ類重點保護動物。王利峰等發(fā)現(xiàn)大鯢皮膚分泌粘液中含有抗菌肽，能夠在濃度為12～22μg /mL時具有對革蘭陰性和革蘭陽性細菌的抑菌作用[1]。Guo等報道大鯢粘液提取物具有磷酯酶A2活性，大鯢的粘液和蛻皮是提取DNA的優(yōu)質材料[2-3]。從粘液和蛻皮中提取DNA與從肝臟等中提取DNA相比，明顯具有非損傷性的優(yōu)勢[4]。非損傷性取材或其他科學研究都需要將大鯢人工飼養(yǎng)一段時間，然而實驗室大多不具備養(yǎng)殖場所具備的水源、食物、氣溫等條件，因此提供實驗室成功飼養(yǎng)大鯢的數(shù)據(jù)和資料顯得很有必要。鑒于此，本文提供了1年實驗室成功飼養(yǎng)大鯢和用于大鯢皮膚粘液和蛻皮收集的基本數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 魚缸(長120 cm，寬45 cm，高30 cm)，BS110S型電子天平(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，紅水溫度計(衡水布萊迪儀表有限公司)，F(xiàn)P-1006型增氧機(西安廣騰電子科技有限公司)，YSD-4G型藥理、生理實驗多用儀(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司)，空調(格力電器股份公司)。

1.2 實驗動物 人工養(yǎng)殖第2代大鯢1條，全長94 cm，體重5.75 kg，雌性，購于貴定錦江娃娃魚有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鯢飼養(yǎng)方法 模擬野生大鯢陰暗的生長環(huán)境，用黑紙將玻璃魚缸全部封閉，魚缸上面搭蓋黑色遮蓋物，使魚缸內不見光線。將大鯢小心放進魚缸內，避免刮擦傷。飼養(yǎng)過程中將大鯢放于安靜的實驗室。養(yǎng)殖用水為在空氣中靜置3 d的自來水，pH值為6.65～7.16，增氧機增加溶氧量，連續(xù)不斷供氧, 根據(jù)天氣變化的情況和水質的混濁度，2～5 d換水一次。根據(jù)大鯢進食的情況，2～5d在19∶00～20∶00投餌一次。投飼食物為鯉魚，切為魚塊，攝食量以大鯢8 min未再進食為準，即所投最后魚塊如果大鯢在8 min內未被攝食，計算攝食量為最后一塊之前所攝食魚塊重量。觀察記錄水溫、水質、增氧情況和大鯢食量、精神狀態(tài)和排便情況。

1.3.2 電刺激法和背部直接刮擦法 分別以10～50 V電壓多位點刺激大鯢背部皮膚8 min，刺激后10 min收集大鯢粘液，其刺激的時間點分別為第1、3、6、8、16天。背部直接刮擦法為滅菌朔料三角板在大鯢背部直接稍用力刮擦。

2 結果

2.1 大鯢生長狀況 在2011年8～9月和10～11月溫度在20～24 ℃，大鯢活動量大，反應敏捷，攝食次數(shù)分別為14次和16次，總攝食量分別為480.42 g和773.38 g；12月溫度在7～14 ℃，大鯢活動量小，反應遲鈍，攝食次數(shù)為5次，總攝食量為148.56 g；2012年3～4月溫度在7～24 ℃，隨溫度升高大鯢活動量逐漸增強，攝食次數(shù)為14次，總攝食量為363.50 g；5～6月溫度在20～24 ℃，大鯢活動性強，攝食次數(shù)為15次，總攝食量為511.12 g；7～8月溫度為22～24 ℃，大鯢活動性強，攝食次數(shù)為14次，總攝食量為403.72 g(見圖1)。在適宜溫度范圍(15～22℃)內大鯢攝食反應靈敏，主動攝食，攝食量大；在低溫范圍內(7～11 ℃)大鯢攝食反應遲鈍，不主動攝食，攝食量小。在7～11 ℃大鯢活動量小，靜止在水缸中，長時間不游動；在12～14 ℃大鯢活動量稍有增加，在水中緩慢游動；在15～22 ℃活動性最強，在水中快速游動。大鯢在水溫為15～22 ℃攝食量大和活動度高，反應敏捷，生長狀況良好。

2.2 物理刺激法觀察記錄大鯢反應

2.2.1 電刺激法觀察大鯢反應 在一個月內進行電刺激實驗，記錄電壓幅度、時間及大鯢反應等參數(shù)并進行統(tǒng)計分析(見圖2)。給予10 V電刺激，大鯢表現(xiàn)出躁動不安，皮膚大量脫落，收集到蛻皮3.69 g；給予20～40 V電刺激，大鯢反應逐漸更加強烈，躁動越來越強，背部弓起，發(fā)怒，有攻擊行為，僅收集到少量蛻皮或未收集到蛻皮；給予50 V電刺激，大鯢發(fā)怒，處于高度防御和進攻狀態(tài)，尾部不斷擊打魚缸四壁，產生大量蛻皮。在10～40 V電壓均未收集到粘液，在50 V電壓，大鯢處于高度激惹狀態(tài)，有少量粘液0.2 g。

2.2.2 背部直接刮擦法觀察大鯢反應 用滅菌塑料三角板在大鯢背部稍用力來回刮，觀察大鯢反應。刮1 min后，見大鯢皮膚分泌粘液，開始為稀薄透明狀，容易從刮板上取下，隨后為粘稠白色粘液，不易從刮板取下。共收集到77.76 g粘液。

2.2.3 電鉆噪音刺激后大鯢反應 大鯢在從生態(tài)飼養(yǎng)環(huán)境移到實驗室中的前半月時間中，躁動，不進食，且在電鉆噪音下活動度加大，且分泌了大量的粘液和蛻皮。經過1個月的時間，即適應了實驗室環(huán)境。再以電鉆噪音刺激，大鯢無反應。

注：圖中精神狀態(tài)、水質和增氧得分1，2，3分別表示程度的低，中，高。圖1 實驗室飼養(yǎng)大鯢生長狀況

注：圖中粘液量和蛻皮量數(shù)值均擴大10倍，以便于趨勢分析。圖2 電刺激大鯢各項數(shù)據(jù)

3 討論

大鯢生態(tài)養(yǎng)殖技術日臻成熟，養(yǎng)殖業(yè)呈現(xiàn)良好發(fā)展態(tài)勢，生態(tài)飼養(yǎng)數(shù)據(jù)已有報道，但大鯢的實驗室飼養(yǎng)數(shù)據(jù)，未見報道。沈猷慧等(2000)報道大鯢喜陰暗怕陽光、喜安靜怕噪音、喜清水怕渾水、喜涼爽怕炎熱和鯢苗喜群居、成鯢喜獨居等習性[5]。實驗室飼養(yǎng)大鯢，大鯢在7～11℃攝食量小，反應遲鈍，活動度弱；水溫在15～22 ℃時攝食量大，活動度高，反應敏捷，適宜大鯢生長。同沈猷慧等對野生大鯢生存條件的報道相一致。

目前，對大鯢產品的開發(fā)均是宰殺后對其表皮、肌肉、脂肪等進行加工利用，這樣粗放型的利用方法不能充分發(fā)掘大鯢資源的價值。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，大鯢資源的精深加工利用已經成為一個關系大鯢產業(yè)能否持續(xù)健康發(fā)展的緊迫課題。針對大鯢體內富含多種天然生物活性物質，對大鯢活性成分進行提取、研發(fā)具有高附加值的下游產品如食品、化妝品、保健品、藥品等，可以實現(xiàn)人工養(yǎng)殖大鯢產品的產業(yè)化、市場化和國際化。大鯢皮膚粘液中含有抗菌肽、抗氧化和增強機體免疫等活性物質[1,6]，并且已經開發(fā)出“湘鯢”等護膚品和“仙鯢蔻”系列牙膏產品。如果從剝離的兩棲類皮膚中直接獲得抗菌肽必須處死動物，不利于資源的可持續(xù)利用。因此，探索非損傷性、可重復采集的方式來收集大鯢皮膚粘液進行抗菌肽研究是必要的。誘導刺激粘液的方法主要有：微生物誘導法、化學物質誘導法(去甲腎上腺素)、物理刺激法(電流刺激和按摩)[7]。Asoodeh等用4～6 V電壓電刺激沼澤蛙，收集蛙類皮膚粘液[8]，而楊國華等發(fā)現(xiàn)中國大鯢表面神經丘杯狀托的缺失[9]，故此本課題組推測中國大鯢皮膚表面神經丘感受刺激的閾值可能較高，選擇了10～50 V電壓進行階梯式電刺激以收集皮膚和體表粘液。結果發(fā)現(xiàn)，除第1次電刺激(10V)的蛻皮量較大(3.69 g)外，之后雖然增加了刺激電壓，蛻皮量未增加，反而大大下降，也未收集到體表粘液；當電壓從20V增至50V時，蛻皮量有一定程度的提高，但仍然低于第1次刺激，體表僅有少量粘液分泌。此時大鯢已經處于極度激怒狀態(tài)，為避免過高電壓對大鯢機體可能造成的損傷而沒有進一步進行實驗。可見，電刺激對于大鯢皮膚及其粘液的收集不是一種適宜的方法。直接刮擦大鯢背部，觀察到大量粘液分泌，其作用可能相當于直接按摩大鯢背部粘液腺和顆粒腺，促使粘液大量分泌，但也有可能是大鯢的防御反應。其次，此法操作相對簡單，可以避免微生物法中需要選擇菌種和掌握接種菌量的弊端。同時，用直接刮擦法進行試驗期間，大鯢活動度和攝食量無明顯變化，生存狀況良好?？梢娛且环N較好的實現(xiàn)持續(xù)收集大鯢皮膚粘液的有效方法。此外，大鯢飼養(yǎng)過程中，還觀察到電鉆噪音在首次對大鯢進行干擾時，也使大鯢皮膚產生大量的粘液。但再次干擾時未見此現(xiàn)象?？梢?，成年大鯢對聲音和電刺激均有一定的耐受，對其生存無太大影響。

綜上所述，通過模擬大鯢生境，可以在實驗室內進行大鯢的長期飼養(yǎng)，便于對其取材以進行科學研究。對于體表粘液的收集來說，直接刮擦法是一種簡單、易行、有效的方法。

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